CN106434496A

CN106434496A - 一株耐盐短杆菌及其在土壤生态修复中的应用

Info

Publication number: CN106434496A
Application number: CN201611117566.8A
Authority: CN
Inventors: 张春禹; 范天立; 赵平; 孙建光
Original assignee: Beijing Dongfang Fudi Environmental Technology Co ltd; Institute of Agricultural Resources and Regional Planning of CAAS
Current assignee: Beijing Fudi Zhongye Environmental Technology Co., Ltd.; Institute of Agricultural Resources and Regional Planning of CAAS
Priority date: 2016-12-07
Filing date: 2016-12-07
Publication date: 2017-02-22
Anticipated expiration: 2036-12-07
Also published as: CN106434496B

Abstract

本发明公开了一株具有较高固氮酶活性的耐盐短杆菌及其在生态修复中的应用。该耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.12402。本发明从农田作物根际土壤中分离固氮菌，进一步筛选较高固氮酶活性的菌株，最终筛选到高效固氮菌耐盐短杆菌GDSD21，本发明的耐盐短杆菌GDSD21的固氮酶活性极显著高于微生物肥料常用生产菌种圆褐固氮菌ACCC11103，在改良土壤、提高土壤肥力、生荒地生态修复、蔬菜工厂化育苗接种剂、固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。

Description

一株耐盐短杆菌及其在土壤生态修复中的应用

技术领域

本发明涉及一株具有较高固氮酶活性的耐盐短杆菌及其在生态修复中的应用。

背景技术

氮素是植物生长必需的化学元素，氮肥是农业生态修复和农业生产中最重要的生产资料之一。生产化学氮肥消耗大量能源，占生产总成本的70％～80％。煤炭、石油、天然气等化石能源不可再生，依靠化学氮肥的农业生产难以持续发展。化学氮肥在提高作物产量、保障我国粮食安全方面发挥了巨大作用，但是不合理施氮已经形成了严重的环境污染，造成一系列的严重危害，如太湖蓝藻污染，城市地下水硝酸盐污染等已经对环境和饮用水安全造成了威胁。

大气中含有78％的氮素，但其存在形式是分子态氮气，动植物不能直接利用，自然界只有某些原核微生物具有直接利用大气中氮气的能力，将其还原成氨，这就是生物固氮作用。选用高效固氮微生物菌种工厂化生产制成菌剂，或进一步与其它富含植物营养的物料复合加工成生物制品，应用于农业生产，可以提供作物氮素营养，改善作物根际生态环境，提高土壤生物肥力性状，这就是通常所说的固氮微生物菌剂或固氮微生物肥料。生物氮肥具有多种优势：①生物氮肥由可再生的生化制剂和活体微生物组成，可以再生，不存在资源枯竭问题，是可持续发展农资产品。②生物氮肥是环境友好型肥料，其生产和使用过程均不产生三废等污染性物质，而且能改善土壤理化性质，提高土壤肥力，是生态农业农资产品。③生物氮肥生产耗能少、成本低，其成本仅为等效化学氮肥的20％～40％，可以为国家节省大量的煤炭和石油等能源战略物资。④使用生物氮肥可以显著改善农业生态环境，降低农业生产成本，提高农产品品质，提升土壤肥力，使农民受益，促进社会和谐发展。

修路、开矿、干旱、洪涝等对自然环境植被和土壤生态影响巨大，修复土壤生态环境需要新的技术手段。近年来，微生物技术在生态环境修复中的作用越来越大。菌种是微生物肥料生产应用的基础。目前，限制我国微生物肥料行业发展的瓶颈就是高效菌种的选育问题。生态修复和农业生产迫切需要能够高效固氮、提高土壤生物活性的微生物肥料生产用菌种。

发明内容

本发明的目的是提供一株具有较高固氮酶活性的细菌及其在生态修复中的应用。

本发明提供的细菌是耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.12402，以下简称为耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21。

