KR101085832B1 - 신규 미생물 바실러스 네마토토시타 ｃｊ13-2 및 이를 포함하는 토양미생물 비료 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규 미생물 바실러스 네마토토시타 CJ 13-2 및 이를 포함하는 토양미생물 비료에 관한 것이다.
본 발명의 신규 미생물 바실러스 네마토토시타(Bacillus nematotocita) CJ 13-2 균주 KACC(91662P)는 서열번호 1로 표현되며 토양내 유기물분해를 촉진하고 불용성 인산염을 가용화시키는 능력이 우수한 것이 특징이다.
본 발명에 의해, 토양내 유기물분해를 촉진하고 고정된 불용성 인산염을 가용화 시키는 능력이 우수한 신규 미생물인 바실러스 네마토토시타 CJ 13-2 및 이를 포함하는 토양미생물 비료를 제공함으로써 좀 더 효율적인 작물재배를 할 수 있도록 해준다.

Description

신규 미생물 바실러스 네마토토시타 ＣＪ13-2 및 이를 포함하는 토양미생물 비료{NEW MICROORGANISM BACILLUS NEMATOTOCITA CJ 13-2 AND SOIL MICROBIAL FERTILIZER COMPRISING THE SAME}

본 발명은 신규 미생물 바실러스 네마토토시타 CJ 13-2 및 이를 포함하는 토양미생물 비료에 관한 것으로서, 특히 토양내 유기물분해를 촉진하고 불용성 인산염을 가용화함으로써 작물 생육을 촉진시키는 신규 미생물 바실러스 네마토토시타 CJ 13-2 및 이를 포함하는 토양미생물 비료에 관한 것이다.

오늘날 농업은 화학비료나 농약의 과다사용, 염류의 집적현상 등을 초래하여 농가의 소득저하, 작물의 품질저하 등이 많이 나타나고 있는 실정이다.

따라서, 화학비료나 농약의 사용을 줄이거나 대체 할 수 있는 생물학적처리가 대두되고 있으며, 특히 토양생태계의 변화나 생물학적 방제의 기술이 미생물에 의해 가능하다는 것이 국내·외 여러 연구자들에 의해 입증되어지고 있다.

즉, 농업생산성을 지속하기 위해서는 토양의 건전성 확보가 필수적인데, 이는 무엇보다도 농업의 지속성을 위협하는 큰 요인인 화학비료 및 농약의 과다사용과 장기연용에 따른 토양악화에 있다.

특히, 화학비료의 연용은 토양을 산성화시킬 뿐 아니라 토양 내 염류집적에 의해 토양의 물리성을 악화시킴으로서 잠재적인 농업 생산성을 감소시킨다.

바실러스 속(Bacillus sp.) 균주는 그람양성 간균으로서 토양 내에서 쉽게 분리 될 수 있다. 또한, 여러 가지 분해효소를 이용하여 토양내의 염류집적현상을 해소 할 뿐만 아니라 세포외로 분비되는 여러 가지 독소를 이용하여 항진균활성을 가지는 장점이 있어 토양 미생물제제의 개발에 많은 관심의 대상이 되어지고 있다.

그러나 현재, 상기와 같은 효능들만 언급되어 있는 바실러스 속 균주만 알려져 있을 뿐, 토양내 유기물분해를 촉진하면서 식물의 생장과 발달을 위해 매우 중요한 필수 영양원소인 인(phosphorus)을 가용화하는 효과를 나타내는 균주는 알려진 바가 없다.

즉, 토양 내에 존재하는 대부분의 인은 화학적으로 공고하게 결합된 불용성 복합체나 유기적으로 결합된 파이테이트(phytate)와 같은 상태로 존재하여 식물이 전혀 사용할 수 없는 불용성 인산염으로 존재한다.

따라서 농작물의 생산성을 향상시키기 위하여 과도한 무기인산비료를 농토에 공급하는 시비가 반복되고 있다.

