KR101377800B1 - 불용성염 가용화 활성 및 항진균 활성이 있는 신규 균주 락토코커스 락티스 엘케이에스49 - Google Patents

불용성염 가용화 활성 및 항진균 활성이 있는 신규 균주 락토코커스 락티스 엘케이에스49 Download PDF

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Abstract

본 발명은 불용성염 가용화 활성이 있으며 식물병원성 진균류 중 Alternaria solani(토마토 겹둥근무늬병), Rhizoctonia solani(벼문고병), Fusarium oxysporum(입고병, 근부병), Sclerotinia sclerotiorum(균핵병)에 항진균 활성의 기능을 가진 신규 균주인 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49와, 이 균주를 작물 및 작물재배 토양에 처리하여 불용성 인산염을 가용화 하는 것과 위와 같은 식물병원성 진균들의 성장을 억제하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49는 토양내에 있는 불용성 인산염인 3마그네슘인산, 3칼슘인산, 패화석을 생물이 사용하는 가용성 인산 이온, 가용성 마그네슘, 칼슘 이온으로 만들어 주며 동시에 위와 같은 식물병원성 진균들의 성장을 억제해 준다.

Description

불용성염 가용화 활성 및 항진균 활성이 있는 신규 균주 락토코커스 락티스 엘케이에스49{Novel Lactococcus lactis subsp. lactis LKS49 comprising solubility upon insoluble salts and antifungal activity.}
본 발명은 불용성 인산염을 가용화하는 신규의 균주 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49와, 이균주를 작물 및 작물재배 토양에 처리하여 불용성 인산염을 가용화 하는 것과 식물병원성 진균류의 성장을 억제하는 것에 관한 것이다.
-불용성 인산염 가용화 균주
인(phosphorus)은 식물의 생장과 발육을 위해 매우 중요한 필수적 영양원소로서 대량의 공급이 필요한 대량영양원소(macronutrient)이다. 작물의 최대 수확을 위해서는 식물이 가용할 수 있는 인의 유무는 매우 중요한 조건이 된다. 식물이 생장하는 토양에는 400~1200mg/kg의 인이 포함되어 있다.(Rodriguez and Fraga, biotech. Adv. 1999, 17:319-339).
그러나 토양내 대부분의 인은 불용성 상태이어서 식물은 사용할 수가 없다. 즉, 토양내 인은 화학적으로 공고하게 결합된 불용성 복합체나 유기적으로 결합된 파이테이트(phytate)와 같은 상태로 존재하여 식물이 사용할 수 없는 불용성 인산염으로 존재한다.(Paul and Clark, Soil Microbiology and Biochemistry, Academic Press, San Diego, CA, 1996).
따라서, 자연상태의 토양에서 가용할 수 있는 인은 미량영양원소들(micronurtients)의 농도보다도 적은양으로 존재하고 있다. 결국, 가용성 인의 농도가 토양에서 식물의 생장과 발육의 증진에 있어 제한요소인 것이다. 더욱이, 토양에 가용성 인이 든 무기인산비료를 공급하면 이들 중 75% 이상이 매우 빠르게 불용성 인산염 상태로 변화되어 식물은 공급된 가용성 인의 25%이하만을 사용할 수 있다.(Goldstein, Am. j. Altern. Agric. 1986, 1:51-57).
따라서, 농부들은 가용성 인의 부족에 따른 식물의 생장 및 발육의 저하를 막고자 계속해서 과도한 무기 인산비료를 농토에 공급하는 과도한 시비를 반복하게 된다. 그러나 이렇게 과도한 시비로 공급되는 대부분의 가용성 인은 농토에서 다량의 불용성 인산염으로 변화되고 이것이 축적되어 결국은 식물의 생장 및 발육이 정상적으로 이루어지지 않는 염류장해 토양이 된다.
더욱이 이런 염류장해토양은 고부가가치의 작물을 생산하는 시설재배지에서 더욱 자주 발생하여 농업생산성 및 농업경제에 있어 매우 큰 문제가 되고 있다.
