CN106801023A - 地衣芽孢杆菌y16及其在防治作物土传病害中的应用 - Google Patents

地衣芽孢杆菌y16及其在防治作物土传病害中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一株地衣芽孢杆菌Y16及其在防治作物土传病害中的应用。所述地衣芽孢杆菌Y16的保藏号CGMCC NO.13512，将其制成微生物菌剂对于田间向日葵的促生增产效果明显，且其作用效果不受田间土壤条件、化肥使用的抑制，可以在轻度盐碱农田中，与化肥一起施用。该菌剂对向日葵核盘引发的烂盘病防治效果达到95％以上，锈病防治效果达100％，向日葵增产20％‑30％，大棚蔬菜增产20％以上。该微生物菌剂对我国农田土传病害和连作障碍防治，粮食持续增产和保护农田生态环境具有重要意义。

Description

地衣芽孢杆菌Y16及其在防治作物土传病害中的应用
技术领域
本发明涉及微生物学和植物病害生防技术领域，具体地说，涉及一株地衣芽孢杆菌Y16及其在防治作物土传病害中的应用。
背景技术
随着作物产量水平的提高和设施农业发展，土传病害与连作障碍问题日趋突出，土壤病原微生物不断增加，引发作物减产甚至绝收。土传病害与连作障碍已经成为农业安全生产发展的瓶颈。作物连作3年，产量降低10％～20％,连作4～5年作物减产40～50％。设施蔬菜、马铃薯、大蒜、向日葵、油菜、棉花、大豆、水稻、小麦、甜菜土传病害时常发生，减产日益严重，影响农民增产增收。我国遭受严重土传病害、连作障碍危害的面积高达5亿亩。
由于土传病害加重，我国每年使用的农药量超过130万吨，农药使用量普遍超标，平均每亩施用931.3g，比发达国家高出一倍。全国受农药污染的农田约1600万公顷，主要农产品中的农药残留超标率高达20％。土传病害防治技术没有得到有效的解决，生物防治土传病害是替代化学农药的最佳选择。
土传病害生物防治的菌种多为木霉菌、链霉菌、寡雄腐霉菌、芽孢菌等为佳。防治土传病害的微生物菌剂产品，己商品化的产品如澳大利亚的K84，放射形龙杆菌菌株K84在1973年就被大规模生产，用来防治根癌病；1988年Gustafson公司在美国注册生产A13产品Kodiak，成为作物生防菌商业化生产的拓疆者。利用荧光假单胞菌(P.fluorescens CHA0)生产的杀真菌制剂Yield能够防治土壤真菌病害。普利茅斯沙雷氏菌(Serratia plymuthica HRO-C48)生产的产品和放线菌(Streptomyces sp.HRO-71)生产的防治草莓和土豆生物黄萎病(Verticilliumdahliae)。Trichoderma reesei G1和Trichoderma viride G3防治立枯病效果显著。
美国研制的Topshield(哈茨木霉T22)和以色列研制的Trichodex(哈茨木霉T39)均是用于防治真菌病害如灰霉病以及以色列Mycontrol公司开发的商品制剂Trichoderma2000主要用于防治立枯丝核菌、齐整小核菌、疫霉等；盾壳霉也是研究较多的一种生防菌，盾壳霉对核盘菌属及葱白腐小菌核菌引起的多种植物病害均有很强的抑制作用。现在国外已有商品化产品出现，如前苏联开发的商品制剂Coniothyrin可以用于防治向日葵的菌核病，德国开发的商品制剂ntansWG可用于防治莴苣的核盘菌菌核病等。此外还有针对粘帚霉(Gliocladium virens)，由美国研制成功的SoilGard，用于防治猝倒病和根腐等，意大利研制的BiofoxC专用于防治镰刀菌属病害等。我国商品化的木霉菌杀菌剂(生菌消，又名灭菌灵)，主要用于防治各种作物的霜霉病，我国开发的5406抗生菌为链霉菌属，定名为泾阳链霉菌，对黄萎病菌、枯萎病菌、立枯病菌、猝倒病菌等多种植物病害具有抗性，并且可促进植物生长。