이러한 인산의 과도한 공급은 일부분만이 농작물에 흡수되고 나머지는 수분과 함께 토양 표층으로 이동하면서 수분은 증발하고 염류만 쌓이게 되어 농작물의 생장이 정상적으로 이루어지지 않는 염류장해 토양이 된다. 염류가 과도하게 집적된 토양은 식물의 영양분 흡수와 생육을 방해함으로써 각종 질병 감염 위험을 높이며, 지표수의 부영양화와 지하수의 오염을 초래하게 된다.

본 발명의 목적은 토양내 유기물분해를 촉진하고 불용성 인산염을 가용화함으로써 작물 생육을 촉진시키는 신규 미생물 바실러스 네마토토시타 CJ 13-2 및 이를 포함하는 토양미생물 비료를 제공하는데 있다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한, 본 발명의 신규 미생물 바실러스 네마토토시타(Bacillus nematotocita) CJ 13-2 균주 KACC(91662P)는 서열번호 1로 표현된다.

특히, 상기 신규 미생물은 토양내 유기물분해를 촉진하고 불용성 인산염을 가용화함으로써 작물생육을 촉진시키는 것이 특징이며, 미생물 농약, 종자코팅제, 토양개량제, 퇴비부숙제, 엽면살포제 또는 관주살포제 중 어느 하나의 유효성분으로 이용된다.

본 발명의 토양미생물 비료는, 상기와 같은 신규미생물의 균체 또는 배양액 중 어느 하나 이상을 포함하는 것이 특징이다.

본 발명은 상기 토양미생물 비료를 토양에 살포 또는 관주하여 토양내 인산가용화능을 높여주는 방법을 제공한다.

본 발명에 의해, 토양내 유기물분해를 촉진하고 불용성 인산염을 가용화함으로써 작물 생육을 촉진시키는 신규 미생물 바실러스 네마토토시타 CJ 13-2 및 이를 포함하는 토양미생물 비료를 제공함으로써 좀 더 효율적인 작물재배를 할 수 있도록 해준다.

도 1은 본 발명의 선발균주인 바실러스 네마토토시타(Bacillus nematotocita) CJ 13-2 균주의 투명대를 나타낸 도면이다.
'A': 탈지분유(Skim milk)가 첨가된 NA배지
'B': 가용성전분이 첨가된 NA배지
도 2는 도 1의 선발균주에 대한 일별 균체성장정도, 프로테아제(protease), 아밀라아제(amylase) 생성변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 도 1의 선발균주에 대한 초기 pH별 균체성장정도, 프로테아제(protease), 아밀라아제(amylase) 생성변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 도 1의 선발균주에 대한 일별 pH, 가용성인산량, 포스파타아제(phosphatase) 생성변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 도 1의 선발균주에 관한 계통분류학적 계통수(phylogenetic tree)를 나타낸 도면이다.
도 6은 도 1의 선발균주의 그람염색 후 나타난 사진도면이다.

본 발명은 토양으로부터 분리하여 새로 선발된 균주와 16S 라이보좀 RNA 간의 상동성을 비교분석한 바, 상기 선발균주는 바실러스 네마토토시타(Bacillus nematotocita)의 신규한 균주로 밝혀졌다.

이에, 본 발명은 상기 선발균주를 바실러스 네마토토시타(Bacillus nematotocita) CJ 13-2 균주로 명명하고, 이 균주를 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하여 2011년 08월 12일 수탁번호 KACC91662P를 부여받았다.

본 발명은 상기의 바실러스 네마토토시타(Bacillus nematotocita) CJ 13-2 균주는 서열번호 1로 기재되는 염기서열 전체 또는 그것의 일부로 이루어지며, 789bp의 오픈 리딩 프레임(ORF)으로 구성됨을 확인하고, 토양내 유기물 분해를 촉진하고 불용성인산을 가용화함으로써 작물생육을 촉진시키는 효과를 갖는 것을 알아내었다.

본 발명의 토양미생물 제제(배양액)은 상기 신규 균주를 포함하는 것으로, 상기 균주의 생장온도 및 pH는 어느 조건이든 균주의 인산가용화 활성을 나타내므로 조건을 한정하지 않으나, 특히 30~37℃에서 pH 5~8일때 균주활성이 잘 일어난다.

본 발명의 토양미생물 비료는 상기와 같은 신규 균주의 균체 또는 배양액 중 어느 하나이상을 포함하는 것이 특징이다.

