CN101451112A - 一种防治果树根癌病的土壤杆菌及其菌剂和制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种葡萄土壤杆菌菌株AE206，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC No.2408。本发明还公开了一种微生物菌剂及其制备方法，该菌剂中的活性成分为AE206菌体及其胞外代谢产物。本发明葡萄土壤杆菌AE206对葡萄根癌病防治效果好，而且抑菌谱广，对桃树根癌病和樱桃根癌病有较好的防效；此外，本发明微生物菌剂属于生物制剂，具有无污染、无公害、低成本等特点。
Description
技术领域
本发明属于农业微生物领域，具体地说涉及一种防治果树根癌病的土壤杆菌及利用该土壤杆菌生产的微生物菌剂、制备方法和应用。
背景技术
葡萄、樱桃和桃等果树的根癌病在我国许多地区的果园和苗圃均有不同程度的发生，其中辽宁、内蒙古、北京、河北、河南、山东、山西、湖北、浙江和上海等地病害发生严重。一些苗圃园、果园的发病率在60％以上，严重影响苗木质量，造成成苗率和成株率明显降低，即使成株，也长势衰弱，果实产量和品质显著下降，损失达30～70％，严重时甚至毁园、绝收，造成重大经济损失。因此，控制果树根癌病的危害是果树生产上亟待解决的问题。
根癌细菌是典型的土壤习居菌，在土壤中能长期存活且致病机制特殊，当病原菌从植物伤口侵入后，其Ti质粒上的T-DNA的致瘤基因可以进入植物细胞，并整合到染色体DNA上，致瘤基因在植物体内的表达引起根癌瘤的形成。因此，其防治极其困难，应用抗病品种、化学药剂和农业措施等一般防治方法都不能达到理想的防治效果。
二十世纪七十年代澳大利亚的Kerr发现放射土壤杆菌K84菌株，使得根癌病的防治出现重大突破，此后，应用K84对根癌病进行生物防治取得了显著成效。但是，K84只对含胭脂碱型或农杆菌素A型Ti质粒的根癌土壤杆菌(Agrobacteriun tumefaciens)和发根土壤杆菌(A.rhizogenes)的根癌病菌有效，对葡萄土壤杆菌(A.vitis)中的致病菌引起的葡萄根癌病没有防效。因此，寻找其他生防菌株已成为解决葡萄根癌病防治困难的主要手段。目前，国内外已有一些无致病性的土壤杆菌(Agrobac terium)、假单胞杆菌(Pseudomonas)、芽孢杆菌(Bacillus)和拉恩氏菌(Rahnella)防治葡萄根癌病的研究报道，但是，尚未见在生产上应用的报道。
发明内容
本发明第一个目的是提供一种防治葡萄、樱桃和桃等果树根癌病的葡萄土壤杆菌菌株。
本发明第二个目的是提供一种利用上述葡萄土壤杆菌生产的微生物菌剂。
本发明第三个目的是提供上述微生物菌剂的制备方法。
本发明第四个目的是提供了本发明葡萄土壤杆菌及其菌剂在防治葡萄、樱桃和桃等果树根癌病上的用途。
本发明通过以下技术方案实现：
一种葡萄土壤杆菌菌株AE206，属于土壤杆菌属葡萄土壤杆菌种(Agrobacteriun vitis)，已于2008年3月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC No.2408。
一种微生物菌剂，其活性成分为葡萄土壤杆菌AE206菌体及其胞外代谢产物。
上述微生物菌剂可以为液体制剂或固体制剂。
上述微生物菌剂中所述的液体制剂，其组成成分及其比例为：黄原胶0.2～0.5％g/L，甲基纤维素0.5～1.0g/L，AE206发酵液为余量。
上述微生物菌剂中所述的液体制剂的制备方法，就是按照比例将黄原胶和甲基纤维素加入到AE206发酵液中，混和均匀即可。
上述微生物菌剂中所述的固体制剂，按照如下方法制备：按照重量份数比1：3～5的比例将AE206发酵液与固体填充物混合，然后遮荫风干使混合物含水量为10～30％，即制成固体制剂。
所述的固体填充物，其组成成份及其重量百分比为：黄原胶0.1～0.4％、甲基纤维素0.1～0.4％、草炭土99.2～99.8％。
所述的固体填充物的制备方法，就是按照比例将黄原胶、甲基纤维素加到草炭土中，混和均匀即可。
上述AE206发酵液中AE206菌体浓度达到109cfu/ml以上。
上述AE206发酵液，按照如下方法制备：