拮抗细菌(Bacillus subtilis)大面积示范推广试验证明，拮抗菌在水稻植株上定植能力较强，繁殖较快，对纹枯病防效达75％～85％，对稻曲病防效达63.8％～85.7％。拮抗木霉菌和拮抗细菌混合发酵制成粉剂，成功地防治了保护地蔬菜和甜瓜的苗期病害。其它报道的细菌杀菌剂用来防治黄瓜及烟草炭疽病菌的地衣芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌防治甘蔗黑腐病，放射假单孢杆菌防治小麦全蚀病等。木霉菌厚垣孢子制剂对新疆棉花黄萎病大面积试验防效达到60％，增产50％，棉绒长度增加10％，表现出了良好的应用前景。
向日葵具有耐盐碱、耐瘠薄、抗干旱适应性强等特性,籽实含油率高,油质优良,现已成为世界第4大油料作物。2002年全球向日葵种植面积为2600万hm2，葵花籽产量为2400万t。据报道，2014、2015年度全球葵花籽产量1551.9万t。2004年我国向日葵面积为113.1万hm2，总产为194.6万t，2007年我国向日葵播种面积102万hm2，总产量为192.8万t，单产1889.3kg/ha。
向日葵连作导致土壤养分特别是钾元素过度消耗，地力难以恢复。向日葵病害如菌核病、锈病、褐斑病、霜霉病、叶枯病，以及葵螟、蛴螬、小地老虎等，都会因连作而危害加剧。向日葵菌核病，又称白腐病、烂盘病，对向日葵的产量和品质影响很大。
向日葵菌核病发生很广泛，发病较重，可造成向日葵茎折、花盘及种仁腐烂，对向日葵生产造成严重威胁。常见的有根腐型、茎腐型、叶腐型、花腐型4种类型，其中根腐型、花腐型受害重。花腐型病害表现为花盘受害后，盘背面出现水浸状病斑。
目前主要是药剂防治:①用40％纹枯利800～1000倍液；②用50％托布津可湿性粉剂1000倍液；③用50％速克灵500～1000倍液。防治效果并不十分理想，防治效果仅为80％左右，因此，研发防治土传病害与连作障碍的生物肥料非常重要。
发明内容
本发明的目的是针对我国向日葵连作导致菌核病和锈病频繁发生、减产严重甚至绝收的生产问题，提供一株高效防治向日葵菌核病和锈病的芽孢杆菌Y16及其制备的微生物菌剂。
本发明的另一目的是提供所述地衣芽孢杆菌Y16在防治作物土传病害中的应用。
为了实现本发明目的，本发明从吉林省公主岭市农田土壤中分离并纯化获得一株高效防治向日葵菌核病和锈病的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)Y16，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC NO.13512，保藏日期2016年12月28日。
地衣芽孢杆菌Y16的菌学特征如下：
形态特征：杆状，运动，周生鞭毛，有芽孢，格兰氏阳性，二等分裂。
培养特征：菌落白色，无光泽，边缘不整齐，液体培养生长迅速，明胶穿刺培养阳性。
生理生化特征：化能异养，需氧，无需光照；在30℃～55℃温度范围内均能生长，5℃～10℃和65℃不能生长；在pH5.7～6.8内均能生长；在2％、5％、7％NaCl中生长；可利用柠檬酸盐、丙二酸盐，不能利用尿素盐；可利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露醇；接触酶阳性。结合16S rDNA测序结果，进一步确定菌株Y16为地衣芽孢杆菌。
本发明还提供含有所述地衣芽孢杆菌Y16的微生物菌剂。
本发明所述菌剂中还含有添加剂和保护剂。
其中，所述添加剂为二氧化硅、轻质碳酸钙、高岭土、膨润土、稻壳粉、麦壳粉、秸秆粉等中的至少一种。