그러나, 다행스럽게도 토양에는 이러한 불용성 인산염을 가용화 상태로 전환하는 미생물들이 있음이 알려졌다. 이들 불용성 인산염을 가용화하는 미생물(phosphate solubilizing bacteria, PSB)은, 식물의 근부권에서 유기산을 분비하거나 특정 효소를 분비하여 토양의 불용성 인산염을 가용화 인으로 전환시켜 식물이 흡수하여 사용할 수 있도록 하는 일종의 공생관계를 유지하는 것으로 추정되고 있다.(Goldstein, Am. j. Altern. Agric. 1986, 1:51-57).
PSB 미생물은 슈도모나스(Pseudomonas), 바실러스(Bacillus), 라이조비움(Rhizobium), 부르크홀데리아(Burkholderia), 아그로박테리움(Agrobacterium), 마이크로코코스(Microccocus), 에어로박터(Aerobacter), 플라보박테리움(Flavobacterium)과 에위니아(Erwinia)에 속하는 몇몇 종들에서만 발견되었다.
이들의 불용성 인산염 가용화 스펙트럼을 조사한 결과, 특정 불용성 인산염에 대해서만 가용성이 있거나 혹은 그 가용성이 광범위한 경우 전반적으로 낮은 활성을 보였다.(lllmer and Schinner, Soil Biol. Biochem., 1992, 24:389-395;Rodriguez et al., Rev.ICIDCA, 1996, 30:47-54;Arora and Gaur, Indian J. Exp. Biol., 1979, 17:1258-1261; Halder and Chakrabartty, Folia Microbiol., 1993, 38:325-330).
PSB 미생물은 토양 내에 존재하기는 하지만 항상 그 세포수가 식물 근권을 형성하는 다른 미생물들과 경쟁하여 우점할 정도로 충분히 높지 않다. 따라서, 토양내 PSB 미생물들이 불용성 인산염을 분해하여 만드는 가용성 인의 양은 식물의 생장과 발육을 증가시킬 정도로 높지 않다. 그러므로 인위적으로 다량의 PSB 미생물을 토양에 접종할 경우 식물의 생장과 발육을 증가시킬 수 있는 유용성이 있다.
이처럼 불용성 인산염 가용화 미생물을 사용하여 식물 생장을 증진시키고자하는 연구가 수행되어 효과가 있다고 보고되었다(Kloepper et al.,ISI Atlas Sci. Anim. Plant Sci., 1988, pp. 60-64;Chabot et al.,Appl.Environ. Microbiol.,1996,62:2767-2772)
기존에 알려진 불용성 인산염 가용화 미생물 외에 신규한 불용성 인산염 가용화 미생물(PSB)을 발굴해내는 노력이 경주되어 라넬라 아쿠아틸리스(Rahnella aquatilis)가 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite)를 가용화 할 수 있음이 보고되었고(Kim et al., FEMS Microbiol. Lett., 1997, 153:273-277), 관련 유전자인 pqq도 확인된 바있다.(Kim et al., FEMS Microbiol. Lett., 1998, 159:121-127).
또한, Kim 등은 엔테로박터 아글로메란스(Enterobacter agglomerans)도 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite)를 분해하여 가용성 인을 생성할 수 있음을 확인한 바 있다.(Kim et., Soil Biol. Biochem., 1998, 30:995-1003).
한편, 한국공개특허공보 특2002-0017516(화산회 토양에 고정된 인산염을 가용화하는 새로운 미생물)에는 화산회 토양에 고정된 인산염을 가용화 시키는 바실러스 스패리쿠스 PBS-13에 관한 것이 공개되어 있다. 그러나 여전히 작물재배 토양내의 불용성 인산염을 가용화 하는 새로운 균주의 개발이 요구되고 있다.