(1)菌种活化：将-20℃～4℃保存的AE206菌株在LB平板培养基上划线，在25～33℃培养24～72小时，挑取单菌落在LB斜面培养基上划线，在25～33℃培养24～72小时，得活化的AE206菌株；
(2)摇瓶培养：将步骤(1)活化的AE206菌株接种到灭菌后的培养液中，在25～33℃、pH值为6.5～8.0条件下摇床培养24～72小时，得AE206菌液；其中所述的培养液的组成成分及其比例为：蔗糖0.1～1.0％、蛋白胨0.1～1.0％、牛肉膏0.1～1.0％、酵母粉0.05～0.02％、MgSO4 0.01～0.1％、其余为水；
(3)按照1～10％体积比将步骤(2)所得AE206菌液置于灭菌后的种子培养液中，在25～33℃、pH值为6.5～8.0、通气量为0.5～1.0V/Vmin、搅拌速度为200～300rpm条件下培养24～48小时，得AE206种子液；所述种子培养液的组成成分及重量百分比为：蔗糖1.5～4.0％、谷氨酸钠0.1～1.0％、酵母膏0.1～1.0％、(NH4)2SO4 0.1～0.5％、K2HPO4 0.1～0.5％、NaH2PO4 0.05～0.2％、MgSO40.01～0.05％、KCl 0.01～0.05％、泡敌0.01～0.02％、其余为水；
(4)按照1～8％体积比将步骤(3)所得AE206种子液置于灭菌后的发酵培养液中，然后在25～33℃、pH值为6.5～8.0、通气量为0.5～1.0V/V min、搅拌速度为200～300rpm条件下发酵培养24～48小时，得AE206发酵液；其中所述的发酵培养液的组成成份及其重量百分比为：白糖1.0～4.0％、味精0.1～1.0％、玉米浆1.0～5.0％、(NH4)2SO4 0.1～0.5％、K2HPO4 0.1～0.5％、NaH2PO40.05～0.2％、MgSO4 0.01～0.05％、KCl 0.01～0.05％、泡敌0.01～0.02％、其余为水。
上述发酵液中所述的LB培养基的组成成分及其制备方法可见《分子克隆实验指南》(第二版，科学出版社，1996，萨母布鲁克等编著，金雁冬等译)。
上述制备方法中所述的通气量是指每分钟通入反应罐中的空气体积与反应罐中液体的体积比。
上述微生物菌剂的液体制剂，其中含有葡萄土壤杆菌AE206的活菌数大于2×109cfu/ml。
上述微生物菌剂的固体制剂，其中含有葡萄土壤杆菌AE206的活菌数大于2×108cfu/g。
上述葡萄土壤杆菌AE206在防治葡萄、樱桃和桃等果树的根癌病害上的应用。
上述微生物菌剂在防治葡萄、樱桃和桃等果树的根癌病害上的应用。
本发明的微生物菌剂液体制剂使用方法：用该制剂的10倍水液按种子量的30％进行拌种、育苗；在树苗移栽时应用该制剂的10倍水液蘸根；插条在定植时应用该制剂的10倍水液蘸根；即可以达到控制预防果树根癌病的目的。
本发明的微生物菌剂固体制剂使用方法如下：将该固体制剂和水按重量比1：2进行混合均匀，按种子重量的30％进行均匀拌种后拌种、育苗；在树苗移栽时用该固体制剂的2倍水液蘸根；插条在定植时用该固体制剂的2倍水液蘸根即可。
葡萄土壤杆菌AE206菌株的分离筛选方法与过程：
AE206菌株是从北京郊区的一个种植多年的葡萄园土壤中分离得到的。具体方法如下：从北京郊区葡萄园中采集土样，取10g加入装90ml无菌水的三角瓶中，在26℃、150rpm下摇床震荡15～20min，静置10min后，取0.5ml加入4.5ml无菌水中，再依次以10倍稀释，分别取各个稀释度的土壤悬浮液100μl在NA培养基(牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，琼脂15g/L，pH7.0-7.2)平板上均匀涂板，在28℃培养36h，用无菌牙签挑取细菌单菌落划线纯化后，以葡萄根癌病菌(Agrobacteriun vitis)为靶标菌，利用双层培养法进行抑菌的初步筛选，发现有17个细菌菌株对葡萄根癌病菌的生长具有较强的抑制作用。从中筛选出1个对葡萄根癌病菌的生长具有最强抑制作用的菌株，定名为AE206。
AE206菌株的特征：
