CN107460147B - 一株耐盐短杆菌及其在制备拮抗植物病原菌微生物菌剂中的应用 - Google Patents

一株耐盐短杆菌及其在制备拮抗植物病原菌微生物菌剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株耐盐短杆菌及其在制备拮抗植物病原菌微生物菌剂中的应用，属于植物病害的微生物防治技术领域。本发明的技术方案要点为：耐盐短杆菌Brevibacterium halotolerans，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.14230。本发明还具体公开了该耐盐短杆菌的分离纯化方法及其在制备拮抗植物病原菌微生物菌剂中的应用。本发明采用平板分离纯化的方法从名贵中药地黄的根际土壤中获得一株细菌，经16s rDNA测序鉴定为耐盐短杆菌，该菌株能够高效拮抗地黄根腐病与斑枯病，为开发地黄生防型微生物菌剂提供了一株新的菌种资源。

Description

一株耐盐短杆菌及其在制备拮抗植物病原菌微生物菌剂中的 应用
技术领域
本发明属于植物病害的微生物防治技术领域，具体涉及一株耐盐短杆菌及其在制备拮抗植物病原菌微生物菌剂中的应用。
背景技术
近年来，随着社会进步和人口的急剧上涨，世界上各个国家对农作物需求量都呈现出持续增加的趋势。调查表明，在我国每年因为病虫害造成作物产量减少4000万吨，约占总产量的8.8%，全世界每年因病虫害造成作物减产约10亿吨，占总产量的约1/3。为了控制病虫害，实现作物增产增收，每年大量的农药被喷洒到农田。这些化学农药虽然在短期内能够控制病害，提高产量，但是它们的残留物随着雨水、动植物残体等进入周围环境，对生态平衡和环境保护造成了巨大的压力和威胁。
为了缓解农作物病虫害造成的损失，最大程度的避免环境污染，多种方法已经被应用。其中，微生物菌剂因其在防治病害方面所特有的高效性和环境友好性，正在成为现代农业病害防治的首选方法。除了能够有效防治病害，微生物菌剂中的活性微生物也将积极参与农业生态系统中元素转化与循环，从而提高植物对矿物质等营养的吸收，降低化肥的使用量。因此，筛选合适的微生物菌种，开发高效的微生物菌剂调整植物-环境间的微生态平衡，对于防治农作物病害，提高农作物产量具有非常重要的意义。本发明的创新点在于一株耐盐短杆菌Brevibacterium halotolerans JH8的分离纯化及其在制备拮抗植物病原菌微生物菌剂中的应用。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了一株耐盐短杆菌及其在制备拮抗植物病原菌微生物菌剂中的应用。
本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案：
一株耐盐短杆菌Brevibacterium halotolerans，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC NO. 14230。
本发明所述的耐盐短杆菌的分离纯化方法，其特征在于具体过程为：将1g地黄根际土壤溶于100mL生理盐水中，取100μL上清液涂布于固体LB培养基上于37℃培养36h，其中固体LB培养基的成分以g/L计为：氯化钠10、酵母粉5、蛋白胨10，其余成分为水，pH7.0，挑取其中的单菌落在固体LB培养基上进行划线分离纯化，获得细菌菌株，该菌株的菌落遗传特征如下：在固体LB培养基上，菌落8h之内呈半透明状，圆形，呈淡黄色透明状，表面光滑，菌落易挑起，12h之后，菌落表面形成菌膜出现褶皱，菌落周围凸起，中间凹陷，菌落呈微黄色不透明，菌落干燥，易挑起，16S rDNA测序及BLAST比对结果显示该菌株与耐盐短杆菌具有99%的相似性，其测序序列如序列表SEQIDNO:1所示，纯化后的菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO. 14230，保藏日期为2017年6月12日。
本发明所述的耐盐短杆菌在制备拮抗植物病原菌微生物菌剂中的应用。
本发明所述的耐盐短杆菌在制备防治植物根腐病及斑枯病微生物菌剂中的应用。
本发明所述的耐盐短杆菌在制备防治地黄根腐病及斑枯病微生物菌剂中的应用。
本发明所述的耐盐短杆菌发酵液在制备防治地黄根腐病及斑枯病微生物菌剂中的应用。
本发明所述的耐盐短杆菌发酵液蛋白在制备防治地黄根腐病及斑枯病微生物菌剂中的应用。
本发明采用平板分离纯化的方法从名贵中药地黄的根际土壤中获得一株细菌，经16s rDNA测序鉴定为耐盐短杆菌Brevibacterium halotolerans，编号为JH8，该菌株能够高效拮抗地黄根腐病与斑枯病，为开发地黄生防型微生物菌剂提供了一株新的菌种资源。
附图说明
图1是耐盐短杆菌JH8发酵液抑制地黄根腐病的效果对比图；
图2是耐盐短杆菌JH8发酵液蛋白粗抑制地黄根腐病的效果对比图；
图3是耐盐短杆菌JH8发酵液抑制地黄斑枯病的效果对比图；
图4是耐盐短杆菌JH8发酵液蛋白粗抑制地黄斑枯病的效果对比图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
