CN108496616A - 一种促进土壤杆菌在植物根际定植的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用信号分子葡萄糖酸促进土壤杆菌在植物根际定殖的方法。本发明从植物根系分泌物中筛选出一种促进土壤杆菌（Agrobacterium sp.）在植物根际定殖的信号分子‑葡萄糖酸，利用其与土壤杆菌（Agrobacteriumsp.）T29共同作用时，可显著促进土壤杆菌（Agrobacteriumsp.）T29在根际繁殖，增加对根际土壤矿物钾、磷养分活化，以及对难溶态重金属镉的活化，有效地提高植物对土壤难溶态矿物钾、磷养分的效率，以及对难溶态重金属镉的提取修复效率，具有较大的应用前景。

Description

一种促进土壤杆菌在植物根际定植的方法

技术领域

本发明涉及土壤污染生物处理技术领域，更具体地，涉及一种促进土壤杆菌在植物根际定植的方法。

背景技术

我国农田土壤重金属污染严重，其中镉是主要污染物。镉超富集植物提取是土壤重金属修复最具前景的技术途径之一。然而这些超富集植物对弱酸性或中性土壤镉的富集系数比酸性土壤大幅度下降，提取效率低，限制了它们的实际工程应用。采用根际促生菌活化土壤镉和矿质养分，不仅可以促进植物镉吸收，而且可以给修复植物提供矿质养分。

促生菌的根际定殖能力是决定其发挥功能的重要因素。促生菌在植物根际的定殖能力对根际土壤镉和矿质养分活化起着非常重要的作用。已有报道发现，在实验室内表现出溶磷能力的溶磷菌株应用到盆栽试验后并不一定显著增加植物的磷吸收量和生物量。仅仅根据实验室溶磷能力筛选到的溶磷菌接种到作物后未必能促进作物对磷的活化。促生菌在作物根际的定殖能力不强、难以形成优势菌群，导致肥效不高，正是目前微生物肥料难以普及推广的技术瓶颈。

已有报到，作为信号分子，黄酮类是吸引根瘤菌到根表并调控其nod基因表达的信号物质。西红柿根释放柠檬酸和富马酸吸引荧光假单胞菌根际定殖。拟南芥根系分泌苹果酸能选择性定殖枯草芽孢杆菌，而对其它6种菌却无定殖作用。豆科植物红三叶草能分泌酚类物质，刺激铁载体分泌菌生长，抑制根际中其他微生物生长。西瓜根系分泌的苹果酸和柠檬酸诱导了多粘类芽孢杆菌在根际定殖。西红柿根系分泌物苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸显著导致解淀粉芽孢杆菌的趋化作用和群游效应。

而现有技术中，利用葡萄糖酸作为信号分子诱导根际促生菌土壤杆菌（Agrobacterium sp）在植物根际定殖的研究未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种促进土壤杆菌在植物根际定植的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

本发明首先保护葡萄糖酸在促进土壤杆菌（Agrobacterium sp.）在植物根际定植中的应用。

本发明人研究发现，葡萄糖酸对土壤杆菌（Agrobacterium sp.）有较强的趋化和群游作用，在植物根际添加葡萄糖酸后，植物根部吸收的菌落数目显著增加，表明葡萄糖酸可促进土壤杆菌（Agrobacterium sp.）在植物根际定植。

优选地，所述土壤杆菌为土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29，该菌株于2018年1月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），菌种保藏编号为GDMCC No：60321。所述菌株为本发明人团队从受重金属镉污染的苋菜根际土壤中分离得到的，所述菌株于2018年1月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号为GDMCC No：60321，分类命名号为Agrobacterium sp. T29；保藏地址为中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。所述土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29可高效活化矿质元素钾和磷以及重金属镉；在根际活化土壤矿物养分，促进植物生长的同时，能够有效溶解土壤镉，有效提高超累积植物修复土壤重金属镉的效率。

同时，葡萄糖酸在制备促进土壤杆菌（Agrobacterium sp.）在植物根际定植的制剂中的应用亦在本发明保护范围内。

一种促进壤杆菌（Agrobacterium sp.）在植物根际定植的制剂，所述制剂包含葡萄糖酸。

优选地，所述葡萄糖酸的浓度为30µm/L。

一种促进土壤杆菌（Agrobacterium sp.）在植物根际定植的方法，所述方法为直接向植物根际处添加葡萄糖酸。

优选地，为先将土壤杆菌（Agrobacteriumsp.）T29直接接种到植物根际，再在根际添加葡萄糖酸。

优选地，所述葡萄糖酸的浓度为30µm/L，添加量为1～5mL/kg。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种利用信号分子-葡萄糖酸促进土壤杆菌在根际定殖的方法，本发明发现葡萄糖酸能够促进土壤杆菌在植物根际定植，当葡萄糖酸与土壤杆菌（Agrobacteriumsp.）T29共同作用时，可显著促进土壤杆菌（Agrobacteriumsp.）T29在根际繁殖，增加对根际土壤矿物钾、磷养分活化，以及对难溶态重金属镉的活化，有效地提高植物对土壤难溶态矿物钾、磷养分的效率，以及对难溶态重金属镉的提取修复效率，具有较大的应用前景。