含有耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21或/和耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21的代谢物的菌剂也属于本发明的保护范围。

该菌剂除包含耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21或/和耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21的代谢物外，还可包括辅料，如草炭、动物的粪便、各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生皮等。所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。所述菌剂中，耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21或/和耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21的代谢物可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

所述菌剂可为下述1)-5)中的任一菌剂：

1)用于固氮的菌剂；

2)产生固氮酶的菌剂；

3)促进植物生长的菌剂；

4)改良培肥土壤的菌剂；

5)修复土壤生态的菌剂。

上述菌剂的活性成分可为耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21或/和耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21的代谢物，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的活性成分本领域技术人员可根据固氮酶活性确定。

耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21的下述P1)-P8)中的任一应用也属于本发明的保护范围：

P1)在固氮中的应用；

P2)在生产固氮酶中的应用；

P3)在促进植物生长中的应用；

P4)在改良培肥土壤中的应用；

P5)在修复土壤中的应用；

P6)在蔬菜工厂化育苗中的应用；

P7)在制备生物有机肥中的应用；

P8)在制备上述菌剂中的应用。

上述菌剂的上述P1)-P7)中的任一应用也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种含有所述的耐盐短杆菌(Brevibacteriumhalotolerans)GDSD21 CGMCC No.12402或所述菌剂的生物有机肥。

本发明的又一目的是提供一种培养耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCC No.12402的方法，包括将耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCC No.12402在用于培养短杆菌的培养基中培养的步骤。

本发明的又一目的是提供一种制备所述菌剂的方法，该方法包括如下步骤：将所述的耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCC No.12402作为活性成分，得到所述菌剂。

本发明从农田作物根际土壤中分离固氮菌，进一步筛选较高固氮酶活性的菌株，最终筛选到高效固氮菌耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCCNo.12402。本发明的耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCC No.12402的固氮酶活性极显著高于微生物肥料常用生产菌种圆褐固氮菌ACCC11103，是微生物肥料常用生产菌种圆褐固氮菌ACCC11103的固氮酶活性的3.7倍，在改良土壤、提高土壤肥力、生荒地生态修复、蔬菜工厂化育苗接种剂、固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。

保藏说明

菌种名称：耐盐短杆菌

拉丁名：(Brevibacterium halotolerans)

菌株编号：GDSD21

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2016年4月25日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.12402

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的培养基如下：

固氮菌富集培养液ACCC55：蔗糖10g、K₂HPO₄·3H₂O 0.5g、NaCl 0.2g、CaCO₃ 1g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、用蒸馏水定容至1000ml、pH 7.0～7.2。

无氮液体培养基：溶质及其浓度为蔗糖10g/L，NaCl 0.12g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.5g/L，CaCO₃ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L；溶剂为蒸馏水；pH 7.2。

无氮固体培养基：在无氮液体培养基中加入琼脂，至琼脂的含量为15-20g/L。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂15-20g，用蒸馏水定容至1000ml，pH7.2。

改良固氮培养基：蔗糖10g、K₂HPO₄·3H₂O 0.5g、NaCl 0.2g、CaCO₃ 1g、MgSO₄·7H₂O0.2g、酵母膏0.5g、蒸馏水1000ml、琼脂15-20g，pH 7.0～7.2。

改良固氮液体培养基：与改良固氮培养基的区别仅在于不含琼脂。

下述实施例中所用的圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)ACCC11103(参见“孙建光等.高效固氮芽孢杆菌筛选及其生物学特性.中国农业科学，2009,42(6):2043-2051”)。公众可从中国农业科学院农业资源与农业区划研究所获得该菌株，以重复本申请的实验。

