CN102965320A - 一种防治植物真菌病害的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种防治植物真菌病害、促进植物生长的高效枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）。本发明所述枯草芽孢杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.6788。本发明涉及的枯草芽孢杆菌具有较高的抑制植物病原真菌生长的能力，且具有较高的遗传稳定性，不污染环境，生态安全，能够广泛应用到植物病原致病真菌，特别是腐霉病菌(Pythiumaphanidermatum)、镰刀菌(Fusarium)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)和灰霉病菌(Botrytiscinerea)的防治。该高效枯草芽孢杆菌单独使用或与其它植物生长所需要的有机、无机营养成分一起使用,制备成生物复合肥料具有显著的抗重茬，抗早衰，防治死苗烂根，色正果大，增加提高产量和改良品质量的作用。

Description

一种防治植物真菌病害的枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物和生物肥料领域，特别是涉及枯草芽孢杆菌，具体而言，本发明涉及一种防治植物真菌病害的枯草芽孢杆菌及其应用。

背景技术

植物病害是影响农业生产的主要因素之一，一直以来化学农药防治病虫害对农业生产起了十分重要的作用。 但由于化学农药的大量使用，带来很多负面作用，如污染生态环境、危害人畜、产生抗药性，伤害非靶标生物，农药残留等问题，严重影响了人类健康和生态平衡等一系列问题，这促使人们探寻对人类和环境无害并具良好防治效果的新型植物病虫害防治策略。随着全球范围内研制开发高效低毒生防制剂的兴起，开发微生物制剂来控制有害生物，已经成为替代或减少化学农药使用的新型防治措施之一，受到世界各国学者、企业和消费者的重视。利用有益微生物防治植物病害始于1921年的Hartely利用真菌防治猝倒病（王晓宇，中国农业科学，2011）。到目前植物病害生防微生物已涉及真菌、放线菌、细菌乃至病毒(噬菌体)等种群，而利用拮抗微生物来防治植物病害成为生物防治的一个主策略，并已显示出良好的应用前景。

目前，应用较多的生防细菌是促进植物生长的根际细菌(plant growth promoting rhizobacteria, PGPR)，其对植物的有益作用主要表现在防病和刺激生长两个方面。对病害的防治机制包括拮抗、寄生、竞争、捕食等多种方式, 产生的抗生素是拮抗作用的重要作用方式之一。植物促生细菌通过植于根系和优先占领根系或抑制根上有害细菌或真菌的生长从而达到防控作用。其中枯草芽孢杆菌是一种嗜温性的好氧产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，能够产生耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂的内生孢子，其抑制植物病原菌的范围很广，包括根部病害、枝干病害、叶、花部病害和收获后果品病害，在土壤和植物的表面普遍存在，对人畜无毒无害，不污染环境，是一种理想的生防微生物。枯草芽孢杆菌通过成功定殖至植物根际、体表或体内，与病原菌竞争植物周围的营养，分泌抗菌物质以抑制病原菌生长，同时诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，从而达到生防的目的。由于它生长速度快、营养需求简单，在植物的表面易于存活、定殖与繁殖，而且生产枯草芽孢杆菌制剂的工艺简单，制剂稳定，施用方便，储存期长，因此是一种理想的生防微生物。

据报道，枯草芽孢杆菌对多种由丝状植物病原真菌所引起的植物病害具有良好的防治作用，在粮食作物中，由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引起的纹枯病、由稻梨孢（Magnaporthe grisea）引起的稻瘟病、由禾白粉菌（Erysiphe raminis）引起的禾谷类白粉病等；蔬菜中由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的茄科和葫芦科灰霉病、由尖镰孢菌（Fusarium oxysporum）引起的黄瓜枯萎病、由瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）引起的根腐病以及由疫霉属(Phytophthora)引起的疫病和核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)等引起的蔬菜病害；枯草芽孢杆菌还可以控制采后水果的多种疫病如草莓灰霉病（Botrytis cinerea）和白粉病（Erysiphe raminis），香蕉枯萎病（Fusarium oxysporum）等；此外，枯草芽孢杆菌防治林果病害也有较好的效果，如由聚生小穴壳菌(Dothiorella grearia)引起的杨树溃疡病，以及由胶孢炭疽（Colletotrichum gloespor iodes）引起的炭疽病、由苹果柱盘孢霉（Cylindrosporium pomi）引起的黑点病等。可知，枯草芽孢杆菌现已成为一种理想的生防细菌， 筛选对病原真菌有高效抑制作用的菌株是防治植物病害的有效方法之一。