이러한 본 발명의 토양미생물 비료에는 미생물 보호제로서 적합한 글리세롤, 분유, 우유, 탈지분유 또는 동식물유 등을 추가로 첨가할 수 있으며, 영양 공급원으로서 섬유소 분말, 대두박 분말, 면실박 분말, 각종 동식물성 펩톤, 밀기울 분말, 옥수수 추출물, 효모 추출액, 당밀, 포도당, 설탕, 옥수수시럽 등과 같은 탄소원 및 질소원과 무기염류 등을 추가로 통상의 양으로 포함하여 상기 균주의 효능을 더 촉진하도록 한다.

상기와 같은 방법에 의해 수득된 토양미생물 비료는 일반적인 제형기를 사용하여 적당한 크기의 분말, 펠렛 또는 과립 등의 다양한 형태로 제형화 될 수 있다.

상기에서 제형화된 본 발명의 미생물 비료는 그대로 사용되거나 또는 실온에서 풍건하거나 동결 건조 또는 고온 건조 방법으로 건조시켜 사용할 수 있다. 또한, 쌀겨와 혼합하고 이를 상온에서 확대 배양한 후 토양에 적용시킬 수도 있다.

이러한 본 발명의 토양미생물 비료를 토양에 적용하는 경우 토양에 살포 또는 관주하는 방법을 적용하여 토양내 불용성 인산염을 가용성 인산염으로 전환시켜줌으로서 토양내 유기물분해가 촉진되고 작물의 인산 흡수 및 생육을 촉진할 수 있는 효능이 장기간 동안 유지하게 된다.

이하, 본 발명의 내용을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하기로 한다.

실시예1 : 신규균주의 탐색 및 분리

토양내 유기물분해를 촉진시켜 작물생육을 돕고자 유기물 분해능이 뛰어난 우수균주를 선발하고자 사과, 복숭아 과원의 토양을 채취하여 다음과 같은 방법으로 분리하였다.

일단, 토양 10g을 90㎖ 멸균수가 들어있는 삼각플라스크에 넣어 20분간 진탕(120rpm)한 후 생성된 상층액에 대해 탄수화물 분해능을 알아보기 위하여 가용성 전분이 1% 첨가된 NA(nutrient agar)배지를 준비하고 단백질 분해능을 알아보기 위하여 탈지분유(skim milk)가 10% 첨가된 NA(nutrient agar)배지를 준비하였다.

상기 준비된 배지들에 각각 상기 상층액을 넣고 30℃에서 3일 동안 배양한 후 균주 주위에 투명대를 형성하는 균체를 선발하여 단일균주로 확보하였다.

그 결과 도 1에 도시된 바와 같이, 선발된 단일균주 중 상기 배지들 모두 넓은 투명대를 형성함을 확인하였고, 이때 이 투명대를 형성하는 균주를 유기물 분해능이 우수한 균주로 최종 선발하였다.

실시예 2: 선발균주의 기능탐색

상기 실시예 1에서 최종 선발된 균주(13-2)의 기능을 분석하기 위해 탄수화물, 단백질, 불용성인산 분해능을 조사하였다.

선발균주의 탄수화물 분해효소(amylase), 단백질분해효소(protease), 불용성인산 분해효소능(ability phosphate solubilizing) 생성유무를 가용성전분, 탈지분유(skim milk)를 각각 첨가한 NA(nutrient agar)배지와 Ca₃(PO₄)₂가 함유된 PVK 배지에서 조사하였다.

그 결과, 하기 표 1과 같이 나타났다.

	Amylase	Protease	Ability phosphate solubilizing
실시예1에서 최종선발된 균주(131-2)	++	++	+

+: 좋음(good). ++: 매우 좋음(very good), -: 없음(none)

상기 표 1에 나타나 있듯이 상기 선발균주는 protease, amylase에 매우 좋은 생성능을 나타냄으로써 토양내 유기물분해를 촉진시키며, 높은 인산염 가용화능도 갖음을 확인하였다.

실시예 3: 가수분해효소( protease , amylase ) 생성능 측정

상기 실시예1에서 분리된 선발균주(13-2)의 가수분해효소 생성능의 일별변화를 알아보기 위하여 NA 영양(Nutrient broth)배지에 단일균주 선배양액 1%을 접종하고 30℃에서 5일간 배양하였다.