具体实施方式

以下具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

以下用土壤杆菌T29为具体的目标菌株研究葡萄糖酸在土壤杆菌根际定植中的作用。

所述土壤杆菌T29为本发明人团队从受重金属镉污染的苋菜根际土壤中分离得到的，所述菌株于2018年1月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号为GDMCCNo：60321，分类命名号为Agrobacterium sp. T29；保藏地址为中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。所述土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29可高效活化矿质元素钾和磷，和重金属镉；在根际活化土壤矿物养分，促进植物生长的同时，能够有效溶解土壤镉，有效提高超累积植物修复土壤重金属镉的效率。

实施例1 信号分子对土壤杆菌T29的趋化作用

发明人在前期研究的基础上拟进一步研究以下几种有机酸：乳酸、反丁烯二酸、甲酸、甘氨酸、丙氨酸、柠檬酸、乙酸、丙酸、草酸、谷氨酸、亮氨酸、葡萄糖酸、组氨酸对土壤杆菌在植物根际定植的影响。主要方法为：

1、用移液枪和注射器分别吸取100μL土壤杆菌T29菌液和200μL 30 μm/L的有机酸溶液，对照为无菌水。将注射器插入移液器枪头后，静置于超净台2 h，取出注射器中的有机酸溶液并用无菌水稀释10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶倍，涂布至LB培养基,设置3个平行，放置于生化培养箱中，28 ℃培养2 d，计算3个平行的平均值并将其作为每个处理对T29趋化作用的影响。

2、通过对不同有机酸诱导下菌株T29趋化作用得到的菌落数作单因素方差分析，可以看出在α=0.05水平下，乳酸、反丁烯二酸、甲酸、甘氨酸、丙氨酸、柠檬酸、乙酸、丙酸、草酸、谷氨酸、亮氨酸、葡萄糖酸、组氨酸吸引的菌落数与水相比有显著差异，其中乳酸、反丁烯二酸、甲酸、甘氨酸、丙氨酸、柠檬酸、乙酸、丙酸、草酸吸引的菌落数与水相比显著减少，呈现负趋化作用。而谷氨酸、亮氨酸、葡萄糖酸、组氨酸吸引的菌落数与水相比显著增强，相比水分别增加了54.7%、104.2%、130.5%、143.1%，呈现正趋化作用。其中葡萄糖酸、组氨酸的趋化作用最强。

实施例2 信号分子对土壤杆菌T29的群游作用

1、针对实施例1趋化实验筛选得到的呈现正趋化作用最强的谷氨酸、亮氨酸、葡萄糖酸、组氨酸4种有机酸。配制含30 μm/L有机酸（空白为无菌水）的LB固体培养基，放置8 mm的无菌滤纸片于固体培养基的中心并吸取5 μL菌悬液于滤纸片中央。设置3个平行，后放置于生化培养箱中于28 ℃培养4 d，从3个不同方向测量直径，计算3个平行的平均值并将其作为每个处理对T29群游作用的影响。

2、在α=0.05水平下，谷氨酸、亮氨酸、葡萄糖酸、组氨酸诱导下T29的菌落直径与水相比都具有显著差异，并且都显著大于水诱导下的菌落直径，其中组氨酸、谷氨酸、亮氨酸、葡萄糖酸诱导下的菌落直径分别为1.66mm、1.67mm、1.82mm、2.18mm。相比水增加17.7%、18.4%、29.1%、54.6%。其中葡萄糖酸对土壤杆菌T29具有最强的群游作用。

实施例3 葡萄糖酸对土壤杆菌T29在植物根体外的诱导作用

1、选择对土壤杆菌T29具有最强群游作用的葡萄糖酸进行体外诱导实验。发明人课题组前期盐地碱蓬的根系分泌物测定表明其不能分泌葡萄糖酸，为了避免根系分泌的葡萄糖酸干扰实验，故采用盐地碱蓬进行该实验。配制1/4浓度的全霍格兰营养液，每个组培瓶加入50 mL营养液与1%的琼脂制成固体培养基。将植物盐地碱蓬种子用2%次氯酸钠溶液浸泡30 min，放置于组培瓶中心处，培养2 d。待长出嫩叶后，吸取10 μL菌液于距植物根部2 mm处，并添加20 μL的 30μm/L葡萄糖酸溶液（空白为无菌水）在植物根表面处，培养2周后，收集盐地碱蓬，剪掉根部，用无菌水洗涤根组织表面，称重，放入离心管中并加入1 mL无菌水于组织破碎仪中涡旋5 min，用无菌水稀释10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶倍，涂布至LB培养基，设置3个平行，后放置于生化培养箱中，28 ℃培养4 d，计算3个平行的平均值并将其作为每个处理对T29体外作用的影响。