所述保护剂为甘油、脱脂奶、植物油、海藻酸钠、壳聚糖等中的至少一种。
本发明提供的菌剂由如下重量份的组分组成：
地衣芽孢杆菌Y16发酵液 1份；
添加剂 0.5-3份；
保护剂 0.01-0.05份；
所述菌剂中地衣芽孢杆菌Y16活菌数为2×108-5×109cfu/g。优选5×108cfu/g。
本发明还提供所述地衣芽孢杆菌Y16或所述菌剂在防治作物土传病害(向日葵菌核菌病、向日葵锈病、大棚蔬菜连作障碍)中的应用。
所述土传病害的病原菌包括核盘菌、向日葵柄锈菌、尖镰孢菌。
本发明还提供所述地衣芽孢杆菌Y16或所述菌剂在提高作物产量中的应用。
所述作物包括大棚蔬菜。优选地，所述作物包括向日葵、大蒜、甜瓜、西红柿等。
本发明还提供所述地衣芽孢杆菌Y16或所述菌剂在制备农用复混肥中的应用。
本发明还提供一种农用复混肥，由有效成分为地衣芽孢杆菌Y16的菌剂与氮肥、磷肥、钾肥或复合肥组成。
本发明提供的有效成分为地衣芽孢杆菌Y16的微生物菌剂对于田间向日葵的促生增产效果明显，且其作用效果不受田间土壤条件、化肥使用的抑制，可以在轻度盐碱农田中，与化肥一起施用。该菌剂对向日葵核盘引发的烂盘病防治效果达到95％以上，锈病防治效果达100％，向日葵增产20％-30％，大棚蔬菜增产20％以上。该微生物菌剂对我国农田土传病害和连作障碍防治，粮食持续增产和保护农田生态环境具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例5中Y16菌株平板抑制尖镰孢菌的效果；其中，A、B分别表示Y16抑制尖镰孢菌的PDYA平板的正面和反面。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1地衣芽孢杆菌Y16菌剂的制备
1.地衣芽孢杆菌Y16的分离及纯化
从吉林省公主岭市农田土壤中分离并纯化获得一株高效防治向日葵菌核病和锈病的菌株Y16。
根据菌株Y16的菌学特征及16S rDNA测序结果，确定菌株Y16为地衣芽孢杆菌。
2.地衣芽孢杆菌Y16的培养
(1)培养基的组成(kg/t发酵液)
可溶性淀粉10kg，黄豆饼粉10kg，玉米粉5kg，葡萄糖1kg，蔗糖10kg，酵母粉5kg，(NH4)2SO4 3kg，K2HPO4 0.2kg，NaCl 2.5kg，MgSO4·7H2O 0.1kg，CaCO3 0.5kg，FeSO40.001kg，硼酸(1％)1L，pH7.0，以水配制。
(2)发酵培养过程
将地衣芽孢杆菌Y16接种于土豆蔗糖(PDA)培养基上，25～28℃培养3d。将地衣芽孢杆菌Y16转接入1000mL三角瓶，26-28℃，220r/min下液体发酵培养36h。然后按1％接种量接入50L种子罐，在200r/min、pH7.0、通气量0.7vvm条件下，培养36h后，再按10v/v％接种量转入500L发酵罐，在220r/min，pH7.0，通气量0.7～1.0vvm下，培养3d。
3.地衣芽孢杆菌Y16菌剂的制备
发酵后加入保护剂海藻酸钠，地衣芽孢杆菌Y16以轻质碳酸钙吸附。
4.地衣芽孢杆菌Y16菌剂造粒
向以上吸附、混合好的菌剂中加入适量稻壳粉、秸秆粉和膨润土粘结造粒，根据生产需要造粒形成适合向日葵的颗粒菌剂(活菌数为5×108cfu/g)，与向日葵种子播种机一起施入土壤；或者利用造粒机形成与尿素、磷酸二铵、钾肥、复合肥粒径近似的颗粒生物肥料，其生物肥料与尿素、磷酸二铵、钾肥、复合肥一起机械施入土壤。
实施例2 Y16菌剂对盆栽向日葵促生效果的影响
1.Y16菌剂对非盐碱土壤盆栽向日葵的促生效果