实施例1、耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCC No.12402的分离与鉴定

一、作物根际固氮菌GDSD21的富集与分离

取10g土样(采自中国黑龙江省绥化水稻田)放入90mL无菌水中摇床振荡20min制成混浊液，吸取5mL放入30mL固氮菌富集培养液ACCC55中，100rpm，28℃进行摇床振荡培养，72h后换新鲜培养液继续培养。重复培养3次后进行固氮菌分离。吸取1mL上述固氮菌富集培养物放到9mL无菌水中制成10^-1稀释度，继续稀释制成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5稀释度的菌悬液，每个稀释度取0.1mL涂布在无氮固体培养基平板上，29℃静置培养。2～3d待菌落形成后，在改良固氮培养基平板上用平板划线法进行菌种纯化，分离得到作物根际固氮菌GDSD21。

二、作物根际固氮菌GDSD21的鉴定

从以下几个方面鉴定步骤一分离纯化并筛选得到的作物根际固氮菌GDSD21：

1、形态学鉴定

将处于对数生长期且菌落大小稳定，上述步骤一分离并纯化得到的作物根际固氮菌GDSD21进行单菌落状态观察，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态(是否平坦、突起、褶皱、凹陷等)、菌落边缘状态(是否整齐、不规则、放射状等)。

对于处于对数生长期的所述作物根际固氮菌GDSD21，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。

结果表明，上述步骤一分离并纯化得到的作物根际固氮菌GDSD21菌落圆形凸起，乳白色，表面光滑湿润，边缘整齐；菌体短杆状；革兰氏阳性。

2、生理生化特征分析

参考《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京:科学出版社，2011.)和《微生物学实验》(沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验(第三版).北京:高等教育出版社,1999.)测定上述作物根际固氮菌GDSD21的生理生化特征。

作物根际固氮菌GDSD21的生理生化特征测定结果如下：

生长温度：4℃不生长，28℃生长，48℃生长，60℃不生长；

耐盐性试验：2％NaCl生长，5％NaCl生长，7％NaCl生长，10％NaCl不生长；

利用柠檬酸盐：阳性；

水解淀粉：阳性；

PH 5.7生长：阳性；

敏感抗生素类型：利福霉素、林肯霉素、万古霉素；

利用氨基酸类型：L-丙氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酸、L-丝氨酸、L-天冬氨酸；

糖醇发酵产酸：葡萄糖阳性，甘露醇阳性，乳糖阴性，蔗糖阳性。

3、16s rDNA序列同源性分析

常规方法培养上述步骤一分离纯化得到的作物根际固氮菌GDSD21，提取菌株的总DNA作为基因扩增模板，以细菌16s rDNA通用引物，27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492r：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR反应。反应体系采用上海生物工程有限公司PCR扩增试剂盒。反应程序为：95℃变性30s、55℃退火1min、72℃延伸2min，共30个循环。DNA测序由上海生物工程有限公司完成，序列拼接及相似性分析使用clustalx-MEGA6软件完成，基因比对通过美国国家生物技术信息中心NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)和EzTaxon在线完成。

PCR基因扩增得到作物根际固氮菌GDSD21的16S rDNA基因片段序列如序列表中序列1，与NCBI和EzTaxon数据库中已公开的16S rDNA序列进行在线同源性比对，结果显示作物根际固氮菌GDSD21与耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)DSM8802^T(AM747812)的同源性最高，达到99.93％。

4、生长特性分析

进行了作物根际固氮菌GDSD21的最适温度和最适pH生长实验。采用无氮液体培养基和无氮固体培养基，分别在4℃、28℃、48℃、60℃培养、观察、记录菌株的温度适应性，每个处理3次重复。调整pH分别为4、5、6、7、8、9、10，每个处理3次重复，培养、观察、记录菌株生长的最适pH。

结果表明，所述作物根际固氮菌GDSD21的最适生长温度为28℃，最适生长pH为pH7～8。

鉴于上述形态、生理生化特征分析和16s rDNA序列同源性分析结果，将步骤一分离纯化得到的作物根际固氮菌GDSD21鉴定为细菌域原核生物界厚壁菌门芽孢杆菌科(Bacillaceae)短杆菌属(Brevibacterium)的耐盐短杆菌(Brevibacteriumhalotolerans)。该耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21已于2016年4月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.12402。