菌株获得及分离纯化：将1g地黄根际土壤溶于100mL生理盐水中，取100μL上清液涂布于固体LB培养基上于37℃培养36h，其中固体LB培养基的成分以g/L计为：氯化钠10、酵母粉5、蛋白胨10，其余成分为水，pH7.0，挑取其中的单菌落在固体LB培养基上进行划线分离纯化，获得细菌菌株，该菌株的菌落遗传特征如下：在固体LB培养基上，菌落8h之内呈半透明状，圆形，呈淡黄色透明状，表面光滑，菌落易挑起，12h之后，菌落表面形成菌膜出现褶皱，菌落周围凸起，中间凹陷，菌落呈微黄色不透明，菌落干燥，易挑起，16S rDNA测序及BLAST比对结果显示该菌株与耐盐短杆菌具有99%的相似性，其测序序列如序列表SEQIDNO:1所示，纯化后的菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO. 14230，保藏日期为2017年6月12日。
耐盐短杆菌JH8拮抗地黄根腐病及斑枯病病原菌：
实施例1
用灭菌枪头挑取耐盐短杆菌菌株JH8的一个单菌落到含100mL LB液体培养基的三角瓶中，置于37℃、180r/min的振荡器中振荡培养24h。按5wt%接种量接种到容量为250mL的发酵瓶中（装LB液体培养基100mL)，置于37℃、180r/min的振荡器中振荡培养，取培养24h的菌液，4℃、11000r/min离心15min，上清液用0.22μm微孔滤膜过滤得无菌发酵液。取无菌发酵液10mL与90mL融化好的PDA培养基混合均匀制成平板，接入培养好的直径6mm致病菌菌丝块，置于28℃的条件下恒温培养4天后，以不加发酵液的对照菌落为对照，用十字交叉法测量地黄根腐病病原菌Fusarium solani的菌落直径，按照抑制率=(空白对照致病菌菌落直径- JH8对峙致病菌直径)/空白对照致病菌菌落直径*100%计算抑菌效果。结果显示，耐盐短杆菌JH8对地黄根腐病病菌Fusarium solani的抑制率达到了28%（附图1）。
实施例2
将耐盐短杆菌菌株JH8活化后接种于300mL LB培养基中，放入恒温振荡摇床中，在37℃、180rpm的条件下振荡培养36h后，取发酵液30mL于离心管中，11000r/min离心15min，取上清液分别加固体硫酸铵至10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%饱和度，充分溶解后放置4℃冰箱静止，让蛋白质充分沉淀，24h后将沉淀好的提取液取出，用低温高速离心机在4℃、11000rpm的条件下离心10min，保留沉淀。将配制好的pH7.0的磷酸缓冲液按原体积的1/10加入到沉淀中，使沉淀的蛋白质复溶得到的液体即为不同硫酸铵饱和度抑菌蛋白粗提液。将复溶好的蛋白粗提液用0.22μm微孔滤膜过滤即得到无菌蛋白液。在准备好的PDA平板上，用无菌枪头打出6mm的琼脂块，将含有致病菌菌丝的琼脂块放入平板中，并在距中心2cm的地方等距放置3个牛津杯，分别吸取200μL无菌蛋白液加入牛津杯中，放置于28℃培养箱中培养4天，按照抑制率=(空白对照致病菌菌落直径- JH8对峙致病菌直径)/空白对照致病菌菌落直径*100%计算抑菌效果。结果显示，100%饱和度的耐盐短杆菌JH8发酵液上清具有最高的抑制效果，对地黄根腐病病菌Fusarium solani的抑制率达到了24.3%（附图2）。
实施例3
用灭菌枪头挑取耐盐短杆菌菌株JH8的一个单菌落到含100mL LB液体培养基的三角瓶中，置于37℃、180r/min的振荡器中振荡培养24h。按5wt%接种量接种到容量为250mL的发酵瓶中（装LB液体培养基100mL)，置于37℃、180r/min的振荡器中振荡培养，取培养24h的菌液，4℃、11000r/min离心15min，上清液用0.22μm微孔滤膜过滤得无菌发酵液。取无菌发酵液10mL与90mL融化好的PDA培养基混合均匀制成平板，接入培养好的直径6mm致病菌菌丝块，置于28℃的条件下恒温培养4天后，以不加发酵液的对照菌落为对照，用十字交叉法测量地黄斑枯病病菌Septoria digitalis Pass的菌落直径，按照抑制率=(空白对照致病菌菌落直径- JH8对峙致病菌直径)/空白对照致病菌菌落直径*100%计算抑菌效果。结果显示，耐盐短杆菌JH8对地黄斑枯病病菌Septoria digitalis Pass的抑制率达到了32%（附图3）。
实施例4
将耐盐短杆菌菌株JH8活化后接种于300mL LB培养基中，放入恒温振荡摇床中，在37℃、180rpm的条件下振荡培养36h后，取发酵液30mL于离心管中，11000r/min离心15min，取上清液分别加固体硫酸铵至10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%饱和度，充分溶解后放置4℃冰箱静止，让蛋白质充分沉淀，24h后将沉淀好的提取液取出，用低温高速离心机在4℃、11000rpm的条件下离心10min，保留沉淀。将配制好的pH7.0的磷酸缓冲液按原体积的1/10加入到沉淀中，使沉淀的蛋白质复溶得到的液体即为不同硫酸铵饱和度抑菌蛋白粗提液。将复溶好的蛋白粗提液用0.22μm微孔滤膜过滤即得到无菌蛋白液。在准备好的PDA平板上，用无菌枪头打出6mm的琼脂块，将含有致病菌菌丝的琼脂块放入平板中，并在距中心2cm的地方等距放置3个牛津杯，分别吸取200μL无菌蛋白液加入牛津杯中，放置于28℃培养箱中培养4天，按照抑制率=(空白对照致病菌菌落直径- JH8对峙致病菌直径)/空白对照致病菌菌落直径*100%计算抑菌效果。结果显示，100%饱和度的耐盐短杆菌JH8发酵液上清具有最高的抑制效果，对地黄斑枯病病菌Septoria digitalis Pass的抑制率达到了55%（附图4）。
