CN102533617A - 一株枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株枯草芽孢杆菌及其应用，已于2011年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5498。所提供的可产生耐热蛋白的植物病原真菌拮抗菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HJX1，为革兰氏阳性短杆菌，菌体大小约0.7～0.9×1.8～2.4μm之间，产生芽孢，芽孢中生，圆形，周生鞭毛、具运动性。菌体在LB培养基上能形成乳白色、表面湿润、圆形、边缘整齐。最适培养基为LB培养基；培养温度为28～32℃，最适温度为30℃，最适PH值7.0。实验证明，本发明的植物病原真菌拮抗菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HJX1，对香蕉枯萎病、水稻稻瘟病、三七根腐病、棉花枯萎病等病原真菌都有很强的抑菌作用，可以对这些病原菌引起的真菌病害起到防治作用。

Description

一株枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株可产生耐热蛋白的植物病原真菌，以及其在防治植物病害中的应用。

背景技术

香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)引起的毁灭性病害，是国际检疫对象(肖彤斌，谢圣华，芮凯，等.香蕉枯萎病的发生及防控对策[J].热带农业科学，2006，26(6)：53-54.)。1904年香蕉枯萎病在美国夏威夷首次被发现(高乔婉.香蕉枯萎病[A]，中国农业百科全书编辑部，中国农业百科全书植物病理学卷[C].北京：中国农业出版社，1996，482-483.)，1910年Erim F.Smith分离到该病的病原菌，1913年Ashby最先对该病原菌作了详细的描述，1919年Brandes首次确证了该病原菌的致病性，1940年Snyder和Hansen将该病原菌命名为Fusarium oxysporum f.sp.cubense(E.F.Smith)Snyderet Hasen(黎永坚，于莉.香蕉枯萎病发病机制及其防治技术研究[J].中国农学通报，2006，22(8)：515-519.)。1910年香蕉枯萎病在巴拿马大发生，造成惨重损失，因此该病又称作香蕉巴拿马病。1935至1939年，香蕉枯萎病相继在哥斯达黎加、洪都拉斯、哥伦比亚等南美国家大面积爆发，给这些地区的香蕉种植业造成了毁灭性的打击(陈敦忠，徐碧玉，金志强.香蕉镰刀菌枯萎病的诊断及防治[J].热带农业科学，2005，25(2)：53-57.；PeggK.G.，Moore N.Y.，Bentley S.Fusarium wilt of banana in Australia：a review[J].AustralianJournal of Agricultural Research，1996，47(5)：637-650.)。之后香蕉枯萎病逐渐蔓延到世界各香蕉产区。目前香蕉枯萎病在亚洲、澳大利亚、非洲、热带美洲及南太平洋的香蕉产区均有分布(林时迟，张绍升，周乐峰，等.福建省香蕉枯萎病鉴定[J].福建农业大学学报，2000，29(4)：465-469.)。我国台湾在1967年最早报道香蕉枯萎病的发生(舒肇苏.台湾香蕉病害的防治[J].柑桔与亚热带果树信息，2000，16(20)：43-44.)，随后香蕉枯萎病在台湾大流行，使台湾香蕉种植面积骤降。60年代以前大陆香蕉枯萎病菌主要为1号生理小种，仅侵染粉蕉，1995年，广东省首次发现在香蕉上发生枯萎病(刘景梅，王璧生，陈霞，等.广东香蕉枯萎病菌生理小种RAPD技术的建立[J].广东农业科学，2004，4：43-55.)，2001年该病首次在海南省被发现(周传波，李道民，张世能，等.海南岛香蕉尖孢镰刀茵枯萎病的发生与防治[J].海南农业科技，2004，2：11-16.)。目前香蕉枯萎病在我国广东、广西、海南、福建等香蕉主产区均有发生，并有快速扩展的趋势，严重威胁着我国的香蕉种植业(陈铣，梁炳坤，何贵源，等.香蕉枯萎病的发生及防治试验[J].广东农业科学，2005，5：42-43.)。