2、在添加了葡萄糖酸在盐地碱蓬根表之后，根部吸引的菌落数目显著高于水的作用（p＜0.01），达到了6.22×10^5个g^-1，为对照的72.1倍。

实施例4 葡萄糖酸诱导土壤杆菌T29活化盐地碱蓬根际土壤镉的能力测定

1、课题组前期研究表明盐地碱蓬是对活性Cd富集能力强、生物量大的修复植物，而且不分泌葡萄糖酸，故采用该植物作为实验材料。实验土壤采自受Cd污染农田土。土壤基本理化性质：pH 6.28，TOC:35.39 g∙kg^-1，有效磷含量95 mg∙kg^-1，CEC:20.90 cmol∙kg^-1，总Cd含量为1.37 mg∙kg^-1，其中可交换态Cd 0.46mg·kg^-1；碳酸盐结合态Cd 0.21 mg·kg^-1；铁锰氧化物结合态Cd 0.54 mg·kg^-1；有机碳结合态Cd 0.08 mg·kg^-1；残渣态Cd 0.08 mg·kg^-1。将土壤采集后置于玻璃温室中自然晒干，敲碎混匀备用。

2、对盐地碱蓬种子进行消毒。消毒后的种子种到沙培中育苗，置于光照培养箱中培养，设置温度为：28℃（白天）/22℃（黑夜）。盆栽试验在暨南大学玻璃温室中进行，选取尺寸为180×210cm的塑料盆，每盆装土1500g，去离子水浇透盆中土壤，放置过夜。待种子长出3-5片真叶后移出洗净根部，在土壤杆菌T29菌种重悬液中浸泡2h然后移栽到土壤，每盆3株，并将菌液按30 mL·pot^-1浇入根区周围，覆土。随后在植物根部添加3mL浓度为30 µm/L葡萄糖酸。置于温室中培养，土壤定期浇水保持湿润，待生长至60天收获植株。消解后用原子吸收光谱测定盐地碱蓬植物体内镉含量。

结果表明，添加葡萄糖酸的植物地上部和根部吸收的镉含量分别比不添加葡萄糖酸的对照增加55.1%和62.5%。

实施例5 葡萄糖酸诱导土壤杆菌T29活化生菜根际土壤矿物钾、磷的能力测定

选取饱满的生菜种子于2%的次氯酸钠消毒，播种于石英砂中并置于植物培养箱中，设定参数为白天（25 ℃/16 h），黑夜（18 ℃/8 h）。实验采用石英砂培，钾源采用难溶钾矿物钾长石，磷源采用难溶磷矿物磷酸钙，其它养分采用不含钾、磷的霍格兰营养液。长出嫩叶后移栽，将幼苗在土壤杆菌T29菌种重悬液中浸泡2h然后移栽到至塑料盆里，每盆4株，并将菌液按30 mL·pot^-1浇入根区周围，覆土。随后在植物根部添加3mL浓度为30 µm/L葡萄糖酸。设置不加葡萄糖酸为对照，定期浇不含钾、磷的霍格兰营养液，60 d后收获，测量株高及根、茎叶的干重。收集根际土经6000 r/min离心得到根际溶液，采用火焰原子吸收光谱仪和可见分光光度计分别测定钾和磷的含量。

结果显示，根际溶液溶解态磷比对照增加48.3%，溶解态钾比对照增加56.4%。表明葡萄糖酸可促进土壤杆菌T29在植物根系定植，提高溶磷溶钾率。

Claims (6)

1. 葡萄糖酸在促进土壤杆菌（Agrobacterium sp.）在植物根际定植中的应用。

2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述土壤杆菌为土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T29，该菌株于2018年1月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），菌种保藏编号为GDMCC No：60321。

3. 葡萄糖酸在制备促进土壤杆菌（Agrobacterium sp.）在植物根际定植的制剂中的应用。

4. 一种促进壤杆菌（Agrobacterium sp.）在植物根际定植的制剂，其特征在于，所述制剂包含葡萄糖酸。

5. 一种促进土壤杆菌（Agrobacterium sp.）在植物根际定植的方法，其特征在于，向植物根际处添加葡萄糖酸。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖酸的浓度为30µm/L，添加量为1～5mL/kg。