实施例2、耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCC No.12402固氮酶活性测定

以微生物肥料常用生产菌种圆褐固氮菌ACCC11103作为对照组，实施例1的耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCC No.12402作为实验组进行固氮酶活性测定，具体方法如下：在15×150mm螺口玻璃管中加入5mL改良固氮培养基制成斜面，接种菌株，28℃培养。以不接种空白斜面为阴性对照，每个处理设3个重复。培养72h后，换橡胶塞，注入乙炔气体使终浓度为10％，用医用胶布密封，继续培养72h，取100μL反应气体，用气相色谱仪测定乙烯生成量，根据以下公式计算菌株的固氮酶活性。固氮酶活性(nmol/mg·h)＝C₂H₄nmol/[菌体蛋白量(mg)×反应时间(h)]，其中C₂H₄nmol＝1000×C₂H₄体积(μl)×273×P/[22.4×(273+t℃)×760]，其中P为气压(mm汞柱)，t为反应温度。

其中，菌体蛋白含量测定方法如下所述：用5mL生理盐水将试管斜面上的菌苔洗入离心管中，收集菌体，向菌体中加入3mL 0.5M的NaOH溶液沸水煮沸5min，加入3mL 0.5M的HCl溶液混合，离心后取上清1.0mL，加入5mL考马斯亮蓝溶液，在漩涡混合器上混合，显色3min，测定595nm处的吸光值A₅₉₅，根据牛血清白蛋白标准曲线计算菌体蛋白含量。

结果显示，耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCC No.12402的固氮酶活性为98.578±2.317nmol C₂H₄/h·mg蛋白，微生物肥料常用生产菌种圆褐固氮菌ACCC11103的固氮酶活性26.510±1.442nmol C₂H₄/h·mg蛋白，统计分析耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCC No.12402的固氮酶活性极显著高于微生物肥料常用生产菌种圆褐固氮菌ACCC11103的固氮酶活性。这一结果表明，本发明的耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCC No.12402具有很高的固氮潜能，在改良土壤、提高土壤肥力、生荒地生态修复、蔬菜工厂化育苗接种剂、固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。

实施例3、耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCC No.12402在生态修复中的应用

一、土壤生态修复菌剂制备

利用实施例1所得到的耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21CGMCC No.12402制备土壤生态修复菌剂，具体方法如下所述：采用上述改良固氮液体培养基，实验室条件下摇床培养耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCCNo.12402。1L三角瓶装量250mL，28℃、200rpm振荡培养18h～24h至OD₆₀₀达到1.5～1.8，耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCC No.12402含量达到15～20亿cfu/mL。罐装，密封，得到土壤生态修复菌剂。室温保存，用于土壤培肥田间试验。

二、生态修复现场试验

生态修复现场试验在高速公路G7河北省兴和县施工现场进行。由于修建高速公路，农田耕层土壤被剥离，高速公路护坡(坡度约50度)新土层全部为贫瘠的生荒土(有机质(％)0.435±0.2，全氮(％)0.027±0.006，碱解氮(mg/kg)0，全磷(％)0.089±0.006，有效磷(mg/kg)21.3±1.6)。生态环境恶化，急需建植恢复生态。

生态修复采用坡面挂网喷播建植。2014年5月15日进行了坡面建植和菌剂施用。播种植物为木本、草本植物混播，包括榆树、柠条、紫穗槐、刺槐、胡枝子、苜蓿、冰草、披碱草、沙打旺、波斯菊等。试验处理设：1)不施菌剂(CK0)、2)施用土壤生态修复菌剂(T1)，实验重复3次，每次重复每个试验处理面积2000m²。实验方法如下：