香蕉枯萎病的发生具有明显的发病中心(卓国豪，黄有宝，吴运新，等.香蕉枯萎病的综合防治技术[J]植物检疫，2003，5：279-280.)，其典型外部症状为叶片黄化和假茎开裂(魏岳荣，黄秉智，杨护，等.香蕉镰刀菌枯萎病研究进展[J].果树学报，2005，22(2)：154-159.)。植株受害初期，香蕉下部叶片边缘及其叶鞘外部发黄，并逐渐向叶片中脉扩展，直至整叶发黄、枯死；近叶鞘处的叶柄倒折，叶片下垂；病株除顶端叶片外，所有叶片由下而上相继变黄；严重病株出现假茎基部纵裂，甚至整株枯死。纵剖假茎和球茎，发现其维管束组织变褐、坏死，严重时病株根系变黑、腐烂坏死(林兴祖，陈腾.海南香蕉镰刀菌枯萎病综合防治措施[J].植物保护，2007，3：46-48.)。

香蕉枯萎病属于土传维管束病害，远距离传播主要依靠染病种苗、带菌土壤和流水(王茂明，杨秀娟，陈福如，等。我国香蕉镰刀菌枯萎病的发生与防治[J].福建农业科技，2005，6：36-38.)。高温多湿的天气有利于香蕉枯萎病的发生与扩展(李华胜，陈世凯，周荣等。香蕉镰刀菌枯萎病的发生及综合防治[J].广东农业科学，2007，3：46-47.)，因此，春季种植的香蕉，枯萎病一般在6～7月开始发生，8～9月病害加速扩展并逐步加重，10～11月达到发病高峰(陈铣，梁炳坤，何贵源等。香蕉枯萎病的发生及防治试验[J].广东农业科学，2005，5：42-43.)。香蕉枯萎病的外观症状一般表现在抽蕾期至挂果期，感病香蕉植株一般不能结果或结果后不能成熟，因此容易造成严重的经济损失。发病严重的焦田第一年的发病率能达到10％，第二年为20％～30％，第三年发病率则能达到70％以上，这样的蕉田不能再继续种植香蕉，导致荒园(卓国豪，陈绍平，郑康炎，等.香蕉枯萎病发生原因及控制对策[J].广东农业科学，2005，1：56-57.)。

香蕉枯萎病为系统性病害，病原菌主要通过根系侵入，并向植株输导组织扩展危害维管束，形成系统性侵染，防治难度比较大(卓国豪，陈绍平，郑康炎，等.香蕉枯萎病发生原因及控制对策[J].广东农业科学，2005，1：56-57.)。同时香蕉枯萎病菌形成厚垣孢子，能够在土壤中存活3至5年(王文华，王葵娣，曾会才.香蕉枯萎病的危害及其防治策略[J].广西热带农业，2007，3：19-21.)，即使在淹水2年的情况下，依然不能完全杀死病原菌，因此采用轮作的农业防治措施不能很好的防治香蕉枯萎病(刘绍钦，梁张慧，黄炽辉.香蕉枯萎病的防治策略[J].广西农业科学，2006，37(6)：686-687.)。采用无病组培苗和抗病品种能对香蕉枯萎病起到一定的防治效果(Hwang S.C.，KO W.H.Chao C.P.A promising Cavendish clone resistantto race 4 of Fusarium oxysporum f.sp.cubense[J].Plant Pretection BulletinTaibei，1994，36(4)：282-291.；Shin-Chuan Hwang，Wen-Hwiung Ko.Cavendish banana cultivarsresistant to Fusarium wilt acquired through somaclonal variation in Taiwan[J]，Plantdisease，2004，88(6)：580-588.)，但香蕉品种多为三倍体，其雌花高度不孕，所以很难通过杂交方法得到抗病品种。目前的抗病品种多从无性系突变体中选育获得，且均为中抗品种，农艺性状和品质不好(肖爱萍，游春平.香蕉枯萎病防治进展[J].江西植保，2005，28(2)：67-69.)，不能很好的满足生产需要。近年来国内外一直致力于防治香蕉枯萎病的化学药剂的筛选，但成果大多还停留在实验室阶段(王忠全，方健葵，陈崎林.保水剂在香蕉枯萎病药剂防治上的运用效果[J].江西农业大学学报，2007，29(6)：933-936.)。许多在室内测定对香蕉枯萎病菌有很好抑制效果的化学农药在田间的防治效果不理想(林兰稳，奚伟鹏，黄赛花.香蕉镰刀茵枯萎病防治药剂的筛选[J].生态环境，2003，12(2)：182-183.)；Nel等(2003)认为只有苯并噻二唑对香蕉枯萎病有一定防治效果，其它化学农药几乎没有效果(肖爱萍，游春平.香蕉枯萎病防治进展[J].江西植保，2005，28(2)：67-69.；Nel B.，ViljoenA.，Steinberg C.，et al.Evaluation of chemical substances for the management and control ofFusarium wilt of banana，In：Claudine Picq，Anne Vezina，Eds.2nd International symposium onFusarium wilt on banana[C].Salvador de Bahia，Brazil，2003.)。在目前还未有有效的抗病品种，而且现有的化学药剂在防治上也难以奏效的情况下，采用生物防治特别是内生生防菌是当前比较有效的途径之一，生物防治逐渐成为各国研究香蕉枯萎病防治的热点(肖爱萍，游春平.香蕉枯萎病防治进展[J].江西植保，2005，28(2)：67-69.)。