-식물병원성 진균류에 대한 항진균
미생물 농약은 농작물의 해충, 잡초, 병원 미생물 등을 방제하기 위하여, 자연에서 분리 선발하거나 용도에 맞게 변형시킨 미생물, 또는 미생물이 분비하는 화합물 등을 제품화 한 것이다.
미생물농약의 개발에 있어 필수적인 요소는, 길항성이 뛰어난 유용 미생물을 선발하거나 변형하여 만들어 내고, 선발된 미생물 또는 미생물이 분비하는 약제를 대량 생산하여 이들을 농작물에 효율적으로 전달하여 사용하는데 있다.
최근 미생물을 이용한 미생물농약의 연구개발이 활발히 이루어지고 있다. 한국 특허출원 1990-0017551(신규의 바실러스 서브틸리스 아종 및 이로부터 생산되는 항진균 물질 KRF-001 복합체의 용도)에는, 항진균 올리고 펩티드계 물질을 생산하는 바실러스 서브틸리스 아종 크릭티엔시스(Bacilus subtilis subsp. krictiensis)에 관한 것이 있으나, 항진균 활성 스펙트럼이 좁은 문제점이 있었다.
한국 특허출원 1993-0022037(바이오캡슐화를 이용한 미생물 살충제의 제조방법)에는, 콩류의 천연 고분자를 물과 혼합하여 단백질이 풍부한 천연겔 매트릭스를 제조하고, 가압멸균 후, 바실러스 터링지엔시스 포자 등을 혼합 후, 건조시켜 바이오캡슐화된 미생물 살충제를 제조하는 방법에 관한 것이 있으나, 항진균 활성 스펙트럼이 좁고, 바이오 매트릭스의 구성 성분과 조성이 복잡한 점이 있었다.
한국 특허출원 1998-027468(개선된 코팅 농약성 매트릭스, 이의 제조방법 및 이를 함유한 조성물)에는 농약제, 중합체, 가소제, 자외선 보호제, 활성 증진제, 활착제를 포함하는 코팅된 농약성 매트릭스에 관한 것이 공지 되어 있으나, 항진균 활성 스펙트럼이 좁고, 효과도 한계를 가지고 있었다.
최근 시설재배면적의 급격한 증가는 농가의 재배환경에 대한 인식부족으로 염류 및 양분의 과잉축적을 일으켜 토양 중 필수양분의 불균형, 작물의 수분흡수 저해, 염류농도장해 등 작물생육에 장해를 유발하는 등 시설재배의 중요 문제점으로 대두되고 있다. 무기염류는 농작물의 생육에 있어서 중요한 요소이다. 농작물은 필요한 양의 염류를 흡수하고 나머지는 흡수하지 않으므로 미생물이 소비하거나 흡비력을 높여 제거하지 않으면 염류가 계속 축적되어 식물은 살아 갈수 없게 된다.
또한 환경 보호와 생태계 보전에 관한 그린 라운드 (Green Round) 협약이 국제적 관심의 대상이 되면서, 과다한 농약 등의 남용이 심각한 문제로 대두되고 이를 대체하는 식물 방제용 무공해 농약 (biocide)의 개발이 국제적으로 경쟁이 치열한 핵심 분야로 등장하고 있다. 기존 농약에 의한 환경오염 문제를 극복하기 위하여 생산, 저장 및 적용이 용이하고 병원균을 효과적으로 억제하는 길항 미생물을 선발하고 생물 활성물질을 개발하는 것은 매우 시급한 과제이다. 특히 항진균 활성 미생물과 물질은 포유동물에 대하여 독성이 기존 농약보다 낮고, 식물에 약해가 없으면서, 활성은 탁월하고 잔류성은 적어서 윤작에도 영향이 없으며 지하수, 토양, 하천수 등을 오염시키지 말아야 한다.
본 발명의 목적은 불용성염 가용화 활성(PS+) 및 항진균 활성(AF+)의 기능을 가진 신규의 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49와, 이 균주를 작물 및 작물재배 토양에 처리하여 작물재배토양의 불용성 인산염을 가용화 하는 것과 식물병원성 진균류의 성장을 억제하는 것에 관한 신규 균주를 제공하는데 있다.