(1)形态特征 在NA培养基(牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，琼脂15g/L，pH＝7.0-7.2)上培养菌体为短杆状，鞭毛周生，革兰氏染色反应为阴性；菌落圆形，白色，突起，表面湿润、有光泽、边缘整齐，不产生色素。在土壤杆菌选择性培养基MW培养基(马德钦等，1985。甘露醇10g/L，NaNO35g/L，KH2PO4 0.3g/L，NaCl 0.2g/L，MgSO4· 0.1g/L，生物素100μg/L，Fe-EDTA 0.2g/L，琼脂18g/L，结晶紫0.2g/L，，pH7.0-7.2)培养菌落呈圆形，乳白色，突起，表面湿润、有光泽、有粘液，边缘整齐，不产生色素。
(2)生理生化特征根据《植物病原细菌鉴定实验指导》(N.W.Schaad主编，张克勤等译，1986年)，将AE206菌株与三种土壤杆菌的标准菌株：根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtume facience IAM12048)、发根土壤杆菌(Agrobacteriumrhizogenes IAM13570)、葡萄土壤杆菌(Agrobacterium vitis IAM14140)(均由日本东京大学应用微生物所提供)，在相同的实验条件下进行生理生化性状检测。结果(见表1)AE206菌株的生理生化特征与葡萄土壤杆菌标准菌株IAM14140相同，说明AE206菌株属于葡萄土壤杆菌种。
表1.AE206菌株生理生化测验结果
注：“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应。
(3)16SrDNA序列分析
用扩增细菌16SrDNA的通用引物63F(5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’)和1494R(5’-GGYTACCTTGTTACGACTT-3’)，以AE206的基因组DNA为模板，PCR扩增16SrDNA，并进行测序，结果见序列表1。将得到的16SrDNA全序列，在GenBank中通过BLAST进行同源性比较，结果AE206菌株的16SrDNA与Agrobacteriunvitis的同源性达到98％以上。说明AE206菌株属于土壤杆菌属的葡萄土壤杆菌(Agrobacterium vitis)。
细菌常规鉴定手册(《一般细菌常用鉴定方法》等)和《植物病原细菌鉴定实验指导》显示土壤杆菌属细菌菌体为杆状，鞭毛周生，能运动，革兰氏染色反应为阴性，不形成芽孢；菌落圆形、突起、表面有光泽、边缘整齐，不产生色素；接触酶反应阳性，氧化酶反应一般为阳性，从葡萄糖、木糖、果糖、乳糖和甘露醇产酸，不水解淀粉，能利用多种简单的碳水化合物作为碳源，不能利用纤维素、淀粉、琼脂和几丁质等特点。将以上AE206菌株的部分生理生化性状检测结果与三种土壤杆菌的标准菌株相比教，根据《一般细菌常用鉴定方法》(中国科学院微生物研究所细菌分类组编著，科学出版社，1978年)和《植物病原细菌鉴定实验指导》(N.W.Schaad主编，张克勤等译，1986年)的检索表进行检索，确定AE206菌株的生理生化性状与葡萄土壤杆菌相应性状完全吻合。
综合上述形态学特征、生理生化性状检测及16SrDNA序列分析鉴定，AE206菌株为土壤杆菌属(Agrobacterium)葡萄土壤杆菌(Agrobacterium vitis)。
本发明葡萄土壤杆菌AE206菌株对葡萄根癌病菌、樱桃根癌病菌和桃树根癌病菌等3种病原细菌有明显的抑制作用，表现了较广的抑菌谱。
本发明葡萄土壤杆菌AE206菌株对8种作物：小麦、玉米、棉花、马铃薯、烟草、黄瓜、大豆和向日葵没有伤害作用，表现对作物安全。
本发明具有的优点和有益效果：(1)本发明葡萄土壤杆菌AE206对葡萄根癌病防治效果高，其防效可达75.4～81.7％；(2)本发明葡萄土壤杆菌AE206抑菌谱广，本发明还对桃树根癌病和樱桃根癌病有较高的防效，其防效分别达66.2～70.1％和64.3～75.8％；(3)本发明菌剂无污染、无公害、低成本、便于大面积推广应用。
具体实施方式
下面以具体实施例来进一步清楚地解释本发明，但是不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1
AE206发酵液的制备，包括如下步骤：
