CN107488608B - 一株微白黄链霉菌z9及其在防治向日葵菌核病的应用 - Google Patents

一株微白黄链霉菌z9及其在防治向日葵菌核病的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株防治向日葵苗期菌核病的微白黄链霉菌Z9，所述菌种的保藏号为CGMCC 13115，属于微生物技术领域。通过实施向日葵菌核病的病原菌核盘菌的分离活化和鉴定、拮抗菌的初筛和复筛实验以及拮抗菌的菌种鉴定分析等实验，表明菌株Z9具有较强的抑制核盘菌菌丝生长的能力。本发明的菌株Z9发酵原菌液处理过的向日葵种子皮壳侵染发病率降低了70％、菌株Z9发酵滤液对种子萌发促进率为33.3％、菌株Z9发酵原菌液的离体叶片防治效果为69.6％、菌株Z9发酵原菌液盆栽实验防治效果为66.7％，能有效抑制核盘菌的生长繁殖。本发明的菌株培养条件简单，易保存，对环境友好，具有良好的开发应用价值。

Description

一株微白黄链霉菌Z9及其在防治向日葵菌核病的应用
技术领域
本发明涉及一株微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)Z9及其在防治向日葵菌核病的应用，更确切地说涉及到该菌株在向日葵苗期生长过程中菌核病防治的应用，属于微生物技术领域。
背景技术
向日葵菌核病是向日葵最重要的病害之一，在世界各国均有发生，其病原菌核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)致病性强，可以穿透寄主植物表皮，杀死细胞，进而侵染向日葵的根、茎、叶和花盘等多个部位，甚至造成植株整体或局部腐烂死亡，若管理不当，会对向日葵产量造成极大损失。近年来，向日葵菌核病的普遍发生和严重危害极大地影响了向日葵种植业的稳步发展。
向日葵菌核病的致病菌即核盘菌是为土壤习居菌，能在土壤中长期存活和积累，其生活史中有90％的时间是以菌核的形式长期存活于土壤中。菌核可在土壤表层或混入种子间休眠，其生命力很强，在干旱的土壤中可存活6-8年，在潮湿的土壤中可存活3-5年。核盘菌菌丝生长的最适温度范围在20-28℃，最适 pH值4-7，最佳碳源、氮源分别为甘露糖及天门冬酰胺，菌丝生长对缺Cu、Fe 最为敏感，菌丝可在PDA、PSA等天然、半天然培养基上生长旺盛且均匀。菌丝在45℃处理10min，菌核在50℃处理10min，均不再存活。
在防治方面，由于向日葵菌核病的抗病育种进展缓慢，目前还没有抗病品种和高效耐病品种。化学防治主要使用的有多菌灵、速克灵和菌核净等药剂，但向日葵植株过于高大，田间用药十分困难，药剂对土壤中菌核效果有限且易对环境造成污染等影响，因此防治效果并不理想。在农业防治方面，也缺少经济实用并且效果显著的方法。因此，筛选利用有益微生物及其代谢产物来防治向日葵菌核病是实施绿色环保安全的具体措施。
发明内容
本发明的目的在于提供一株能够很好地控制向日葵菌核病病害发生的生防菌株及其初步应用。
本发明从青海祁连县采集土壤样品，通过稀释涂布平板法在高氏一号、TSA、 LB、ISP2和PDA培养基上获得不同菌株的单菌落，将单菌落纯化扩大培养；再采用平板对峙实验初步筛选出对向日葵核盘菌有明显抑制效果的拮抗菌株，对其进行16S rRNA基因序列测序确定其所属种属，该菌株对人畜均无致病致癌性，能安全地用于向日葵菌核病的生物防治中。
本发明所提供的技术方案是一株微白黄链霉菌Z9及其在防治向日葵菌核病 的应用，根据对其形态学特征观察和16S rRNA基因序列分析，确定该菌株为微 白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)，命名为微白黄链霉菌Z9(Streptomyces albidoflavusZ9)。该菌株于2017年4月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO：13115，保藏单位地址为：北京 市朝阳区北辰西路1号院3号。