国外有很多学者很早就开始研究香蕉枯萎病的生物防治，也取得了一些成果。1932年Weindling(1932)发现一株对香蕉枯萎病具有拮抗作用的木霉，并初步研究了该木霉对香蕉枯萎病菌的拮抗机理，发现该木霉主要通过重寄生、溶菌和生长竞争等一系列的拮抗作用来很好的抑制香蕉枯萎病病原菌(Weindting R..Lignorum is a parusite of other soilfungil[J].Pintopathology，1932，22：837-845.)。Saravanan等(2003，2004)在香蕉植株根际分离到对香蕉枯萎病菌有显著抑制作用的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，通过与其它8种生防菌在离体、盆栽和大田条件下对香蕉枯萎病的防效的比较，发现荧光假单胞菌的抑菌作用最好(Saravanan T.，Muthusamy M.，Marimuthu T..Development of integratedapproach to manage the fusarial wilt of banana[J].Crop Protection，2003，22：1117-1123.)。此外，Cetha(2002)，Nautiyal(2002)，Ting(2008)等均分离到对香蕉枯萎病菌有抑制作用的生防菌(Cetha K，Vikineswary S..Antagonistic effects of streptomyces violacensniger strainG10 on Fusatium oxysporum f.sp.cubense race 4[J].Journal of Industrial Microbiology andBiotechnology.2002，8(6)：303-306.；]Nautiyal C.S.，Singh J.K..Survival of therhizosphere-competent biocontrol strain Pseudomonas fluorescens NBRI2650 in the soilandphytosphere[J].Canaadian Joumal of Microbiology.2002，48(7)：588-601.；Ting A.S.Y.，MeonS.，Kadir J.et al.Endophytic microorganisms as potential growth promoters of banana[J].Biocontrol，2008，53：541-553.)。