(1)菌种活化：将保存于-20℃的AE206菌株在LB平板培养基上划线在28℃下培养24小时，然后挑取单菌落于LB斜面培养基上在28℃下培养24小时，备用。
(2)摇瓶培养：按照0.03％重量百分比为将步骤(1)所得AE206菌种置于培养液(培养液的组成成分及其重量百分比为：蔗糖0.8％，蛋白胨0.5％，牛肉膏0.5％、酵母粉0.1％、MgSO4 0.05％，其余为水)中，在28℃、pH值为7.0条件下摇床培养2天，得AE206菌液；
(3)按照5％体积比将步骤(1)所得AE206菌液置于种子培养液(种子培养液的组成成分及重量百分比为：蔗糖2.0％、谷氨酸钠0.5％、酵母膏0.5％、(NH4)2SO4 0.3％、K2HPO4 0.3％、NaH2PO4 0.1％、MgSO4 0.03％、KCl 0.02％、泡敌0.015％，其余为水)中，在28℃、pH值为7.0条件下培养36小时，得AE206种子液；
(4)按照3％体积比将步骤(2)所得种子液置于发酵培养液(发酵培养液的组成成份及其重量百分比为：白糖2.0％、味精0.5％、玉米浆2.5％、(NH4)2SO40.2％、K2HPO4 0.3％、NaH2PO4 0.1％、MgSO4 0.03％、KCl 0.02％、泡敌0.015％、其余为水)中在28℃、pH值为7.0条件下发酵培养36小时，得AE206发酵液；
实施例2
AE206液体制剂的制备，包括下列步骤：
取实施例1制备的AE206发酵液置于容器中，然后按照黄原胶0.3g/L、甲基纤维素0.8g/L的比例将黄原胶和甲基纤维素加入AE206发酵液中，混和均匀即可。
实施例3
AE206固体制剂的制备，包括下列步骤：
将实施例1制备的AE206发酵液按照重量份数比1：4的比例与固体填充物(固体填充物由草炭土、黄原胶和甲基纤维素按下述重量百分比混合而成：草炭土99.4％、黄原胶0.3％、甲基纤维素0.3％)混合，然后遮荫风干使混合物含水量为20％，即制成固体制剂。
实施例4
AE206菌剂对葡萄根癌病的防治试验
本实验2005～2006年在中国农业大学科学园的试验地进行，选用葡萄土壤杆菌K308菌株为致病病原菌，该菌株为葡萄根癌病病原菌，由澳大利亚的Kerr教授提供。葡萄植株选用感病品种玫瑰香葡萄，由河北省昌黎果树研究所提供。试验小区采用随机区组排列，试验包括AE206菌剂液体制剂和固体液体制剂两种处理，每种处理重复3次，小区完全随机排列，每小区60个植株。选用一年生含2-3个节的葡萄扦插条，将根部稍加修剪以形成伤口，用无菌水洗净。将实施例2所得AE206菌剂液体制剂用水稀释10倍(含菌体108CFU/mL)与病原菌K308培养液(将K308菌株接种于LB液体培养基中28℃摇床培养18小时至菌量为108CFU/mL)以体积比1∶1混合后，将上述葡萄扦插条根部浸入混合液，20分钟后取出栽种；将实施例3所得AE206菌剂固体制剂用水稀释2倍(含菌体108CFU/mL)与病原菌K308培养液(将K308菌株接种于LB液体培养基中28℃摇床培养18小时至菌量为108CFU/mL)以体积比1∶1混合后，将上述葡萄扦插条根部浸入混合液，20分钟后取出栽种。以单独接种K308菌株培养液为对照。栽种后植株按照生产上的实际情况进行常规的水肥管理，生长约7个月(4月中旬-11月中旬)后，挖出，检查植株根颈部肿瘤的形成情况，按照下列公式统计植株发病率、计算防效。
发病率(％)＝(长瘤的植株数量+死亡的植株数量)÷栽种的植株总数×100
防效(％)＝(对照发病率-处理发病率)÷对照发病率×100
结果表明(见表2)，在人工接种病原菌时，葡萄土壤杆菌AE206菌株液体制剂和固体制剂均对葡萄根癌病有良好的防治效果，防效分别达到75.4％和77.3％。
表2.AE206菌剂对葡萄根癌病的防治试验结果
| 处理 | 发病率(％) | 防效(％) |
| CK(病菌K308) | 91.5 A | / |
| AE206液体制剂 | 22.5 B | 75.4A |
| AE206固体制剂 | 20.7 B | 77.3A |
实施例5
AE206菌剂对葡萄根癌病的防治试验