본 발명에 의해 토양내 불용성 인산염을 가용화 하는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49균주가 제공 된다. 이 균주를 작물 및 작물재배 토양에 처리하여 불용성 인산염(3마그네슘인산, 3칼슘인산, 패화석)을 가용화할 뿐만 아니라 식물병원성 진균류 중 Alternaria solani(토마토 겹둥근무늬병), Rhizoctonia solani(벼문고병), Fusarium oxysporum(입고병, 근부병), Sclerotinia sclerotiorum(균핵병)의 성장을 억제하며 식물생장을 촉진한다.
도 1은 본 발명의 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49의 불용성 인산염 가용화능을 나타낸 사진
1 : 3마그네슘인산(Mg3(PO4)2)에 대한 가용화능, 2 : 3칼슘인산(Ca3(PO4)2에 대한 가용화능, 3 : 패화석에 대한 가용화능
도 2는 본 발명의 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49의 항진균 활성능을 나타낸 사진
도 3은 본발명의 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49의 계통분류학적 근연도를 나타낸 그림
도 4는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49를 염류장해 토양에 접종한 후 전기전도도의 변화를 나타낸 그래프
도 5는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49를 염류장해 토양에 접종한 후 인산(Pi)이온 농도 변화를 나타낸 그래프
도 6은 불용성 인산염을 인산원으로 공급했을 때 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49의 성장곡선(●-●)과 인산농도(■-■)변화를 나타낸 그래프
도 7은 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49를 장해토양에 처리했을 때 식물의 생장증진 효과
A : 상추, B : 배추, C : 고추 1:대조군, 2:LKS2 실험군
도 8은 가용화 균들을 혼합처리(바이셀라 김치 LKS2, 바이셀라 코리엔시스 LKS42, 락토코커스 락티스 LKS49, 바실러스 아리압하타이 LKS28) 했을 때 생장 증진효과
A:상추, B:배추, C:고추, 1:대조군, 2:혼합처리(LKS2, LKS42, LKS49, LKS28) 실험군
본 발명자들은 불용성 인산염 가용화능이 높은 균주를 선발하기 위하여, 김치들과 토양으로부터 분리한 미생물을 불용성 인산염들(3마그네슘인산, 3칼슘인산, 하이드록시아파타이트, 인광석, 파이테이트)이 각각 포함된 고체배지에 접종하여 배양하였을 때 나타나는 고체배지의 투명환 크기를 분석하여 불용성 인산염의 가용화능이 높은 균주를 선발하였다.
선발된 균주에서 수득한 16S 라이보좀 DNA의 상동성을 비교분석하고, 생물학적 특성을 조사한바, 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis)의 신규한 균주로 밝혀져, 이를 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49로 명명하고, 이 균주를 특허출원을 위한 국제미생물 기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2011년 11월 23일 기탁번호 KCTC 12087BP로 기탁하였다.
본 발명의 발명자들이 연구하여 개발한 동일자 출원하는 바이셀라 김치 LKS2, 바이셀라 코리엔시스 LKS42와, 바실러스 아리압하타이 LKS28과는 토양내 불용성 인산염을 가용화하는 기능은 유사하나 DNA의 염기서열과 계통분류학적 근연도를 조사한 결과 다른속, 다른 종임이 밝혀졌다.
본 발명의 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49은 그램양성 세균이며, 포자형성을 안하며, 락토바실러스 엠알에스(MRS)배지에서 1.5mm 전후 크기의 콜로니를 형성 하였다.
본 발명의 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49는 광범위한 불용성 인산염의 가용화능이 높기 때문에 염류 장해토양의 개선 및 식물생장증진에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49을 이용하여 장해토양의 개선 및 식물의 생장을 증진시키는 방법을 제공하며 식물병원성 진균류 중 Alternaria solani(토마토 겹둥근무늬병), Rhizoctonia solani(벼문고병), Fusarium oxysporum(입고병, 근부병), Sclerotinia sclerotiorum(균핵병)에 대한 항진균 활성을 가지므로 식물병원성 진균류에 대한 방제 방법을 제공한다.
