CN105886416A - 一株防治植物根癌病的产碱菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株可防治植物根癌病的拮抗细菌，该拮抗菌的分类命名为粪产碱菌(Alcaligens faecalis)，于2014年9月2日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为CGMCC No.9633。用途为：该菌株用于根癌土壤杆菌A.tumefaciens侵染引起的植物根癌病的防治以及受根癌土壤杆菌感染的土壤的生物治理。
Description
技术领域
本发明属于农、林和园艺作物保护技术领域，特别涉及防治植物根癌病的生防细菌及其应用。
技术背景
根癌病是由根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)引起的一种常见细菌性病害。根癌土壤杆菌的寄主范围很广，能侵染93科、331属的643种植物(De Cleene，et al.，1981)。在欧洲、北美、南非及亚洲等一些国家普遍发生。而在我国较为严重的根癌病发生区域为河北、山东、辽宁、河南、湖北、江苏等省区(马德钦和王慧敏，1995)。其中核果类、浆果类、仁果类、坚果类果树以及一些林木和花卉受害较为严重，桃树幼苗受害后早衰，植株矮化，甚至死亡；成龄树感染此病后会生长不良、树势变弱、果实小、产量低、树龄缩短(尹玲莉，2009)，造成了重大的经济损失。目前对根癌病最有效的防治措施是轮作和生物防治。但轮作一般需要3年以上，因此许多果园或苗圃无法实行轮作。提前使用生物菌剂是降低病原菌进入植物体内并干扰其代谢的有效措施。本技术投入低、效率高，是一项农民认可的、可操作强的农产品生产技术。
因根癌土壤杆菌具有三种不同的生物型，其中III型为A.vitis，一般只侵染葡萄；而I型和II型根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)可侵染多种核果类和坚果类果树以及其他林木、花卉和双子叶植物，危害更为广泛。前人研究报道对核果类果树根癌病有效的生防菌对葡萄根癌病防效较差，而对葡萄根癌病有效的生防菌对核果类果树根癌病防效也比较差。目前仅生防菌K84(A.radiobacter)(Kerr，1972，Moore et al1979)或K1026已经在澳大利亚和美国登记注册(商品名为Nogall)。已报道的其他生防菌株还有：防治桉树根癌病的根癌土壤杆菌无毒株D286(Hendson，1983)、防治葡萄根癌病的生防菌E26(A.vitis)(梁亚杰等1990)、HLB-2(A.radiobacter)(Pu&Goodman，1993；游积峰等，1990)和MI15(A.radiobacter)(谢学梅等，1984)、防治樱桃和梨根癌病的生防菌UHFBA-8和11(A.radiobacter)(Gupta等，2010)。上述生防菌都属于土壤杆菌属细菌，其他属生防菌还有菌根真菌(宋福强等，2005)、放线菌(梁静等，2008；季敬霖等，2011)、假单孢菌(张春明等，1988，1991)、芽孢杆菌提取物(Hammami等，2009)等，但未商品化。因此针对在果树和其他植物上发生普遍的由A.tumefaciens引起的根癌病，获得具有我国自主知识产权的生防菌及其无细胞制剂对根癌病的防控具有重要的实际意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种防治植物根癌病的拮抗细菌，该拮抗细菌分离于河北省石家庄市桃树根际，对根癌病菌A.tumefaciens具有明显的拮抗作用，并抑制根癌病菌A.tumefaciens在植物上形成根癌瘤。
本发明的另一目的是提供本发明的可抑制根癌病发生的拮抗细菌的用途，其用途是防治由A.tumefaciens引起的植物根癌病。
本发明的技术方案如下：
本发明提供的一株根癌病拮抗菌，其特征在于，该拮抗菌的分类命名为粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)，于2014年9月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No.9633。
该拮抗菌(51-A)经形态、生理生化和16S rDNA序列同源性分析鉴定为粪产碱菌Alcaligenes faecalis，51-A菌株可利用多种碳源，在pH 7.0-7.5，温度28-35℃生长良好。