但是，目前已知对植物真菌病害具有防治作用的枯草芽孢杆菌大多效果不佳、作用对象比较单一、易受自然环境影响、竞争存活能力有限等弊端（程爱丽, 唐文华,王益民．植物病理学报, 1996）。出乎意外地，本申请发明人经过多年悉心研究，从植物根际土壤中分离到一株新的枯草芽孢杆菌菌株，该菌株对多种植物真菌病害具有良好的防治效果，遗传稳定，且不容易产生抗性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的枯草芽孢杆菌的菌株，所述菌株对多种植物病害的防治有明显效果，且具有较高的遗传稳定性。

本发明所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)已经于2012年11月7日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6788。

进一步地，本发明提供上述枯草芽孢杆菌防治植物真菌病害的用途。

优选地，导致所述植物真菌病害的植物真菌病原体为腐霉病菌(Pythium)、镰刀菌(Fusarium)、核盘菌（Sclerotinia）和灰霉病菌（Botrytis）。

更优选地，所述植物真菌病害为黄瓜腐霉病菌(Pythium aphanidermatum)、甜瓜镰刀菌(Fusarium roseum )、油菜核盘菌 (Sclerotinia sclerotiorum)、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）。

进一步地，本发明的枯草芽孢杆菌可以制成微生物菌剂，即将所述菌株在PDA培养液（培养液组成为：马铃薯200g/L，葡萄糖20 g/L，pH为8）中培养，培养温度为27 ℃，培养天数为5天，转速为200 rpm，培养液过滤后，将菌液细胞数调节为10⁹个/mL，即制得本发明的枯草芽孢杆菌微生物菌剂。

进一步地，本发明的枯草芽孢杆菌可以制成生物肥，即将枯草芽孢杆菌孢子液（孢子浓度为1x10⁸cfu/mL）与无机肥料、有机肥料相混合制得，三者的重量比为1：6：13；所述无机肥料选自氮肥、磷肥和钾肥，所述氮肥为尿素或硫酸铵，所述磷肥为磷酸铵或磷酸钙，所述钾肥为硫酸钾或氯化钾；所述有机肥料为堆肥或沼气肥。

进一步地，本发明的枯草芽孢杆菌可以制成如下生物肥，即将枯草芽孢杆菌孢子液（孢子浓度为1x10⁸cfu/mL）与微肥、有机肥料相混合制得，三者的重量比为1：3：6；所述微肥选自碳酸锰锌、硼镁肥、钼酸钠、螯合态铜或磷酸铵铁中的一种或多种；所述有机肥料为堆肥或沼气肥。

上述生物肥的制备是将原料按比例充分搅拌，混合均匀，随后用传送带经粉碎后送入滚筒造粒机，在滚筒内喷射蒸汽使物料加热至20-40℃，通过滚筒不停转动使物料成球状颗粒。将成球颗粒送入烘干滚筒，输入热风烘干。将烘干的成球经冷却、筛分、罐装或袋装成成品。

 本发明所提供的枯草芽孢杆菌是从植物根际土壤中分离得到的，其实验室命名为菌株MSB1201，已经于2012年11月7日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6788。