본 발명의 균주를 이용하여 장해토양을 개선하고 식물 생장을 증진시키는 방법은, 트립톤-이스트(TYE) 액체배지 또는 MRS배지에서 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49을 배양하는 제 1단계와, 배양된 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49을 염류장해토양에 접종하여 식물의 생장을 증진하는 제 2단계로 구성되어 있다.
상기 1단계의 배양시 30~36℃에서 1~2일간 배양한다.
배양된 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49을 증류수나 NaCl 0.8%의 등장액으로 세척하여 보관한다.
보관된 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49을 1X107 CFU/ml 농도로 염류장해토양에 1주일에 1회씩 2회 접종한 후 상토에서 발아한 작물을 이식하여 생육한다.
작물 이식 후 계속하여 1주일 간격으로 4주간 더 본 발명의 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49을 접종한다.
상기의 방법으로 본 발명의 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49을 접종하면 염류장해 토양에서도 정상적인 작물의 생장과 발육이 이루어진다.
본 발명에서 선별된 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49를 진균류가 도말된 PDA (Difco Co.) 배지에 종이 디스크 (직경 6mm)를 이용하여 영양 배지에서 전 배양된 세포 배양액을 접종하고 30℃에서 2～3일간 배양함으로서 식물병원성 진균류에 대한 항진균 활성을조사하였다. 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49의 항진균 활성 스펙트럼을 조사하기위하여 다시 많은 공시 식물 병원성 진균류를 대상으로 항진균 활성 스펙트럼을 분석한 결과, 광범위 활성 스펙트럼을 확인하였다.
상기에서 식물병원성 진균은 Alternaria solani(토마토 겹둥근무늬병), Rhizoctonia solani(벼문고병), Fusarium oxysporum(입고병, 근부병), Sclerotinia sclerotiorum(균핵병)을 말한다.
이하 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명하나, 이들에 의해 본 발명의 내용이 제한되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 균주의 선발
토양으로부터의 균주선발을 위해서는 국내에서 채집한 토양을 2mm 체에 걸러 미생물 추출원으로 사용하였다.
습윤토양 5g에 25% Ringer's 용액 50ml을 넣고 2분간 진탕한 후, 1시간 교반하였다.
교반한 토양 시료를 5분간 초음파 처리를 3회 반복하여 토양입자로부터 미생물을 탈락 시켰다.
10분간 1,500 rpm으로 원심분리한 후, 상등액을 불용성 인산염 가용화 미생물의 탐색 시료로 이용하였다.
김치로부터의 균주선발을 위해서는 엠알에스(MRS)배지와 트립톤 이스트(TYE)배지에서 배양한 후 분리 선별 하였다.
토양과 김치로부터 분리한 미생물들을 최소배지인 MOPS 배지에 불용성 인산염(3마그네슘인산, 3칼슘인산, 패화석)이 각각 포함된 고체배지에 접종하여 배양하였다.
배양 후 고체배지에 투명환을 나타내는 불용성 인산염 가용화 균주를 순수배양하였다.
순수배양된 균주를 상기의 불용성 인산염 고체배지에 각각 접종하여 각 균주의 불용성 인산염 가용화 범위를 조사하였다(도 1).
투명환의 크기를 분석하여 불용성 인산염의 가용화능이 높은 균주를 분리하였다.
또한 상기 분리한 미생물을 식물병원성 진균류가 도말된 PDA (Difco Co.) 배지에 종이 디스크 (직경 6mm)를 이용하여 영양 배지에서 전 배양된 세포 배양액을 접종하고 30℃에서 2～3일간 배양함으로서 식물병원성 진균류에 대한 항진균 활성능을 조사하였다(도 2).