本实验2005～2007年在在河北省昌黎林宇种苗基地进行。在已应用12年的根癌病危害严重的重茬葡萄苗圃进行试验。葡萄植株选用感病品种玫瑰香葡萄，由河北省昌黎林宇种苗基地提供。试验小区采用随机区组排列，每种处理重复3次，小区完全随机排列，每小区80个植株。选用一年生含2～3个节的葡萄扦插条，将根部稍加修剪以形成伤口，用无菌水洗净。将实施例2所得AE206菌剂液体制剂用水稀释10倍(含菌体108CFU/mL)，将上述葡萄扦插条根部浸入，20分钟后取出栽种；将实施例3所得AE206菌剂固体制剂用水稀释2倍(含菌体108CFU/mL)，将上述葡萄扦插条根部浸入，20分钟后取出栽种；以清水处理为对照。栽种后植株按照生产上的实际情况进行常规的水肥管理，生长约7个月(4月中旬-11月中旬)后，挖出，检查植株根颈部肿瘤的形成情况，按照下列公式统计植株发病率、计算防效。
发病率(％)＝(长瘤的植株数量+死亡的植株数量)÷栽种的植株总数×100
防效(％)＝(对照发病率-处理发病率)÷对照发病率×100
结果表明(见表3)，在根癌病危害严重的重茬葡萄苗圃，葡萄土壤杆菌AE206菌株液体制剂和固体制剂均对葡萄根癌病有良好的防治效果，防效分别达到79.7％和81.7％。
表3 AE206菌剂对葡萄根癌病的防治试验结果
| 处理 | 发病率(％) | 防效(％) |
| CK(清水) | 90.2 A | / |
| AE206液体制剂 | 18.3 B | 79.7.2A |
| AE206固体制剂 | 16.5 B | 81.7A |
实施例6
AE206菌剂对桃树根癌病的防治试验
本实验2005-2007年在河北省昌黎林宇种苗基地进行。在已应用12年的根癌病危害严重的重茬桃树苗圃进行试验。桃树选用感病品种京红(又名北京1号)，由河北省昌黎林宇种苗基地提供。试验小区采用随机区组排列，每种处理重复3次，小区完全随机排列，每小区60个种子。将实施例2所得AE206菌剂用水稀释10倍(含菌体108CFU/mL)，拌种后覆沙催芽、栽种；将实施例3所得AE206菌剂用水稀释2倍(含菌体108CFU/mL)，拌种后覆沙催芽、栽种；以清水处理为对照。栽种后按照生产上的实际情况进行常规的水肥管理，生长约7个月(4月中旬-11月中旬)后，挖出，检查植株根颈部肿瘤的形成情况，按照下列公式统计植株发病率、计算防效。
发病率(％)＝(长瘤的植株数量+死亡的植株数量)÷栽种的植株总数×100
防效(％)＝(对照发病率-处理发病率)÷对照发病率×100
结果表明(见表4)，在根癌病危害严重的重茬桃树苗圃，葡萄土壤杆菌AE206菌株液体制剂和固体制剂均对桃树根癌病有良好的防治效果，防效分别达到66.2％和70.1％。
表4.AE206菌剂对桃树根癌病的防治试验结果
| 处理 | 发病率(％) | 防效(％) |
| CK(清水) | 86.5 A | / |
| AE206液体制剂 | 28.3 B | 66.2A |
| AE206固体制剂 | 25.8 B | 70.1A |
实施例7
AE206菌剂对樱桃根癌病的防治试验
本实验2005-2007年在河北省昌黎林宇种苗基地进行。在已应用12年的根癌病危害严重的重茬樱桃苗圃进行试验。樱桃选用感病品种甜樱桃，由河北省昌黎林宇种苗基地提供。试验小区采用随机区组排列，每种处理重复3次，小区完全随机排列，每小区30个植株。选用一年生的樱桃苗，将根部稍加修剪以形成伤口，用无菌水洗净。将实施例2所得AE206菌剂用水稀释10倍(含菌体108CFU/mL)，将上述樱桃苗根部浸入，20分钟后取出栽种；将实施例3所得AE206菌剂用水稀释2倍(含菌体108CFU/mL)，将上述樱桃苗根部浸入，20分钟后取出栽种。以清水处理为对照。栽种后植株按照生产上的实际情况进行常规的水肥管理，生长约7个月(4月中旬-11月中旬)后，挖出，检查植株根颈部肿瘤的形成情况，按照下列公式统计植株发病率、计算防效。
发病率(％)＝(长瘤的植株数量+死亡的植株数量)÷栽种的植株总数×100
防效(％)＝(对照发病率-处理发病率)÷对照发病率×100
结果表明(见表5)，在根癌病危害严重的重茬樱桃苗圃，葡萄土壤杆菌AE206菌株液体制剂和固体制剂均对樱桃根癌病有良好的防治效果，防效分别达到74.3％和78.2％。
表5.AE206菌剂对樱桃根癌病的防治试验结果
| 处理 | 发病率(％) | 防效(％) |