菌株MSB1201在LB固体培养基（培养基组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L）上菌落呈圆形，边缘不整齐，乳白色，不透明，表面粗糙有褶皱，无光泽。培养至30h，菌体均以休眠体芽孢的形式存在。菌落呈浅黄色。显微观察菌体为单细胞，杆状，单生或双生，有时成链状。革兰氏染色阳性，芽孢椭圆形。利用生理生化指标对其进行鉴定后发现，其淀粉水解、明胶水解、柠檬酸盐利用、6.5% NaCl、V-P测定等呈阳性；接触酶、卵黄反应、吲哚产生、丙酸盐的利用等呈阴性。然后利用分子生物学手段对采用16S rDNA基因特异引物对16S rDNA进行扩增，将扩增产物回收并测序，将测序结果进行Blast分析，结果发现与菌株MSB1201高度同源的菌株均是芽孢杆菌，同源性98%以上，并结合生理生化特征，鉴定其为枯草芽孢杆菌。

本发明的效果

1、在平板对峙法中，本发明的枯草芽孢杆菌对腐霉病菌、镰刀菌、核盘菌和灰霉病菌四类植物病原真菌具有良好的抑制效果，说明本发明菌株具有较广的抑菌谱；

2、本发明的枯草芽孢杆菌转40代后对腐霉病菌、镰刀菌、核盘菌和灰霉病菌效果未发生显著变化，说明本发明所述菌株具有很好的遗传稳定性；

3、将本发明所述菌株制成微生物菌剂后，并以50%、25%、10%、5%和1%的浓度与腐霉病菌、镰刀菌、核盘菌和灰霉病菌的分生孢子混合，将其置于96孔细胞培养板内，25℃恒温培养箱培养5 d后观察抑菌效果，以10%的菌液处理平均抑菌率就达到60%以上。

 附图说明：

图1 本发明的枯草芽孢杆菌菌株的稀释分离过程示意图

图2 本发明的枯草芽孢杆菌菌株的16S rDNA的聚类分析

图3 本发明的枯草芽孢杆菌菌株对植物病原真菌的抑菌效果图。

A为番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea），B为甜瓜镰刀菌(Fusarium roseum)，C为黄瓜腐霉病菌(Pythium aphanidermatum)，D为油菜核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)。

 具体实施方式

本发明公开了一种高抗真菌活性的枯草芽孢杆菌，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数来实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，这些都被视为包括在被发明内。本发明所述的枯草芽孢杆菌已经通过较规范的实施例进行了描述，相关人员明显能在不摆脱本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动和适当的变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

 实施例1 微生物从土样中的分离

从河北衡水市温室内采回健康黄瓜植株的根际土壤，称取10g土壤用90mL无菌水进行混匀，然后在从中取1mL样用9mL无菌水进行稀释，以此进行6次，稀释成10^-6、10^-7、10^-8  3个梯度（具体稀释方法如图1所示），移取最后三个梯度的菌悬液100微升，涂布于LB固体培养基（培养基组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂，15g/L）平板上，以最后一次的稀释液作为对照，于28℃下培养，并每24h观察一次。选择对照中无菌落，而此前的稀释液中长出菌落的菌株，根据菌落形态、颜色等特征跳取单菌落于液体LB培养基中培养，并纯化编号。

 实施例2 拮抗菌株的筛选

防治植物真菌病害的拮抗细菌的筛选：在灭菌培养皿中均匀加入100 μL浓度为1X10⁷ cfu/mL黄瓜腐霉病菌菌悬液，倒入冷却至约50℃的熔化LB培养基20 mL充分混匀。待培养基完全凝固后，用接种环点接种供试的拮抗菌，每皿点8-10个待测细菌菌株，28℃温箱中培养48 h后，检测抑菌圈的有无及大小。经初次测试将有拮抗作用的菌株纯化后进行重复测试，基本方法同上，每平板点接3个菌株，各3次重复。根据拮抗带(抑菌圈边缘与菌落边缘的间距) 的宽度确定拮抗程度。拮抗带>1mm的菌株定为有拮抗作用的菌株；拮抗带>4mm的作为拮抗细菌，进行拮抗性复筛试验，选择一个抑制作用最强的菌株，命名为MSB1201，即本申请所涉及的上述枯草芽孢杆菌。