< 실시예2 > 분리된 균주의 염기서열과 기존 균주와의 유전유사도 조사
실시예 1에서 선발한 균주의 유전체(genomic DNA)를 CTAB용액을 이용하여 분리하였다.
16S 라이보좀 DNA(rDNA)을 PCR을 이용하여 증폭하여 클로닝하고 그 염기서열을 결정하였다.
결정된 16S rDNA의 염기서열을 NCBI의 유전자은행에 등록된 균주들과 비교하여 계통수와 유전유사도를 조사하고 그 결과를 도 3에 나타냈다.
도 3에서 보는바와 같이 선발된 균주는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis)의 신규균주로 나타났다.
본 발명자들은 선발된 균주를 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49로 명명하고 이를 2011년 11월 23일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 등록기탁하였다.(기탁번호 : KCTC 12087BP)
< 실시예 3> 락토코커스 락티스 ( Lactococcus lactis subsp . lactis ) LKS49 균주의 활용
트립톤-이스트(TYE) 액체배지를 준비한다.
실시예 1에서 얻은 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49을 2일간 36℃에서 배양했다.
배양된 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49 미생물을 NaCl 0.8%의 등장액으로 세척하여 보관했다.
준비해놓은 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49을 염류장해 토양에 1X107 CFU/ml의 농도로 증류수에 희석하여 1주일에 1회씩 2회 접종하였다.
상토에서 발아한 작물을 이식한 후, 1주일에 1회씩 4주간 더 접종하여, 염류장해토양에서의 작물에 본 발명의 미생물을 활용하여 토양을 개선시켰다.
< 실시예 4> 염류장해토양 개선 효과
본 발명의 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49을 2일간 30℃에서 배양한 다음, 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49을 1X107 CFU/ml의 농도로 50ml의 증류수에 희석하여 150g의 염류장해 토양에 접종한 후, 전기전도도의 변화를 조사하였다.
대조군은 증류수만을 처리하였다.
전기전도도를 측정하기 위한 토양용액은 토양과 수분의 비율이 1:5가 되도록 증류수를 첨가하여 2~3시간 방치한 후, 여과 침출하여 사용하였다.
그 결과, 접종전 염류장해토양의 전기전도도가 10.2ds/m 이던 것이, 접종 후부터 낮아져 4일 이후부터는 5.0 ds/m 까지 나타났다(도 4 참조)
상기의 결과로부터, 본 발명의 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49 균주는 염류장해토양의 전기전도도를 낮추는 개선 효과가 있음을 알수 있었다.
< 실시예 5> 가용화 인의 함량 변화 조사
염류장해토양의 수용성 가용화 인의 함량을 조사하기 위하여 10g의 염류장해토양에 50ml의 증류수를 첨가하여 3시간동안 진탕한 후 여과하여 토양용액으로 사용하였다.
인산의 양은 아스코르브산에 의한 몰리브덴 청법을 사용하여 측정하였다.
실험군의 경우는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49를 1X107 CFU/ml의 농도로 50ml의 증류수에 희석하여 150g의 염류장해토양에 접종한 후 24시간마다 10g의 처리토양을 취하여 대조군의 경우와 같이 50ml의 증류수를 첨가하여 3시간 동안 진탕한 후 여과하여 토양용액으로 사용하였다.
인의 측정은 역시 아스코르브산에 의한 몰리브덴 청법을 사용하여 측정하였다.
그 결과, 염류장해토양의 가용화 인의 함량은 25㎍/g이었는데 비해서 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49균주를 접종한 경우는 처리 후 계속 대조군에 비하여 3배 이상의 수용성 가용화 인이 형성되었으며 5일째는 35㎍/g으로 낮아졌다(도 5).
상기의 결과로부터, 본 발명의 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49 균주는 염류장해토양으로부터 다량의 수용성 가용화 인을 생산하는 생인산비료세균(biofertilizer)임을 알 수 있었다.