在国内，对香蕉枯萎病的生物防治研究虽然起步较晚，但发展很快，目前已经在生防菌的筛选方面取得了一定的成绩，筛选到许多对香蕉枯萎病有拮抗作用的细菌。肖爱萍等(2008)从香蕉园土壤中分离到5株拮抗菌，测得对香蕉枯萎病孢子萌发抑制率最高能达到97.18％，并初步研究了这些拮抗菌对香蕉枯萎病的抑制机理，发现其作用机制主要为对香蕉枯萎病菌菌丝的消融、菌丝细胞的泡囊化、抑制分生孢子的萌发以及孢子芽管的扭曲等(肖爱萍，李庚花，游春平等.5株拮抗细菌对香蕉枯萎病菌的抑制作用[J].江西农业大学学报，2008，27(4)：572-575.)。钟小燕(2009)等在发生枯萎病的香蕉园土壤分离到一株假单胞菌，测得该菌产生的挥发性物质对抑制香蕉枯萎病菌十分重要(钟小燕，梁妙芬，甄锡壮等.假单胞菌对香蕉枯萎病菌的抑制作用[J].植物保护，2009，35(1)：86-89.)。程亮等(2005)初步研究了假单胞菌的抑菌机理，发现假单胞菌发酵液和无菌滤液对香蕉枯萎病菌丝生长和孢子萌发抑制作用显著，同时能导致病菌菌丝和孢子芽管扭曲和膨大(程亮，肖爱萍，游春平。拮抗菌对香蕉枯萎病菌的抑菌作用初步研究[J].仲恺农业技术学院学报，2005，18(1)：9-13.)。

综上所述，香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)引起的毁灭性病，是国际检疫对象。在目前还未有有效的抗病品种，而且现有的化学药剂在防治上也难以效的情况下，采用生物防治特别是内生生防菌是当前比较有效的途径之一，生物防治逐渐为各国研究香蕉枯萎病防治的热点。

发明内容

本发明的目的是提供一株枯草芽孢杆菌，其是一种可产生耐热蛋白的植物病原真菌拮抗菌，对香蕉枯萎病、水稻稻瘟病、三七根腐病、棉花枯萎病等病原真菌都具有很强的抑菌作用。

本发明所提供的可产生耐热蛋白的植物病原真菌拮抗菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HJX1，其保藏编号为CGMCC No.5498。

所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HJX1，已于2011年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏编号为MC No.5498。

所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HJX1，保藏号CGMCC No.5498，为革兰氏阳性短杆菌，菌体大小约0.7～0.9×1.8～2.4μm之间，产生芽孢，芽孢中生，圆形，周生鞭毛、具运动性。菌体在LB培养基上能形成乳白色、表面湿润、圆形、边缘整齐。能产生耐热蛋白(该蛋白在沸水浴中煮沸30分钟，活性基本不变)。

所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HJX1(保藏号CGMCC No.5498)，最适培养基为LB培养基；培养温度为28～32℃，最适温度为30℃，最适PH值7.0。

以上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HJX1(保藏号为CGMCC No.5498)，活性成分的生物菌剂也属于本发明的保护范围。在需要的时候，该菌剂中还可包含菌剂制备中常用的载体和辅料。

实验证明，本发明的植物病原真菌拮抗菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HJX1(保藏号CGMCC No.5498)，对香蕉枯萎病、水稻稻瘟病、三七根腐病、棉花枯萎病等病原真菌都有很强的抑菌作用，可以对这些病原菌引起的真菌病害起到防治作用。

本发明的野生菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HJX1(保藏号CGMCC No.5498)，分离自海南省东方市大田镇的香蕉种植区重病田的香蕉根际土壤，实验证明该菌株接种香蕉后能够在香蕉植株内稳定定殖。实验结果还证明该菌株产生的耐热蛋白能够有效抑制香蕉枯萎病菌的生长，为香蕉枯萎病的防治提供了一条环保、简单、有效的途径，同时也可以为作物提供一种新型的抗原材料。本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HJX1，保藏号CGMCC No.5498，是一株具有良好生防应用前景的菌株。

附图说明

图1、2为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HJX1 CGMCC No.5498和香蕉枯萎病菌的对峙培养试验结果。

图3为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HJX1 CGMCC No.5498除菌体发酵液对香蕉枯萎病菌的抑制作用。左侧的是对照样，右侧的为抑制的测试结果。

图4、5为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HJX1 CGMCC No.5498产耐热蛋白实验；图中A为硫酸铵沉淀蛋白粗提液、B为硫酸铵沉淀蛋白粗提液经100℃水浴30分钟、P为PBS缓冲液对照。