实施例3 菌株的16S rDNA 的序列测定和分析及生理生化试验鉴定

枯草芽孢杆菌DNA提取采用常规酚法，用细菌通用引物扩增16S rDNA序列，引物序列为27F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R (GGTTACCTTGTTACGACTT)。PCR反应体系(50 μL)为：10 X PCR缓冲液5 μL、dNTP 4μL、引物各1 μL、DNA模板2.5 μL、Takara Taq酶0.25μL、超纯水36 μL。PCR扩增程序为94 ℃ 3min；94 ℃ 1min，52℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30个循环; 72℃ 10 min。扩增产物送上海生工生物科技有限公司进行测序。

将测得的16S rDNA序列输入GenBank，应用BLAST软件进行同源性搜索。选取不同菌株的16S rDNA序列并与GenBank中已知的16S rDNA进行同源性比较。

同源比较结果如下：

将该PCR扩增产物在GenBank中进行blast比对结果表明，本发明的菌株MSB1201与其高度同源的50个菌种均是芽孢杆菌属，其同源性均在98%以上，图2为MSB1201的16S rDNA序列同Bacillus subtilis，Pseudomonas fluorescens，Pseudomonas aeruginosa，Acinetobacter baumannii，Acinetobacter sp，Alcaligenes faecalis，Bordetella hinzii，Bacillus pumilus，Bacillus cereus，Bacillus thuringiensis，Lysinibacillus sp，Microbacterium resistens，Staphylococcus aureus等15种细菌的16S rDNA聚类分析。本发明所述枯草芽孢杆菌与Bacillus subtilis同源性最高。表1所示为菌株MSB1201的16S rDNA同源性高的10个菌株。由此结合表2所示的菌株生理生化指标可推断MSB1201菌株属于枯草芽孢杆菌。

表1 16S rDNA同源性比较

序列ID	菌株	同源性
			gi|313476261|FR729926.1	Bacillus subtilis strain ZWQ-1	98%
gi|246772528|GQ199593.1	Bacillus subtilis strain DL-3-4-3	99%
			gi|151935459|EF428247.2	Bacillus subtilis strain HDYM-23	99%
gi|151935452|EF428240.2	Bacillus subtilis strain HDYM-11	99%
			gi|396577946|AB735984.1	Bacillus subtilis strain M6K	99%
gi|281185519|GU258545.1	Bacillus subtilis strain Em7	99%
			gi|326378694|GU972603.1	Bacillus sp. LC03	99%
gi|220901177|FJ528074.1	Bacillus sp. BM2	99%
			gi|194399035|EU855195.1	Bacillus amyloliquefaciens strain CTSP13	99%
gi|194399025|EU855185.1	Bacillus amyloliquefaciens strain CTSP2	99%

对筛选的拮抗细菌进行初步的生理生化鉴定，包括革兰氏测定、接触酶反应、VP试验、淀粉水解以及7% NaCl生长试验，所述试验方法采用本领域的测定这类生理生化指标的常规试验方法。

 表 2 菌株的生理生化指标测定

测定指标	菌株特征	测定指标	菌株特征
				淀粉水解	+	接触酶	-
明胶水解	+	卵黄反应	-
				柠檬酸盐利用	+	吲哚产生	-
6.5% NaCl	+	丙酸盐的利用	-
				V-P测定	+

实施例4 本发明所述枯草芽孢杆菌对黄瓜腐霉病菌(Pythium aphanidermatum)、甜瓜镰刀菌(Fusarium roseum )、油菜核盘菌 (Sclerotinia sclerotiorum)、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）的生长抑制试验