< 실시예 6>여러 가지 불용성 인산염 가용화능과 생장률 및 염류제거능
다른한편으로 최소배지인 MOPS 배지에 인산을 결핍시킨 후 불용성 인산염인 3칼슘인산(tricalciumphosphate), 3마그네슘인산(trimagnesiumphosphate)를 인산 가용화 배지에 각각 0.5%로 첨가하여 배지를 조제한 후 균주들을 접종하여 시기별로 10 ㎖씩 취하여 생장률을 측정한 후 배양액을 원심분리한 후 상등액을 이용하여 배지에 가용화된 Pi를 측정하여, 불용성 인산염의 가용화와 분해정도를 조사하였다.
그 결과 생장률은 불용성 인산염 배지간에 다소 차이는 있으나 공시균주 대부분이 배양후 3일째에 최대생장량을 보였다. 유리된 Pi 함량변화의 경우 유일한 인원으로 공급한 3칼슘인산 배지 그리고 3마그네슘인산 배지 모두에서 Pi의 양이 높게 나타나 3칼슘인산과와 3마그네슘인산의 가용화가 매우 왕성함을 보였다(도 6).
< 실시예 7>작물의 발아율 변화 양상
각각의 균주에 대한 작물의 발아율 변화양상을 알아보기 위하여 TYE 배지에서 1일 배양하여, 0.85% 생리식염수로 3번 세척한 후 멸균 증류수에 현탁시킨 후 4개의 페트리접시에 와트만 No 2 여과지 2겹을 바닥에 깔은 후 각각의 균주들을 ㎖당 1×107CFU가 되도록 처리하였다. 현탁액 5㎖을 접종한 후 배추 종자를 한 plate에 25립씩을 상치하여 2일과 3일 후의 발아율을 조사하였으며, 대조군으로는 멸균 증류수를 사용하였다. 그 결과 대조군에 비하여 유의적인 차이를 보이지 않았으며, 오히려 본 연구진에 의하여 탐색되어진 인산염가용화 균주를 처리하였을 때 대조구에 비하여 3일째 발아율이 동일하거나 LKS42과 LKS49의 경우 2%씩 발아율이 증가하는 것을 알 수 있었다(표 1. 참조). 이러한 결과로 본 연구진에 의하여 탐색되어진 불용성 인산염 가용화 균주들은 종자에 아무런 피해를 일으키지 않음을 알 수 있었다.
배추의 발아율 변화양상
DW LKS2현탁액 LKS42현탁액 LKS49현탁액 LKS28현탁액
96 96 98 98 96
< 실시예 8> 폿트실험
표 1에서의 발아율의 결과를 토대로 각각의 종자(상추, 배추, 고추)를 상토에서 발아시킨 후 본 잎이 2장이 나왔을 때 장해토양이 채워진 폿트에 정식하여, 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49를 ㎖당 107CFU가 되도록 처리한 후 폿트 실험을 수행하였다. 정식 후 불용성 인산염 가용화 균주를 접종하여 7일째 성장률을 조사하였다. 그 결과 장해토양(대조군)에 비하여 각각의 균주를 장해토양에 접종하였을 때 상대적으로 성장률이 우수하였다.
다른 한편으로는, 동시 특허 출원하는 가용화 균주들을 혼합하여 장해토양에 접종하였을 때 성장률을 비교한 결과 대조군에 비하여 각각의 작물에서 모두 우수하였다.

Claims (6)

  1. 불용성염 가용화 활성이 있으며 식물병원성 진균류 중 Alternaria solani(토마토 겹둥근무늬병), Rhizoctonia solani(벼문고병), Fusarium oxysporum(입고병, 근부병), Sclerotinia sclerotiorum(균핵병)에 대한 항진균 활성이 있는 신규균주 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis subsp. lactis) LKS49(기탁번호 : KCTC 12087BP)
  2. 제 1항의 균주를 작물 또는 작물 재배 토양에 접종하여 토양내 불용성염을 가용화하여 토양 개량과 작물의 생육을 촉진하는 방법
  3. 제 1항의 균주를 이용하여 생물폐자원인 패화석을 가용화하는 방법
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
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