菌株Z9能在高氏一号、ISP2、LB、TSA和PDA等不同培养基上生长。菌株Z9在高氏一号培养基上生长时，气丝初为肉色，后变为灰色；在ISP2培养基上生长时基内菌丝呈肉粉白色，菌落较干燥，边缘褶皱；在LB培养基上生长时，基内菌丝呈肉色，菌落较透明；在TSA培养基上生长时，菌落呈白色，基内菌丝呈粉白色，边缘褶皱；在PDA培养基上生长时，气丝灰色，呈粉状，基丝初黄色，后变为棕色。
本发明所述的筛选鉴定方法是利用菌株Z9的发酵液的不同处理方式对向日葵种子及向日葵苗期植株的初步应用。
本发明提供多种对向日葵核盘菌的拮抗菌株的筛选鉴定方法，主要涉及菌株Z9的发酵液对核盘菌的拮抗实验、离体叶片防效实验和向日葵盆栽实验等。
本发明具有以下有益效果：
本发明所涉及的菌株Z9经鉴定为微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)，该菌株对人畜无致病致癌性，是一种能安全防治向日葵菌核病的拮抗放线菌。应用实施例表明，通过盆栽实验表明，该菌株对向日葵幼苗期的菌核病的防治效果达到66.7％。目前，国内外对向日葵菌核病的防治主要采取的是化学防治的方法，化学防治主要使用的有多菌灵、速克灵和菌核净等药剂，但向日葵植株过于高大，田间用药十分困难，药剂对土壤中菌核效果有限且易对环境造成污染等影响，因此防治效果并不理想。国内外还没有报道过微白黄链霉菌对向日葵菌核病的抑制作用。因此，本发明所涉及的菌株Z9对防治向日葵菌核病具有良好的开发潜力和应用价值。
附图说明
图1:实施例一中的核盘菌在PDA培养基上的培养特征照片。
图2:实施例二中的菌株Z9的鉴定中的菌株Z9在高氏一号培养基上的培养特征照片。
图3:实施例二中的菌株Z9的初筛中的微白黄链霉菌Z9(Streptomycesalbidoflavus Z9)的平板对峙实验结果图。
图4:实施例二中的16S rRNA基因序列鉴定及序列分析中的Z9及其相关种的系统发育树构建图。
图5:实施例三中的向日葵种子发芽实验中Z9菌液对种子萌发影响结果图(原为菌株Z9原菌液，原20为稀释20倍的菌株Z9原菌液，滤为菌株Z9发酵液的滤液，滤20为稀释20倍的滤液)。
图6:实施例三中的菌株Z9离体叶片防效复筛实验组结果图。
图7:实施例三中的菌株Z9离体叶片防效复筛对照组结果图。
图8:实施例三中的向日葵盆栽实验中的菌株Z9原菌液实验组结果图。
图9:实施例三中的向日葵盆栽实验中的空白对照组结果图。
图10:实施例三中的向日葵盆栽实验中的实验对照组结果图。
具体实施方式
下面提供实施例以进一步说明本发明。
实施例一核盘菌的筛选和鉴定
本发明的核盘菌的菌株是从内蒙古田区的患病向日葵秸秆中分离出来。将从内蒙古地区采摘回来的患病向日葵秸秆用小刀剖开，从中取出核盘菌菌核，用75％乙醇消毒，再用无菌水冲洗2-3次，置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中于 25℃恒温培养3-5d至菌丝长出，再将菌丝挑至新的马铃薯葡萄糖琼脂培养基生长待用(见图1)，将纯化完成的核盘菌进行ITS区序列测序确定其为核盘菌 (Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)。
实施例二菌株Z9的初筛与鉴定
本发明筛选防治向日葵菌核病菌株的方法如下：
一、土壤样品的采集
从青海祁连县随机采集土样5份。去除表面土壤，采集5-20cm深处的土样约300g，分装标记后带回实验室。
二、分离菌株的纯化与培养