| CK(清水) | 72.3 A | / |
| AE206液体制剂 | 18.6 B | 74.3A |
| AE206固体制剂 | 15.7 B | 78.2A |
SEQUENCE LISTING
<110>中国农业大学
<120>一种防治果树根癌病的土壤杆菌及其菌剂和制备方法
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1491
<212>DNA
<213>Agrobacterium vitis
<400>1
Claims (9)
1、一种葡萄土壤杆菌菌株AE206，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC No.2408。
2、一种微生物菌剂，其特征在于其活性成分为权利要求1所述的葡萄土壤杆菌AE206菌体及其胞外代谢产物。
3、按照权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于其所述的微生物菌剂可以为液体制剂或固体制剂。
4、按照权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于其所述的液体制剂的组成成分及其比例为：黄原胶0.2～0.5％g/L，甲基纤维素0.5～1.0g/L，AE206发酵液为余量。
5、按照权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于其所述的固体制剂按照如下方法制备：按照重量份数比1：3～5的比例将AE206发酵液与固体填充物混合，然后遮荫风干使混合物含水量为10～30％，即制成固体制剂。
6、按照权利要求5所述的微生物菌剂，其特征在于其所述的固体填充物的组成成份及其重量百分比为：黄原胶0.1～0.4％、甲基纤维素0.1～0.4％、草炭土99.2～99.8％。
7、权利要求4、5或6中所述的AE206发酵液，按照如下方法制备：
(1)菌种活化：将在-20℃～4℃保存的AE206菌株在LB平板培养基上划线，在25～33℃培养24～72小时，挑取单菌落在LB斜面培养基上划线，在25～33℃培养24～72小时，备用；
(2)摇瓶培养：将步骤(1)活化的AE206菌株接种到灭菌后的培养液中，在25～33℃、pH值为6.5～8.0条件下摇床培养24～72小时，得AE206菌液；所述的培养液的组成成分及其比例为：蔗糖0.1～1.0％、蛋白胨0.1～1.0％、牛肉膏0.1～1.0％、酵母粉0.05～0.02％、MgSO4 0.01～0.1％、其余为水；
(3)按照1～10％体积比将步骤(2)所得AE206菌液置于灭菌后的种子培养液中，在25～33℃、pH值为6.5～8.0、通气量为0.5～1.0V/Vmin、搅拌速度为200～300rpm条件下培养24～48小时，得AE206种子液；所述种子培养液的组成成分及重量百分比为：蔗糖1.5～4.0％、谷氨酸钠0.1～1.0％、酵母膏0.1～1.0％、(NH4)2SO4 0.1～0.5％、K2HPO4 0.1～0.5％、NaH2PO4 0.05～0.2％、MgSO4 0.01～0.05％、KCl 0.01～0.05％、泡敌0.01～0.02％、其余为水；
(4)按照1～8％体积比将步骤(3)所得AE206种子液置于灭菌后的发酵培养液中，然后在25～33℃、pH值为6.5～8.0、通气量为0.5～1.0V/V min、搅拌速度为200～300rpm条件下发酵培养24～48小时，得AE206发酵液；其中所述的发酵培养液的组成成份及其重量百分比为：白糖1.0～4.0％、味精0.1～1.0％、玉米浆1.0～5.0％、(NH4)2SO4 0.1～0.5％、K2HPO4 0.1～0.5％、NaH2PO40.05～0.2％、MgSO4 0.01～0.05％、KCl 0.01～0.05％、泡敌0.01～0.02％、其余为水。
8、权利要求1所述的葡萄土壤杆菌AE206在防治葡萄、樱桃和桃等果树的根癌病害上的应用。
9、权利要求2至6任一所述的微生物菌剂在防治葡萄、樱桃和桃等果树的根癌病害上的应用。
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