T1：将步骤一的土壤生态修复菌剂用无菌水1000倍稀释后喷施于坡面，用量为每600m²坡面1L。

CK0：与T1的区别仅在于用等量的无菌水替换步骤一的生态修复菌剂。

三、生态修复效果检测方法

1、土壤可培养微生物数量测定

取新鲜土样10.00g加入到带玻璃珠的90mL无菌水中，摇床振荡20min，然后无菌操作制成10¹～10⁶系列稀释梯度，取100μL土壤悬液分别接种在牛肉膏蛋白胨培养基(细菌)、马丁培养基(真菌)和高氏一号培养基(放线菌)固体平板上，细菌采用较高的稀释度，均匀涂布，3次重复，28℃培养2～5天，观察计数。

2、土壤酶活性测定

测定了试验地土壤的蔗糖酶、过氧化氢酶、脲酶、磷酸酶、纤维素酶和木聚糖酶。具体操作如下：

2.1土壤蔗糖酶活性测定(比色法)称5.0g过1mm筛风干土样于50mL三角瓶中，加1mL甲苯，混匀，静置15min，再加15mL 8％蔗糖溶液和5mL pH 5.5磷酸缓冲液，塞上棉塞，混匀，37℃温育24h。然后混匀、过滤，吸取1mL滤液于50mL容量瓶中，加入3mL 3,5-二硝基水杨酸溶液，沸水浴5min，冷水冷却3min，定容到50mL，混匀，测定508nm处的吸光度值(x)，按照标准曲线(y＝(x+0.0171)/16.08)计算葡萄糖含量。土壤蔗糖酶活性定义为：37℃、pH 5.5条件下5g风干土壤24h水解蔗糖生成葡萄糖的毫克(mg)数。

2.2土壤过氧化氢酶活性测定(容量法)称2.0g过1mm筛风干土样于150mL三角瓶中，加40mL蒸馏水、20mL 0.3％过氧化氢溶液，120r/min振荡30min，立即准确加入20mL1.5mol/L硫酸溶液，充分混合过滤。取20mL滤液置于100mL三角瓶中，用0.1mol/L高锰酸钾溶液滴定至微红色，且30sec不褪色，记录消耗体积。按照高锰酸钾溶液的标定值计算出高锰酸钾溶液的消耗量。土壤过氧化氢酶活性定义为：2g风干土壤30min分解过氧化氢的数量折和氧化分解等量过氧化氢所需0.1mol/L高锰酸钾的毫升(mL)数。

2.3土壤脲酶活性测定(靛酚蓝比色法)

试剂的配制：10％尿素溶液：称取10g尿素，用水溶至100ml。

柠檬酸盐缓冲液(PH6.7)：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾(KOH)溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/L NaOH将pH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。

苯酚钠溶液(1.35mol/L)：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml(A液)，存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水(B液)。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。

次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9％，溶液稳定。

氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液；再将此液稀释10倍(吸取10ml标准液定容至100ml)制成氮的工作液(0.01mg/ml)。

操作步骤：

称10.0g过1mm筛风干土样于150mL三角瓶中，加2mL甲苯，混匀，静置15min，加入10mL 10％尿素溶液和20mL pH6.7柠檬酸盐缓冲液，混匀，37℃温育3h，然后混匀、过滤，用38℃蒸馏水定容至100mL。取1mL滤液于50mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至20mL，加入4mL苯酚钠溶液混匀，立即加入3mL次氯酸钠溶液混匀，20min后定容至50mL，溶液呈现蓝色，测定578nm处吸光度，按照预先测定的硫酸铵标准曲线(y＝(x+0.0006)/241.14)计算出氨氮含量。土壤脲酶活性定义为：37℃、pH6.7条件下10g风干土壤3h分解尿素释放NH₃－N的毫克(mg)数。

2.4土壤磷酸酶活性测定(磷酸苯二钠比色法)