采用稀释涂布平板法分离菌株，称取1g土样，混合于9mL无菌水中作为 10-1稀释液，进行梯度稀释；分别用10-2、10-3和10-4样品稀释液涂布各个分离培养基平板，每个稀释度涂布2个平板，每块平板涂布量为0.2mL。琼脂平板的表面必须是干的，以便于接种物立刻被吸收；分离平板于28℃倒置培养1-4周，每3-4d定期检查；采用形态学比较，区分形态上明显不一致的菌株，将菌株接种在高氏一号培养基(可溶性淀粉20g,NaCl 0.5g,KNO3 1g,MgSO4.7H2O 0.5g, K2HPO4 0.5g,FeSO4.7H2O 0.01g,琼脂20g,蒸馏水1000ml,pH 7.2)、LB培养基 (胰蛋白胨10g,酵母浸粉5g,琼脂20g,蒸馏水1000ml,pH 7.2)、胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)(胰蛋白胨15g,大豆蛋白胨5g，氯化钠5g,琼脂20g, 蒸馏水1000ml,pH 7.2)、ISP2培养基(Bacto-yeast extract 4g,Bacto-malt extract 10g,葡萄糖4g,琼脂20g,蒸馏水1000ml,pH 7.2)和马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (PDA)(马铃薯浸粉3g，葡萄糖20g,酵母浸粉10g,琼脂20g，蒸馏水 1000ml,pH 7.2)上于28℃倒置扩大培养3-5d。
三、拮抗菌株的初筛
采用平板对峙法筛选有效拮抗菌株，在活化好的向日葵核盘菌菌落周围打取直径6mm的菌块接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中央，将培养3-5d的直径为 6mm拮抗菌菌饼等距离接种在核盘菌菌块四周，于25℃恒温培养箱中培养3-5d 后观察，采用十字交叉法测量记录抑菌圈直径大小，各处理3次重复。
四、菌株Z9的鉴定
1、培养形态特征
菌株Z9能在高氏一号、ISP2、LB、TSA和PDA等不同培养基上生长。菌株Z9在高氏一号培养基上生长时，气丝初为肉色，后变为灰色；在ISP2培养基上生长时基内菌丝呈肉粉白色，菌落较干燥，边缘褶皱；在LB培养基上生长时，基内菌丝呈肉色，菌落较透明；在TSA培养基上生长时，菌落呈白色，基内菌丝呈粉白色，边缘褶皱；在PDA培养基上生长时，气丝灰色，呈粉状，基丝初黄色，后变为棕色。形态特征结果如图2。
2、生理生化实验
具体参照《常见细菌系统鉴定手册》和《链霉菌鉴定手册》，经过生理生化实验鉴定：菌株Z9为革兰氏阳性菌，生理生化实验结果见下表。
表1.菌株Z9的生理生化特性
Figure BDA0001315992050000061
注：“+”：反应呈阳性或可以生长、利用；“-”：反应呈阴性或不可以生长、利用。
3、16S rRNA基因序列鉴定
将拮抗效果较好的菌株Z9(图3)进行16S rRNA基因序列测序确定其所属种属，鉴定其为微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)。
3.1DNA的提取
主要参考Kim等(1995)和Rainey等(1996)的方法小量提取总DNA。
(1)从平板或斜面上挑取菌体，用无菌水以12000r/min离心3min，共洗2 次；再用TE Buffer以同样条件离心洗涤1次。
(2)加567μL TE(pH 8.0)缓冲液悬浮菌体沉淀，加30μL 20％的SDS和3μL 20mg/mL的蛋白酶K轻轻混匀，30℃水浴1小时。
(3)加100μL 5M的NaCl混匀，再加80μL CTAB/NaCl(10％/0.7M)溶液轻混，65℃水浴20min。
(4)加入800μL的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，混匀后，12000r/min离心5min，将上清液转移到新的离心管，重复抽提两次。
(5)将上清转移到新的离心管，加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀，12000 r/min离心15min。
(6)弃上清，加入1mL70％的乙醇，轻轻混匀，12000r/min离心15min。
(7)弃上清，风干，加入50μL无菌水溶解DNA，4℃保存。
3.2 16S rRNA基因序列鉴定