图6为HJX1菌株在不同培养基条件下的抑菌效果。

图7为培养温度对菌株HJX1发酵液抑菌作用的影响测试结果图。

图8为培养时间对菌株HJX1发酵液抑菌效果的影响测试结果图。

图9为摇床转速对菌株HJX1发酵液抑菌效果的影响测试结果图。

图10为pH对菌株ZB-2发酵液抑菌效果的影响测试结果图。

图11为本发明菌株的16S rDNA的核苷酸序列图。

本发明菌体的保藏信息如下：

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏编号为CGMCC No.5498；

保藏日期：2011年11月30日；

保藏编号：CGMCC No.5498。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式做进一步说明。

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法，下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1

植物病菌真菌拮抗菌的筛选及其鉴定

1、植物病原真菌拮抗菌的筛选

本菌株是从我国海南东方市大田镇香蕉枯萎病发生严重的地块中香蕉植株的根际土壤中分离到的，具体方法为：称取5克根际土壤，放入有100ml无菌水的三角瓶中，在摇床上剧烈振荡30min后，静置15min。取1ml稀释至10-4、10-5、10-6浓度梯度，从各浓度梯度悬浮液中取0.1ml，用无菌涂棒涂于LB培养基(配方为：每升含有蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，琼脂粉12g，pH7.0～7.2)平板上，30℃恒温培养箱倒置培养，连续观察3天，挑取菌落形态不同的菌株再次划线纯化保存备用。在倒好的PDA平板中央接入新鲜的香蕉枯萎病菌菌块，在菌块周边用无菌牙签点接筛选纯化后的菌株进行对峙培养，筛选抑菌作用最强(抑菌活性最强)的菌株，结果得到一株对香蕉枯萎病菌有很强拮抗作用的菌株，将该菌株命名为HJX1。

2、HJX1菌株的种属鉴定

通过形态学观察及采用16S rDNA和细胞组分脂肪酸的测定，确认该菌株应属于枯草芽孢杆菌。

1)该菌株的基本生物学特性为：革兰氏阳性短杆菌，菌体大小约0.7～0.9×1.8～2.4μm之间，产生芽孢，芽孢中生，圆形，周生鞭毛、具运动性。菌体在LB培养基上能形成乳白色、表面湿润、圆形、边缘整齐的菌落。该菌株已于2011年月日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.5498。

2)以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HJX1(CGMCC No.5498)的基因组DNA为模板，以细菌16S rDNA序列通用引物P0、P6作为引物，PCR扩增出约1.5kb左右的产物片段，测序结果表明扩增出的序列长度为1521个碱基，具有附图1所示的核苷酸序列；将该序列通过互联网比对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/B last.cgi)，扩增的片段序列与枯草芽孢杆菌的16S rDNA部分序列的同源性达99％以上。

3)配制TSBA(Trypticase Soy Broth Agar)培养基，将保存的菌株进行四区划线接种后在30℃恒温箱中培养24h。用接种环在四区划线培养皿的第三区前后移动取出菌落。通过皂化反应、甲基化反应、萃取、洗涤和转移过程后将样品编号，然后进行GC分析。结果表明菌株HJX1的脂肪酸的含量同枯草芽孢杆菌最近，其相似度为0.724。

3、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HJX1(CGMCC No.5498)最适培养条件的确认

1)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HJX1(CGMCC No.5498)生长最适培养基的确定

将HJX1菌株分别接种于NB、LB、PSB、PDB培养液中，于30℃，170rpm，振荡培养48h。离心，取上清液做抑菌实验，如图6所示，结果表明LB培养基为其最适培养基。

2)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HJX1 CGMCC No.5498生长最适温度的确定

接种HJX1菌株的LB培养液分别在25、28、30、32和35℃，170rpm，振荡培养48h。离心，取上清液做抑菌实验，如图7所示，结果表明该菌株最适生长温度为30℃。

3)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HJX1(CGMCC No.5498)培养时间的确定

将HJX1接种于LB液体培养基中，于30℃，170rpm，分别振荡培养24、36、48、60、72、84和96小时。离心，取上清液做抑菌实验，如图8所示，结果表明该菌株最适培养时间为48h。