试剂的配制：

Gibbs试剂：将200mg 2，6-双溴苯醌氯酰亚胺溶于乙醇，并稀释至100mL。

硼酸盐缓冲液(pH 9.6)：

0.05mol/L硼砂溶液19.05g硼砂溶至1L。

0.2mol/L NaOH溶液8g NaOH溶至1L。

取50ml 0.05mol/L硼砂溶液加23ml 0.2mol/L NaOH溶液稀释至200ml。

操作步骤：

称10.0g过1mm筛风干土样于150mL三角瓶中，加2mL甲苯，混匀，静置15min，加入10mL 0.5％磷酸苯二钠溶液和10mL pH9.6碱性硼酸盐缓冲液，37℃温育24h，然后混匀、过滤，用38℃蒸馏水定容至100mL，充分混合过滤。取1mL滤液于100mL容量瓶中，加5mL碱性硼酸盐缓冲液，用蒸馏水稀释至25mL，加入1mL Gibbs试剂，20min后定容至100mL，溶液呈现青色，测定578nm处吸光度，按照预先测定的标准曲线(y＝(x-0.0014)/200.88)计算出酚含量。土壤磷酸酶活性定义为：37℃、pH9.6条件下10g风干土壤24h分解释放酚的毫克(mg)数。

2.5土壤纤维素酶活性测定(硝基水杨酸比色法)称10.0g过1mm筛风干土样于50mL三角瓶中，加1.5mL甲苯，混匀，静置10min，加入20mL 1％羧甲基纤维素钠溶液和5mL pH5.5磷酸盐缓冲液，塞上棉塞，混匀，37℃温育72h。用无磷滤纸过滤，取1mL滤液置于50mL容量中，加入3mL 3,5-二硝基水杨酸溶液，沸水浴5min，冷水冷却3min，定容至50mL，混匀，15min后，测定530nm处的吸光度值，按照预先测定的标准曲线(y＝(x+0.0009)/5.3571)计算葡萄糖含量。土壤纤维素酶活性定义为：37℃、pH5.5条件下10g风干土壤72h分解释放葡萄糖的毫克(mg)数。

2.6土壤木聚糖酶活性测定(硝基水杨酸比色法)

称5.0g过1mm筛风干土样于50mL三角瓶中，加1mL甲苯，混匀，静置10min，加入20mL0.5％木聚糖溶液和5mL pH 5.5的磷酸盐缓冲液，塞上棉塞，混匀，37℃温育120h。培养结束后，用无磷滤纸过滤，取1mL滤液，置于50mL容量中，加入3mL 3,5-二硝基水杨酸溶液，沸水浴5min，冷水冷却3min，定容至50mL，混匀，15min后，测定550nm处的吸光度值，按照预先测定的标准曲线(y＝(x+0.0057)/4.1605)计算还原糖含量。土壤木聚糖酶活性定义为：37℃、pH5.5条件下5g风干土壤120h分解释放还原糖的毫克(mg)数。

四、生态修复现场试验结果

1、土壤生态修复菌剂对土壤微生物数量的影响

施用步骤一的土壤生态修复菌剂3个月后，2014年8月7日进行了现场调查采样。分别采集了施用土壤生态修复菌剂处理(T1)土壤样品和不施菌剂(CK0)土壤样品，带回实验室进行分析测定(3次重复)。结果显示施用土壤生态修复菌剂对土壤中三类微生物的数量产生了影响。统计分析表明，土壤中可培养细菌总数，施用步骤一的土壤生态修复菌剂的处理极显著高于不施菌剂处理；土壤中可培养真菌总数，同样是施用步骤一的土壤生态修复菌剂的处理显著高于不施菌剂处理；土壤中可培养放线菌总数无差异(表1)。

表1生态修复试验可培养微生物检测结果

注：表中数据后上标字母表示处理间差异显著性，大写字母不同表示达到0.01差异水平，小写字母不同表示达到0.05差异水平。

2、生态修复菌剂对土壤酶活性的影响

统计分析表明，施用步骤一的土壤生态修复菌剂后，试验地土壤的蔗糖酶、过氧化氢酶、脲酶、磷酸酶、纤维素酶和木聚糖酶活性均显著或极显著地高于不施菌剂的空白处理(表2)。