用16S rRNA基因的通用引物进行PCR扩增，正向引物PA为27f(对应E. coli 16SrRNA基因的第8-27位碱基)：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物PB为1492r(对应E.coli 16S rRNA基因的第1495-1514位碱基)： 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，50μL反应体系进行PCR扩增：正反向引物各1.0μL，DNA模板2μL，2×Mastermix25μL，ddH2O加至50μL。PCR扩增条件：95℃预变性5min，95℃变性5min，54℃退火1min，72℃延伸1.5min，共35个循环，72℃延伸修复10min，4℃∞终止反应。PCR产物用Wizard PCR Purification System(Promega)纯化，操作方法按说明书上推荐的程序进行。PCR 产物由上海生工生物工程有限公司测序，序列为1293bp(见菌株Z9 16S rRNA 基因碱基序列所示)。将所测的16S rRNA基因序列与GenBank/EMBL/DDBJ 数据库中已有的序列进行比较，从数据库中找到相关种已经发表的相似菌代表性序列，把所得序列通过多重比对后，采用CLUSTAL X 2.0软件和MEGAversion 5软件，利用邻位连接法构建菌株Z9的系统发育树(图4)，并且根据形态学特征和生理生化实验等发现其与微白黄链霉(Streptomyces albidoflavus) 16S rRNA基因有非常高的一致性(99.61％)，表明菌株Z9即为微白黄链霉菌。
实施例三菌株Z9的复筛与初步应用
一、向日葵种子皮壳实验
将菌株Z9接种于在121℃、0.1Mpa下灭菌后的种子培养基(可溶性淀粉2g, 干酪素酶解产物0.3g,葡萄糖0.5g,Bacto-yeast extract 0.2g，Bacto-malt extract 0.5g,碳酸钙0.3g,无菌水100ml,pH7.2)中，放置于全温震荡培养箱以 170rpm/min，28℃恒温活化恒温培养24h。根据5％的接种量(即将10ml的种子培养基加入至190ml对应培养基中)，将种子培养基中的菌株Z9接种至高氏一号液体培养基(即高氏一号固体培养基中不加入琼脂)中，再放入全温震荡培养箱中进行培养，保持转速170rpm/min，控制温度为28℃，培养3-5d。
菌株Z9发酵菌液的处理：将放入恒温震荡培养箱中的菌株Z9发酵菌液取出，加入50ml的离心管中，进行高速离心，转速12000r/min，时长20min，用一次性使用无菌注射器吸取上清液，利用亲水性聚醚砜膜进行过滤，得到不含菌株Z9菌丝的滤液，最后再对菌株Z9原菌液和滤液分别稀释20倍，最终得到原菌液、稀释20倍的原菌液、滤液、稀释20倍的滤液。
向日葵种子初步处理：先将向日葵种子浸泡于无菌水中2min，除去无菌水，加入75％的乙醇溶液，浸泡1min，洗一次，除去乙醇溶液，再加入 2％次氯酸钠溶液，浸泡2min，共浸洗两次，最后，放入无菌水中进行清洗，清洗1min。
向日葵种子再处理：将上述处理完的种子分为五份，一份加入适量的无菌水，一份加入等量的原菌液，一份加入等量稀释20倍的原菌液，一份加入等量的上述过滤后的滤液，最后一份加入等量稀释20倍的滤液。将每份种子均上下颠倒浸泡30min。
配制马铃薯葡萄糖琼脂培养基，在121℃，0.1Mpa下灭菌20min倒板，待培养基冷却凝固后，将核盘菌接种在马铃薯葡萄糖培养基上，培养3-5d 等待菌丝长满后将上述处理好的向日葵种子接入培养基中，每皿10粒向日葵种子，每组处理重复3组实验。
向日葵种子培养2d后，查看种子皮壳的发病情况，进行记录，同时利用镊子翻转皮壳，按照三个不同级别来观察培养基和向日葵皮壳接触部分真菌菌丝在皮壳上的情况。这三个级别如下：0级：抗菌型，向日葵皮壳上没有菌丝；1级：轻微感病型，向日葵皮壳上能够看到少量的菌丝；2 级：感病型，向日葵皮壳上明显地长满了菌丝，记录实验组与对照组结果。结果表明，菌株Z9发酵原菌液处理过的向日葵种子皮壳侵染发病率降低了 70％。