采用平板对峙法，将直径为5 mm的供试的四种植物病原真菌与本发明的菌株MSB1201对峙培养，每个处理重复3次，25℃恒温培养箱培养5 d，观察抑菌效果。图3示出抑菌效果，其中A为番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea），B为甜瓜镰刀菌(Fusarium roseum)，C为黄瓜腐霉病菌(Pythium aphanidermatum)，D为油菜核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)，抑菌圈直径均大于3.8 cm。 可见，本发明的菌株对以上四种植物病原真菌均有很好的抑制效果，表明本发明所示菌株具有较广的抑菌谱。

 实施例5 本发明所述枯草芽孢杆菌微生物菌剂的制备

将保藏编号为CGMCC No.6788的枯草芽孢杆菌在PDA培养液（培养液组成为：马铃薯 200g/L，葡萄糖 20 g/L，PH 为8）中培养，培养液温度为27 ℃，天数为5天，转速为200rpm，pH值为8。 发酵培养后，加入5%的蔗糖，然后过滤并调节菌液细胞数为10⁹个/mL，即制得本发明的枯草芽孢杆菌微生物菌剂。

 实施例6 本发明所述枯草芽孢杆菌微生物菌剂对黄瓜腐霉病菌(Pythium aphanidermatum)、甜瓜镰刀菌(Fusarium roseum)、油菜核盘菌 (Sclerotinia sclerotiorum)、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）的分生孢子抑制试验

将实施例5所述微生物菌剂以50%、25%、10%、5%和1%的浓度与黄瓜腐霉病菌(Pythium aphanidermatum)、甜瓜镰刀菌(Fusarium roseum)、油菜核盘菌 (Sclerotinia sclerotiorum)、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）的分生孢子混合，将其置于96孔细胞培养板内，25℃恒温培养箱培养5 d，观察抑菌效果。由表3可知本发明所示菌株的微生物菌剂对黄瓜腐霉病菌(Pythium aphanidermatum)、甜瓜镰刀菌(Fusarium roseum)、油菜核盘菌 (Sclerotinia sclerotiorum)、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）有很好的抑制生长效果。

表3 本发明微生物菌剂对病原真菌孢子萌发抑制试验

实施例 7 本发明所述枯草芽孢杆菌遗传稳定性试验

将活化的本发明所述枯草芽孢杆菌接种于LB培养基内，28℃培养，每隔24h转代一次，共转40次，将传代的第1代、第10代、第20代、第30代、第40代对黄瓜腐霉病菌、甜瓜镰刀菌、油菜核盘菌、番茄灰霉病菌的孢子萌发抑制试验，以25%浓度本发明所述枯草芽孢杆菌菌液对真菌分生孢子悬浮液（孢子浓度1X10⁸）混合进行萌发抑制率试验，结果见表4，本发明所述枯草芽孢杆菌经多次转代后其抑菌活性未发生显著差异变化，说明该菌株具有很好的遗传稳定性。

 

表4 本发明枯草芽孢杆菌对病原真菌孢子悬浮液抑制稳定性试验

实施例8 温室试验

本实验在河北农业大学植物分子病理学与真菌毒素实验室温室中进行，每小区两行，严格隔离， 三次重复，随机区组排列，将黄瓜腐霉病菌、甜瓜镰刀菌、油菜核盘菌、番茄灰霉病菌的孢子溶液喷洒到土壤中。种植时将实施例5所得的25%的枯草芽孢杆菌微生物菌剂浸泡番茄种子，以水浸泡为对照进行播种，2个月后对番茄生长的生长状况及病情指数进行测量分析，结果如表5所示，用菌剂处理种子后，其抗病能力明显增强。