采用平板拮抗法测定该菌株对根癌土壤杆菌的抑制能力，发现51-A菌株在YEB培养基上可抑制根癌土壤杆菌A.tumefaciens的生长，抑菌圈直径可达到14.7±1.6mm。分别以向日葵和番茄作为感病植物，采用生物测定的方法，测定菌株51-A对A.tumefaciens在植物上形成根癌瘤的抑制作用。结果表明：将106cfuml-1的51-A菌悬液和A.tumefaciens菌悬液以10∶1(V∶V)混和，接种向日葵7天后，显著抑制根癌瘤的形成，对根癌病的防效为98.0％。番茄苗在移栽前用106cfu ml-1的51-A菌悬液蘸根，然后再浇灌100ml菌悬液，1天后浇灌同样体积同样浓度的A.tumefaciens菌悬液，可大大降低番茄上根癌瘤的形成，防效为91.9％。
本发明的可防治植物根癌病的粪产碱菌的筛选：
采集石家庄桃园中桃树的根、茎和根际土，采用选择性培养基(New Kerr培养基)，稀释涂布法对细菌进行分离。采用virD2A/virD2C引物5`-ATGCCCGATCGAGCTCAAGT-3`，5`-TCGTCTGGCTGACTTTCGTCATAA-3`(Hass，.et al.，1995)和Tip6F/Tip 6R引物：5`-GGTCTAATGCGCAGAGGTGT-3，5`-CGGCTCAAGGATTAGACAGG-3`(Yakabe，2012)，对所分离细菌vir区及T-DNA区进行测定，选择未扩增到224bp和243bp目的片段的菌株作为非致病待测菌株。将A.tumefaciens菌悬液加入YEB培养基，然后点接待测菌株，28℃培养72h后，发现一株产生明显抑菌圈的菌株。将该菌株定名为51-A。该菌株生长迅速，菌落颜色不同于根癌土壤杆菌，但也可以在分离根癌土壤杆菌的选择性培养基平板上生长，说明其与根癌土壤杆菌的营养需求有相同之处，而且可抑制根癌土壤杆菌的生长，因此认为该菌株是一株有潜力的拮抗菌。以向日葵为感病植物，采用将在NB培养液中培养的51-A菌悬液和A.tumefaciens菌悬液(106cfu ml-1)以体积比10∶1混和后接种的方法，测定51-A对A.tumefaciens在向日葵上形成根癌瘤的抑制作用，接种7天后，调查发现51-A菌株处理比单独接种A.tumefaciens的向日葵苗上根癌瘤明显减少，癌瘤变小，对根癌病的防效可达98.0％。以番茄为感病植物，模拟田间种植模式，在中国农业科学院植物保护研究所廊坊基地对51-A菌株的防病效果进行了确认。在番茄移栽时，划伤番茄幼苗茎基部，用浓度为106cfu ml-1的51-A菌悬液蘸根，每株番茄苗再浇灌100ml 51-A菌悬液，1天后浇灌同样体积同样浓度的A.tumefaciens菌悬液，2个月后调查，发现51-A菌悬液处理可大大降低番茄茎基部根癌瘤的形成，癌瘤直径大幅度减小，防效为91.9％。
所述的细菌vir区的扩增体系(总体积：25.0μL)为：DNA模板0.6μL(＜1μg)、上下游引物(5pmol/μL)各1.0μL、10×缓冲液2.5μL、dNTP Mixture(2.5mM each)1.5μL、Taq聚合酶(2.5u/μL)0.5μL、超纯水18.0μL。PCR扩增条件：95℃预变性5min；95℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸40s；35cycles；72℃补充延伸10min。PCR产物用1.2％的琼脂糖电泳检测。
所述的细菌T-DNA区的扩增体系与vir区扩增体系相同，PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸30s；35cycles；72℃补充延伸10min。PCR产物用1.2％的琼脂糖电泳检测。
所述的YEB培养基组分及配比为：蛋白胨5g，酵母膏1g，牛肉膏5g，MgSO40.4936g，蔗糖5g，琼脂15g，水1000ml。调pH到7.0，121℃高压灭菌30分钟。
所述的NB培养基组分及配比为：葡萄糖10g，蛋白胨10g，牛肉膏3g，酵母膏1g，水1000ml。调pH到7.0，121℃高压灭菌30分钟。