表2菌株Z9发酵液不同处理方式对向日葵种子皮壳侵染的影响
Figure BDA0001315992050000091
注：染病指数＝染病个数×染病级数；发病率＝染病个数÷总个数×100％。
二、向日葵种子发芽影响实验
利用萌发实验分析菌株Z9的菌丝及其发酵产物对向日葵种子萌发的影响作用。Z9菌液和向日葵种子的处理方式采取向日葵皮壳实验中的Z9 菌液和种子处理方式，接着将每份种子均上下颠倒浸泡各30min，最后分别把向日葵种子加入对应的已加入滤纸的培养皿中，再在各个种子表面加入适量的无菌水，使其能更好地发芽。
最后将这五份种子放入恒温培养箱中于28℃进行培养。每隔12h观察种子的萌发情况，每组处理重复3组实验。记录Z9菌液不同处理方式对种子萌发影响的结果(图5)。结果表明，菌株Z9的发酵滤液对向日葵种子的发芽促进率为33.3％。
三、菌株Z9离体叶片防效复筛
将菌株Z9接入100mL高氏一号液体培养基中，28℃、170r/min培养 24h-48h。将菌体发酵液稀释20倍，作为处理液。挑选叶龄一致的向日葵真叶，用无菌水冲洗后于处理液中浸泡10min，晾干(表面无水珠)，随后接种生长旺盛的向日葵菌核病菌菌丝块(直径6mm)，每张叶片接种1个菌丝块(每处理各20片，3次重复)，以直径6mm的马铃薯葡萄糖琼脂培养基块为空白对照，放置于水琼脂培养基上，在25℃恒温培养，24h后观察实验组(图6)和对照组(图7)病斑扩展情况，每组处理重复3次实验。结果表明，菌株Z9发酵原菌液对离体叶片菌核病的防治效果为69.6％。
四、向日葵盆栽实验
栽种十钵向日葵，每个营养钵中加入适量的向日葵种子，放置于阳光充足的地方，保证能让向日葵正常发芽及长出幼苗植株，每隔1d对向日葵进行浇水，至所培养的向日葵植株能够长出两对真叶时，才可以进行后续的实验。
将实验所得的核盘菌的发酵原菌液，加入喷壶中，对实验组、空白对照组和实验对照组的向日葵幼苗根部各喷洒100ml，要保证喷洒时，不能影响到其他植株。实验组：喷洒100ml核盘菌原菌液后再喷洒100ml菌株Z9的发酵原菌液；空白对照组：喷洒100ml核盘菌原菌液后再喷洒100ml 无菌水做为空白对照；实验对照组：喷洒100ml核盘菌原菌液后再喷洒100ml马铃薯葡萄糖琼脂液体培养基作为实验对照组，每组处理重复3次实验，记录各组实验结果(图8为菌株Z9发酵原菌液实验组、图9为空白对照组，图10为实验对照组)。
从图8、图9和图10的结果对比中可以明显地看出使用菌株Z9的发酵原菌液能够有效地抑制核盘菌对向日葵根部的侵染，菌株Z9发酵原菌液盆栽实验的防治效果为66.7％，表明菌株Z9能够起到抑制病原菌生长繁殖的作用，促进向日葵的生长。

Claims (4)

1.一株微白黄链霉菌(Strepomyces albidoflavus)Z9，其保藏号为CGMCC NO：13115。
2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述的微白黄链霉菌Z9为革兰氏阳性菌，其最适生长温度为25-30℃；所述微白黄链霉菌Z9在高氏一号培养基上生长时，气丝初为肉色，后变为灰色；所述微白黄链霉菌Z9在ISP2培养基上生长时基内菌丝呈肉粉白色，菌落较干燥，边缘褶皱；所述微白黄链霉菌Z9在LB培养基上生长时，基内菌丝呈肉色，菌落较透明；所述微白黄链霉菌Z9在TSA培养基上生长时，菌落呈白色，基内菌丝呈粉白色，边缘褶皱；所述微白黄链霉菌Z9在PDA培养基上生长时，气丝灰色，呈粉状，基丝初黄色，后变为棕色。
3.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述的微白黄链霉菌Z9具有抑制向日葵菌核病病原菌菌丝生长繁殖的能力。
4.根据权利要求3所述的一株微白黄链霉菌Z9在防治向日葵菌核病的应用。
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