表2生态修复试验土壤酶活性测定结果

上述实验结果显示出采用耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21CGMCC No.12402制成的土壤生态修复菌剂对于生荒地土壤培肥、生态修复具有显著效果。

<110> 北京东方复地环境科技有限公司中国农业科学院农业资源与农业区划研究所

<120> 一株耐盐短杆菌及其在土壤生态修复中的应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1396

<212> DNA

<213> 耐盐短杆菌（Brevibacterium halotolerans)

<400> 1

aagtcgagcg gacagatggg agcttgctcc ctgatgttag cggcggacgg gtgagtaaca 60

cgtgggtaac ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa accggggcta ataccggatg 120

cttgtttgaa ccgcatggtt caaacataaa aggtggcttc ggctaccact tacagatgga 180

cccgcggcgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc aaggcaacga tgcgtagccg 240

acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc 300

agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg agcaacgccg cgtgagtgat 360

gaaggttttc ggatcgtaaa gctctgttgt tagggaagaa caagtaccgt tcgaataggg 420

cggtaccttg acggtaccta accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt 480

aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt aaagggctcg caggcggttc 540

cttaagtctg atgtgaaagc ccccggctca accggggagg gtcattggaa actggggaac 600

ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca cgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatgtgg 660

aggaacacca gtggcgaagg cgactctctg gtctgtaact gacgctgagg agcgaaagcg 720

tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaagt 780

gttagggggt ttccgcccct tagtgctgca gctaacgcat taagcactcc gcctggggag 840

tacggtcgca agactgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat 900

gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct ctgacaatcc 960

tagagatagg acgtcccctt cgggggcaga gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct 1020

cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgatc ttagttgcca 1080

gcattcagtt gggcactcta aggtgactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga 1140

cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gacagaacaa 1200

agggcagcga aaccgcgagg ttaagccaat cccacaaatc tgttctcagt tcggatcgca 1260

gtctgcaact cgactgcgtg aagctggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg 1320

tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc 1380

gaagtcggtg aggtaa 1396

Claims

1.耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.12402。

2.一种菌剂，含有权利要求1所述的耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCC No.12402。

3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂为下述1)-5)中任一菌剂：

1)用于固氮的菌剂；

2)产生固氮酶的菌剂；

3)促进植物生长的菌剂；

4)改良培肥土壤的菌剂；

5)修复土壤的菌剂。

4.权利要求1所述的耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCCNo.12402的下述P1)-P8)中的任一应用：

P1)在固氮中的应用；

P2)在生产固氮酶中的应用；

P3)在促进植物生长中的应用；

P4)在改良培肥土壤中的应用；

P5)在修复土壤中的应用；

P6)在蔬菜工厂化育苗中的应用；

P7)在制备生物有机肥中的应用；

P8)在制备权利要求2或3所述的菌剂中的应用。

5.权利要求2或3所述的菌剂的下述P1)-P7)中的任一应用：

P1)在固氮中的应用；

P2)在生产固氮酶中的应用；

P3)在促进植物生长中的应用；

P4)在改良培肥土壤中的应用；

P5)在修复土壤中的应用；

P6)在蔬菜工厂化育苗中的应用；

P7)在制备生物有机肥中的应用。

6.含有权利要求1所述的耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCCNo.12402的生物有机肥。

7.含有权利要求2或3所述的菌剂的生物有机肥。

8.培养权利要求1所述耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCCNo.12402的方法，包括将耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCCNo.12402在用于培养短杆菌的培养基中培养的步骤。

9.权利要求2或3所述菌剂的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的耐盐短杆菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCC No.12402作为活性成分，得到所述菌剂。