该菌株的特征：在NA培养基上形成的菌落为淡黄色，中央黄色，圆形，表面粘稠且易挑起，边缘整齐。革兰氏染色阴性，菌体杆状，大小约为0.5-0.7μm×0.7-1.1μm，周生鞭毛。接触酶和氧化酶阳性。能利用组氨酸、丝氨酸等氨基酸。不固定大气氮，不水解七叶灵、明胶。测定了该菌株的16S rDNA序列，通过与GenBank中其他菌株的16S rDNA序列的比对，将该菌株归为产碱菌Alcaligenes spp.。结合其生理生化特性，将其鉴定为Alcaligenes faecalis。目前未发现将该属菌株应用于根癌病的防治，由于该菌株可产生抑制根癌土壤杆菌的抗菌物质，同时与根癌土壤杆菌的营养需求相似，因此认为其有很大的应用潜力。从而本发明提供了一株防治植物根癌病的细菌菌株。该菌株已经保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏号为CGMCC No.9633。
与其他根癌病生防菌相比，本发明的优点是：1.该菌分离于适于根癌土壤杆菌生长的选择性培养基平板，与根癌土壤杆菌的营养需求相似，而且生长迅速，具有生态位优势。2.该菌可强烈抑制根癌土壤杆菌Alcaligenes faecalis对易感植物向日葵和番茄植株的侵染和根癌瘤的形成，防效分别达到98.0％和91.9％。3.该菌能产生抗菌物质，可利用该菌的代谢产物处理已经感染根癌土壤杆菌的土壤，降低土壤中根癌土壤杆菌的数量，降低其侵染儿率。
本发明的可防治植物根癌病的粪产碱菌的用途：
该菌株可抑制根癌土壤杆菌A.tumefaciens对植物的侵染和根癌瘤的形成，可用于植物根癌病的防治以及受A.tumefaciens感染的土壤的治理。
具体实施例1：粪产碱菌51-A对A.tumefaciens侵染向日葵形成根癌瘤的抑制作用
将在NB中培养至对数期的拮抗菌51-A和根癌土壤杆菌A.tumefaciens ATCC 23308T转接至NB中，28℃，180rpm培养18-24h，血球计数板计数，调整菌悬液浓度为106cfuml-1。将拮抗菌51-A和根癌土壤杆菌菌悬液以10∶1的体积比混和，接种至出苗10d左右的向日葵子叶处。具体方法参考王红艳(1998)的方法。以无菌水代替拮抗菌51-A菌悬液与病原菌混和作为对照。每处理10株向日葵苗，共3个重复。放置于28℃的培养室内，一周后观察是否出现瘤状物，游标卡尺测量瘤状物直径和向日葵茎粗。统计发病率和病情指数，计算拮抗菌的防病效果。病情级别划分(表1)参考陶铁男和明发源(2010)方法。病情指数＝∑(病级株数×代表数值)×100/调查总株数×最高级代表值。
表1 向日葵茎上根癌病病情级别划分标准
结果表明，接种向日葵7d后，对照组发病严重，根癌瘤明显大于处理组根癌瘤，病情指数为83.3(表2)。菌株51-A处理的病情指数较低，防效达到98.0％。
表2 拮抗菌51-A对A.tumefaciens在向日葵上形成根癌瘤的抑制作用
具体实施例2：粪产碱菌51-A对A.tumefaciens侵染番茄形成根癌瘤的抑制作用
将出苗30d番茄苗的根茎处划伤且伤根10条后，用51-A菌悬液(106cfu ml-1)蘸根，然后移栽至直径为12cm的花盆中后灌根，每株浇灌100ml菌悬液，对照用等量的清水处理。第2天用A.tumefaciens菌悬液(106cfu ml-1)灌根，每株浇灌100ml。每处理15株番茄苗，3个重复。于2个月后挖根，检查是否有根癌瘤。调查根上结瘤数并测定根癌瘤大小和茎粗，统计发病率和病情指数，计算拮抗菌的防病效果。病情级别划分(表3)参考陶铁男和明发源(2010)的方法。病情指数＝∑(病级株数×代表数值)×100/调查总株数×最高级代表值。
表3 番茄苗上根癌病病情级别划分标准
结果表明，对照组番茄根茎基部有明显肿大的根癌瘤，病情指数为88.8，而用拮抗菌51-A处理过的番茄苗未出现根癌瘤或根癌瘤较小，病情指数明显降低，防效达到91.9％(表4)。
表4 粪产碱菌51-A对A.tumefaciens在番茄上形成根癌瘤的抑制作用
Claims (3)
1.一株可防治由根癌土壤杆菌A.tumefaciens引起的植物根癌病的生防细菌，其特征在于，它是一种粪产碱菌(Alcaligens faecalis)(CGMCC No.9633)。主要生物学特性为：G-，菌体杆状，大小约0.5-0.7μm×0.7-1.1μm，周生鞭毛。接触酶和氧化酶阳性。能利用组氨酸、丝氨酸等氨基酸。不固定大气氮，不水解七叶灵、明胶。该菌株的16S rDNA序列在GenBank中的登录号为KM454979。
2.如权利要求1所述的植物根癌病的生防细菌的用途。该菌株用于由根癌土壤杆菌A.tumefaciens引起的植物根癌病的防治，以及受根癌土壤杆菌感染的土壤的治理。
3.如权利要求1和权利要求2所述的生防细菌的与抗菌物质产生相关的基因及抗菌物质在植物根癌病防治及工业和生物医药领域的应用。
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