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。
序列表
<110> 河南师范大学
<120> 一株耐盐短杆菌及其在制备拮抗植物病原菌微生物菌剂中的应用
<130> 2017
<141> 2017-08-30
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 1393
<212> DNA
<213> 耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)
<400> 2
ttacctcacc gacttcgggt gttacaaact ctcgtggcgt gacgggcggt gtgtacaagg 60
cccgggaacg tattcaccgc ggcatgctga tccgcgatta ctagcgattc cagcttcacg 120
cagtcgagtt gcagactgcg atccgaactg agaacagatt tgtgggattg gcttaacctc 180
gcggtttcgc tgccctttgt tctgtccatt gtagcacgtg tgtagcccag gtcataaggg 240
gcatgatgat ttgacgtcat ccccaccttc ctccggtttg tcaccggcag tcaccttaga 300
gtgcccaact gaatgctggc aactaagatc aagggttgcg ctcgttgcgg gacttaaccc 360
aacatctcac gacacgagct gacgacaacc atgcaccacc tgtcactctg cccccgaagg 420
ggacgtccta tctctaggat tgtcagagga tgtcaagacc tggtaaggtt cttcgcgttg 480
cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc ctttgagttt 540
cagtcttgcg accgtactcc ccaggcggag tgcttaatgc gttagctgca gcactaaggg 600
gcggaaaccc cctaacactt agcactcatc gtttacggcg tggactacca gggtatctaa 660
tcctgttcgc tccccacgct ttcgctcctc agcgtcagtt acagaccaga gagtcgcctt 720
cgccactggt gttcctccac atctctacgc atttcaccgc tacacgtgga attccactct 780
cctcttctgc actcaagttc cccagtttcc aatgaccctc cccggttgag ccgggggctt 840
tcacatcaga cttaaggaac cgcctgcgag ccctttacgc ccaataattc cggacaacgc 900
ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta gccgtggctt tctggttagg 960
taccgtcaag gtaccgccct attcgaacgg tacttgttct tccctaacaa cagagcttta 1020
cgatccgaaa accttcatca ctcacgcggc gttgctccgt cagactttcg tccattgcgg 1080
aagattccct actgctgcct cccgtaggag tctgggccgt gtctcagtcc cagtgtggcc 1140
gatcaccctc tcaggtcggc tacgcatcgt tgccttggtg agccattacc tcaccaacta 1200
gctaatgcgc cgcgggtcca tctgtaagtg gtagccgaag ccacctttta tgtttgaacc 1260
atgcggttca aacaagcatc cggtattagc cccggtttcc cggagttatc ccagtcttac 1320
aggcaggtta cccacgtgtt actcacccgt ccgccgctaa catcagggag caagctccca 1380
tctgtccgct cga 1393

Claims (6)

1.一株耐盐短杆菌（Brevibacterium halotolerans），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该菌种简称JH8，保藏编号为：CGMCC NO. 14230。
2.权利要求1所述的耐盐短杆菌在制备拮抗植物病原菌微生物菌剂中的应用。
3.权利要求1所述的耐盐短杆菌在制备防治植物根腐病及斑枯病微生物菌剂中的应用。
4.权利要求1所述的耐盐短杆菌在制备防治地黄根腐病及斑枯病微生物菌剂中的应用。
5.权利要求1所述的耐盐短杆菌发酵液在制备防治地黄根腐病及斑枯病微生物菌剂中的应用。
6.权利要求1所述的耐盐短杆菌发酵液蛋白在制备防治地黄根腐病及斑枯病微生物菌剂中的应用。
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