在温室条件下进行了Y16菌剂的接种试验，土壤来自于内蒙乌拉特古前期农田土壤，连年种植向日葵，菌核病和锈病异常严重，2014年绝收。盆栽条件下种植向日葵，分别接种3种生物肥料菌剂。试验结果显示，所有微生物菌剂都能够提高向日葵的生物量(表1)。Y16菌剂生物量最高，比对照提高88.16％；DSM 8785菌剂低于Y16，比对照提高41.89％；DSM1732菌剂生物量最低，比对照(不施用微生物菌剂)提高27.85％。表明Y16菌剂促进向日葵生长效果显著。
表1盆栽条件下生物肥料对非盐碱土壤向日葵生物量的影响
注：a、b、c、d表示处理组之间差异显著。
2.在温室条件下进行了Y16菌剂的接种试验，试验土壤来自于内蒙乌拉特古前期，轻度盐碱，连年种植向日葵，菌核病和锈病异常严重，2014年绝收。盆栽条件下向日葵分别接种5种生物肥料菌剂，分别是Y16、DSM19095、DSM40006、DSM10690和AS1.1216菌剂。试验结果显示，所有微生物菌剂都能够提高向日葵的生物量，Y16菌剂生物量最高，比对照提高38.56％；菌剂19095、40006、10690和1.1216的向日葵生物量分别比对照提高21.41％、20.1％、18.14％和15.69％，所有菌剂的生物量都低于Y16菌剂。充分说明Y16菌剂促进向日葵生长的效果显著，其生物量并不显著低于非盐碱土(表2)。
表2盆栽条件下生物肥料对轻度盐碱土向日葵生物量的影响
注：a、b、c表示处理组之间差异显著。
实施例3 Y16菌剂对田间向日葵的增产作用效果
1. 2015年在内蒙古巴彦淖尔市进行了不同微生物菌剂防治菌核病、柄锈菌病害的试验研究。田间试验在内蒙古乌拉特前旗进行，作物为向日葵，品种为LDS009。微生物菌剂使用量为50kg/亩，撒施播种垄行的地表，耕翻20cm，然后采用机械使用化肥和播种，同时覆盖地膜，氮磷钾复合肥(15:15:15)颗粒用量为60kg/亩。结果表明，整个生长期间向日葵没有任何病害发生，既没有菌核菌病害，也没有柄锈菌病害发生。地衣芽孢杆菌Y16菌剂产量最高，亩产量226.6公斤，增产达33.33％；促生菌E-5-1(本实验室分离)菌剂增产率略低于Y16，亩产量达到197.4公斤，增产16.2％；放线菌DSM40127菌剂亩产196.9公斤，增产达13.9％；DSM40033菌剂亩产向日葵籽粒183.0公斤，增产6.4％。表明地衣芽孢杆菌Y16菌剂具有提高产量、抑制病害的效果，展示了良好的应用潜力(表3)。
表3不同生物肥料对向日葵产量的影响(内蒙古，2015)
注：a、b、c、d表示处理组之间差异显著。
2.微生物菌剂田间试验
试验结果表明，除了试验区内没有发生向日葵锈病和烂盘病害之外，菌株Y6接种向日葵的产量最高，亩产量达到310.2公斤，增产67.6％；菌株DSM40033亩产量达到278.9公斤，增产率50.7％％；菌株ACCC11079的亩产量为254.5公斤，增产率37.5％。可以看出，尽管菌株ACCC1079和DSM40033增产效果明显，但低于菌株Y16。Y16表现显著的防病和增产作用(表4)。
表4不同菌株制备的生物菌剂对向日葵的作用效果(2015年)
注：a、b、c、d表示处理组之间差异显著。
实施例4 Y16菌剂大棚西红柿产量的作用效果
1.促生抗病生物肥料的西红柿田间试验效果
在化肥、有机肥大量使用条件下，对4种芽孢菌生物肥料不同用量的作用效果进行了研究。以J15(本实验室分离，鉴定为嗜麦芽窄食单胞菌属Stenotrophomonas sp.、JK24(本实验室分离，鉴定为巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium)、JK8(本实验室分离，鉴定为中间短波单胞菌Brevundimonas intermedia)三个菌株制备菌剂，与菌株Y16一起进行了田间试验。以灭菌草炭为载体制备的生物肥料用量110kg/亩，氮磷钾复合肥(15:15:15)用量83kg/亩，有机肥(鸡粪)用量7t/亩。第一次收获结果显示，以生物肥料Y16、JK24、J15的西红柿增产效果显著，分别比对照增加483.2、349.5、308.4kg/亩，分别提高29.0％、21.0％、18.5％，Y16菌剂的作用效果最好(表5)。