4)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HJX1(CGMCC No.5498)培养时摇床转速的确定

接种HJX1菌株的LB培养液分别在130、150、170、190和210rpm条件下，30℃，振荡培养48h。离心，取上清液做抑菌实验，如图9所示，结果表明该菌株发酵培养时的摇床转速为170rpm。

5)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HJX1(CGMCC No.5498)培养时pH的确定

将HJX1菌株接种于pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的LB培养液中，30℃，170rpm，摇床振荡培养48h。离心，取上清液做抑菌实验，如图10所示，结果表明该菌株发酵培养时的最适pH值为7.0。

实施例2

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HJX1(CGMCC No.5498)产耐热蛋白的实验

1、HJX1菌株蛋白粗提液制备

将保存的HJX1菌株活化后接种于LB液体培养基中，30℃，170r/min，振荡培养48h后，在冷冻高速离心机中10,000r/min离心10min后，收集上清液，然后在去菌体发酵液中加入硫酸铵至80％的饱和度，4℃沉淀20～24h。在冷冻高速离心机中10,000r/min离心20min，收集沉淀。将沉淀用磷酸缓冲液溶解后在透析袋(截留分子量为5KDa)中于4℃冰箱内用蒸馏水进行透析48h，期间换水一次。然后将透析液倒入培养皿中，用保鲜膜封口后用无菌针头刺出适量多的小孔，在-80℃冰箱中冷冻后置于冷冻干燥仪中冻干，冻干物用原体积1/20的25mmol/L的磷酸缓冲液溶解。

2、病原真菌孢子悬浮液

将香蕉枯萎病菌在PDA平板培养3天，从菌落边缘挑取菌丝块，接种于PDB培养液中，装液量为每三角瓶(250mL)中盛有100mL PDB培养液，26℃，170r/min，摇床振荡培养4～7天。根据培养情况，无菌纱布过滤去大块菌丝体，得到分生孢子悬浮液；血球计数板计数，将制备的悬浮液用无菌水调整到浓度为10⁸CFU/mL。

3、对病原真菌的抑菌活性测定

采用混菌法测定蛋白粗提液对香蕉枯萎病菌的抑菌活性：融化琼脂含量1.0％的PDA培养基，然后冷却至37℃左右时，每100mL中加入1mL病原真菌的孢子悬浮液混合均匀，倒平板。在每个平板上放置2个内直径为6mm的无菌牛津杯。其中一个加入100μL25mmol/L的磷酸缓冲液作为对照，另一个中加入100μL制备的蛋白粗提液。设3次重复。在4℃冰箱中放置过夜后在26℃恒温培养箱中培养3～5天，测量抑菌圈直径(牛津杯外圈到长有菌落之间未长菌落的径线距离)。

4、HJX1菌株产耐热抗菌活性蛋白的确定

将制备的HJX1菌株的蛋白粗提液分别于40、60、80、100℃的水浴锅中处理30min，再进行抑菌活性测定，用制备保存的蛋白粗提液为对照，5次重复。结果表明，菌株HJX1的粗提蛋白液经40、60、80℃、100℃水浴处理后抑菌效果不变，这充分说明菌株HJX1可产生抑制香蕉枯萎病菌的耐热蛋白，如图4、图5所示。

实施例3

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HJX1(CGMCC No.5498)对病原真菌的拮抗效果实验

在PDA培养基平板中央分别将直径6mm的供试病原真菌菌块(香蕉枯萎病菌、棉花枯萎病菌、水稻稻瘟病菌、三七根腐病菌、康乃馨镰刀病菌、甘蔗茎腐病菌，均有本实验室保存)接入，然后用LB培养基培养后的菌株HJX1的菌液在距离病原真菌菌块2cm的地方呈三角型点接3μl菌液，置28℃恒温培养箱中进行暗培养(处理组)，以点接无菌水的培养基培养的菌块为对照，培养至对照病原菌长满皿后测量病原菌生长距离，计算平均抑菌效果。抑制率(％)＝[(对照组病原菌生长半径-处理组病原菌生长半径)/(对照组病原菌生长半径-接种菌饼半径)]×100％。结果该菌株对香蕉枯萎病菌的抑制率为89.2％，对其余几种病原真菌的抑制率在64.3～86.5％之间，表明该菌株对多种病原真菌具有很强的拮抗活性，结果见下表(枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HJX1对不同病原真菌的抑菌率)。