表5 本发明枯草芽孢杆菌菌剂处理种子后对真菌抗病性的温室试验

实施例9 含有枯草芽孢杆菌生物肥的制备

本发明所制的的生物肥料包括以下二种：

（1）5％枯草芽孢杆菌生物肥

本发明所述5％枯草芽孢杆菌生物肥由枯草芽孢杆菌的孢子液与无机肥料、有机肥料相混合制得，三者的重量比为1：6：13；所述无机肥料为氮肥、磷肥和钾肥，所述氮肥为尿素或硫酸铵，所述磷肥为磷酸铵或磷酸钙，所述钾肥为硫酸钾或氯化钾；所述有机肥料为堆肥或沼气肥。

具体制备方法为，将5%枯草芽孢杆菌孢子液（孢子浓度为1x10⁸cfu/mL）与30%的无机肥料送入搅拌机作一级搅拌，均匀后再加入65％的有机肥料作二级搅拌，使物料充分均匀。

将搅拌均匀的上述物料用传送带经粉碎后送入滚筒造粒机，在滚筒内喷射蒸汽使物料加热至20-40℃，通过滚筒不停转动使物料成球状颗粒。将成球颗粒送入烘干滚筒，输入热风烘干。 将烘干的成球经冷却、筛分， 最后袋装或罐装成成品。

（2）10％枯草芽孢杆菌生物肥

本发明所述10％枯草芽孢杆菌生物肥由枯草芽孢杆菌的孢子液与微肥、有机肥料相混合制得，三者的重量比为1：3：6；所述微肥选自碳酸锰锌、硼镁肥、钼酸钠、螯合态铜或磷酸铵铁中的一种或多种；所述有机肥料为堆肥或沼气肥。

具体制备方法为，将10%枯草芽孢杆菌孢子液（孢子浓度为1x10⁸cfu/mL）与30%的微肥送入搅拌机作一级搅拌，均匀后再加入60%的有机肥料作二级搅拌，使物料充分均匀。

将搅拌均匀的上述物料用传送带经粉碎后送入滚筒造粒机，在滚筒内喷射蒸汽使物料加热至20-40℃，通过滚筒不停转动使物料成球状颗粒。

将成球颗粒送入烘干滚筒，输入热风烘干。

将烘干的成球经冷却、筛分，最后袋装或罐装成成品。

 本发明的一种防治植物真菌病害的枯草芽孢杆菌及其应用已经通过具体的实例进行了描述，本领域技术人员可借鉴本发明内容，适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。

Claims (7)

1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.6788。

2.一种保藏编号为CGMCC No.6788的枯草芽孢杆菌在防治植物真菌病害的用途。

3.根据权利要求2的用途，其特征在于，所述植物真菌病害的真菌病原体为腐霉病菌（Pythium）、镰刀菌（Fusarium）、核盘菌（Sclerotinia）和灰霉病菌（Botrytis）。

4.根据权利要求3的用途，其特征在于，所述植物真菌病害的真菌病原体为黄瓜腐霉病菌(Pythium aphanidermatum)、甜瓜镰刀菌 (Fusarium roseum )、油菜核盘菌 (Sclerotinia sclerotiorum)、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）。

5.一种微生物菌剂，其特征在于，将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在PDA培养液中培养，培养液温度为27 ℃，天数为5天，转速为200 rpm，然后过滤并调节菌液细胞数为10⁹个/mL，即制得微生物菌剂。

6.一种生物肥，其特征在于，将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的孢子液与无机肥料、有机肥料相混合制得，三者的重量比为1：6：13；所述无机肥料选自氮肥、磷肥和钾肥，所述氮肥为尿素或硫酸铵，所述磷肥为磷酸铵或磷酸钙，所述钾肥为硫酸钾或氯化钾；所述有机肥料为堆肥或沼气肥。

7. 一种生物肥，其特征在于，将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的孢子液与微肥、有机肥料相混合制得，三者的重量比为1：3：6；所述微肥选自碳酸锰锌、硼镁肥、钼酸钠、螯合态铜或磷酸铵铁中的一种或多种；所述有机肥料为堆肥或沼气肥。

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