表5不同生物肥料菌剂对西红柿产量的影响(第1次收获)
注：a、b、c表示处理组之间差异显著，ab表示该处理组与a、b处理组间差异不显著。
2.在化肥、有机肥大量使用条件下，对4种生物肥料的作用效果进行了研究。本实验与表6为同一个试验。第二次收获产量结果显示，大棚西红柿接种生物肥料显著增产，以生物肥料Y16、J15的西红柿增产效果好，分别比对照增产1380.3kg/亩和741.6kg/亩，分别增产55.8％和30.0％，JK8菌剂仅增产212.9kg/亩。所有处理中，Y16菌剂的增产效果仍然最好(表6)。
表6不同生物肥料菌剂对西红柿产量的影响(第2次收获)
注：a、b、c、d表示处理组之间差异显著，cd表示该处理组与c、d处理组间差异不显著。
实施例5 Y16菌株平板抑制尖镰孢菌的效果
为了验证Y16拮抗病原真菌的能力，将尖镰孢病原真菌(ACCC36241)接种在PDYA培养基平板中央，在病原菌周围均匀划分为4个点，其中3个点接种Y16菌，另一点不接种Y16，作为对照。结果显示，接种Y16的3个点病原菌受到抑制，而不接种Y16的尖镰孢菌菌落生长较快。证明Y16具有抑制尖镰孢病原真菌生长的能力。(图1)
本发明对拮抗向日葵菌核病和锈病、防治大棚蔬菜连作障碍的高效拮抗菌Y16及其微生物菌剂进行了多方面研究，该菌剂能够防治向日葵菌核病和锈病、防治大棚蔬菜连作障碍，提高作物产量。开发的抗病增产的Y16微生物菌剂，展示出巨大的应用前景。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)Y16，保藏号CGMCC NO.13512。
2.含有权利要求1所述地衣芽孢杆菌Y16的微生物菌剂。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中还含有添加剂和保护剂；
其中，所述添加剂为二氧化硅、轻质碳酸钙、高岭土、膨润土、稻壳粉、麦壳粉、秸秆粉中的至少一种；
所述保护剂为甘油、脱脂奶、植物油、海藻酸钠、壳聚糖中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，由如下重量份的组分组成：
地衣芽孢杆菌Y16发酵液 1份；
添加剂 0.5-3份；
保护剂 0.01-0.05份；
所述菌剂中地衣芽孢杆菌Y16活菌数为2×108-5×109cfu/g。
5.权利要求1所述地衣芽孢杆菌Y16或权利要求2-4任一项所述菌剂在防治作物土传病害中的应用。
6.权利要求5所述的应用，其特征在于，所述土传病害的病原菌包括核盘菌、向日葵柄锈菌、尖镰孢菌。
7.权利要求1所述地衣芽孢杆菌Y16或权利要求2-4任一项所述菌剂在提高作物产量中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述作物包括大棚蔬菜；优选地，所述作物包括向日葵、大蒜、甜瓜、西红柿。
9.权利要求1所述地衣芽孢杆菌Y16或权利要求2-4任一项所述菌剂在制备农用复混肥中的应用。
10.一种农用复混肥，其特征在于，由权利要求2-4任一项所述菌剂与氮肥、磷肥、钾肥或复合肥组成。
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