供试病原菌	抑菌率(％)	供试病原菌	抑菌率(％)
				香蕉枯萎病菌	89.2±3.4	三七根腐病菌	86.5±1.6
棉花枯萎病菌	64.3±2.6	康乃馨镰刀病菌	83.5±2.2
				水稻稻瘟病菌	68.9±3.1	甘蔗茎腐病菌	72.8±4.9

实施例4

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HJX1(CGMCC No.5498)对香蕉盆栽苗枯萎病防效的测定

1、盆栽香蕉枯萎病防效试验设4个处理，处理1为经过灭菌处理的LB培养液，作为对照组，处理2为菌株HJX1的发酵液稀释，处理2为菌株HJX1发酵液离心后所得上清液，处理4为菌株HJX1的发酵液离心后上清液经沸水煮沸20分钟后。每个处理30盆。试验所用香蕉苗为经过简单炼苗的香蕉组培苗，试验进行到第40天后调查病情等级，计算病情指数和防治效果。

病情等级分级标准如下：

0级——健株；

1级——有25％的黄化病叶；

3级——有25％～50％的黄化病叶；

5级——有50％～90％的黄化病叶；

7级——叶片全部黄化，植株死亡。

2、香蕉枯萎病菌孢子悬浮液准备

将香蕉枯萎病菌在PDA平板培养3天，从菌落边缘挑取菌丝块，接种于PDB培养液中，装液量为每三角瓶(250mL)中盛有100mL PDB培养液，26℃，170r/min，摇床振荡培养4～7天。根据培养情况，无菌纱布过滤去大块菌丝体，得到分生孢子悬浮液；血球计数板计数，将制备的悬浮液用无菌水调整到浓度为10⁸CFU/mL。

3、盆栽土壤准备

采集种植香蕉的大田土壤，利用大型灭菌锅用布袋装入土壤进行高压灭菌，灭菌1个小时候拿出放置一天后再次灭菌1小时。阴干两天后备用。将得到的香蕉枯萎病菌孢子悬浮液均匀拌入阴干后的土壤，使每克土壤中含有10⁶个香蕉枯萎病菌孢子，装盆。

4、盆栽试验

将从组培室出来经过简单炼苗的香蕉组培苗定殖于盆中，根据试验设计的不同处理浇入相应的相同稀释倍数的各液体，放入温室大棚进行试验。

5、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HJX1对香蕉盆栽苗枯萎病防治效果

病情等级	7级	5级	3级	1级	0级	病情指数	防效(％)
								处理1	1	5	18	4	1	42.86	-
处理2	0	0	0	3	27	1.43	96.67
								处理3	0	0	1	7	22	4.76	88.89
处理4	0	0	1	11	18	6.67	84.44

从上表中可以看出，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HJX1对香蕉枯萎病的盆栽防效达到了理想的防治效果，其防效高达96.67％(处理2)，而同时，其产生的可耐热蛋白在防治香蕉枯萎病中起到了相当重要的作用，其防治效果也达到了84.44％(处理4)。

Claims (7)

1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HJX1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.5498。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HJX1抑制病原真菌的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征是：所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HJX1防治的是由病原真菌引起的香蕉枯萎病。

4.一种生物菌剂，其特征是：所述生物菌剂含有保藏编号为CGMCC No.5498的枯草芽孢杆菌HJX1。

5.根据权利要求4所述的生物菌剂，其特征是：所述生物菌剂中还含有载体和辅料。

6.由权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HJX1产生的耐热蛋白，其具有附图2中所示的核苷酸序列。

7.一种权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HJX1的培养方法，其特征是：培养温度为28-32℃。

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