배양 중 24시간 간격으로 일별 균체성장, 프로테아제(protease), 아밀라아제(amylase) 분석(assay)을 실시하였다.

구체적으로 설명하면, Protease assay는 배양 상등액 1㎖에 0.65% 카제인 용액(Casein solution) 5㎖를 첨가하여 37℃, 10분 반응 후 110mM 트리클로로 아세트산 시약(Trichloroacetic acid reagent) 5㎖를 첨가하여 37℃, 30분 반응시켰다.

상기 반응액은 0.45㎛ 필터로 필터링(여과)하고, 필터링한 반응용액(여과액) 2 ㎖에 500mM 탄산나트륨 용액(Sodium carbonate solution) 5㎖, 페놀시약(Folin&Ciocalteu's phenol reagent) 1㎖를 첨가하여 37℃, 30분 반응 한 후 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 흡광도 660nm에서 측정하였다.

Amylase assay는 배양상등액 1㎖에 1.0% 가용성전분용액(Soluble starch solution) 1㎖을 첨가 한 후 20℃, 3분 동안 반응시킨 후 컬러 시약용액(Color reagent solution) 1㎖를 넣고 15분 동안 끓인 후 실온에서 식히고 증류수 9㎖를 첨가한 후 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 흡광도 540nm에서 측정하였다.

균체성장은 일별로 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 흡광도 660nm에서 측정하였다.

그 결과 도 2에 나타나 있듯이, 균체성장정도는 배양 후 1일부터 4일까지 차이를 보이지 않았으며 5일째 되는 날 감소하는 것을 볼 수 있었다.

또한, Protease의 활성도 배양 일수에 따른 변화는 보이지 않았으나, Amylase의 활성은 배양 3일 후부터 급속히 감소하여 배양 4일과 5일째에 거의 나타나지 않았다.

즉, 상기 실시예1에서 분리된 선발균주가 성장됨에 따라 가수분해효소도 생성됨을 알 수 있었다.

실시예 4: 초기 pH 가 선발균주에 미치는 영향확인

상기 실시예1에서 분리한 선발균주(13-2)에 미치는 초기 pH의 영향을 알아보기 위하여 NA 영양(Nutrient broth)배지에 단일균주 선배양액 1%을 접종하고 30℃에서 1일간 배양 후 균체성장, protease, amylase assay를 실시하였다.

그 결과 도 3에 나타나 있듯이, 상기 실시예1에서 분리한 선발균주(Bacillus nematotocita CJ 13-2, KACC91662P)는 초기 pH 4와 pH 9에서 균체성장 및 효소활성을 미비하게 보였으며, 주로 활동범위는 pH 5에서 pH 8로 나타남을 확인하였다.

실시예 5: 불용성 인산의 가용화능 측정

상기 실시예1에서 분리한 선발균주(13-2)를 대상으로 불용성 인산의 가용화능을 조사하였다.

상기 선발균주는 0.5% 불용성인산(tricalcium phosphate)이 포함된 PVK배지 25㎖에 단일균주 선배양액 0.5㎖을 접종하여 120rpm으로 37℃에서 5일간 배양하였다.

배양 중 24시간 간격으로 배양액으로부터 유리된 인산을 ICP로 측정하였으며 5일동안 포스파타아제(phosphatase) 활성을 조사하였다.

포스파타아제 활성은 배양 상등액 1㎖을 25mM의 p-니트로페틸 포스파테(p-nitrophenyl phosphate, pNP) 1㎖과 통상의 버퍼(universal buffer, pH 6.5) 4㎖를 각각 혼합하여 37℃에서 1시간동안 반응시킨 뒤 0.5M CaCl₂ 1㎖과 0.5M NaOH 1㎖을 첨가한 반응액을 0.45㎛ 공극의 여과막으로 여과한 다음, 400nm에서의 흡광도를 측정하였다.

또한, 각각의 가용성인산량과 pH를 조사하였다.

그 결과 도 4에 나타나 있듯이 선발균주의 일별 가용성인산량 및 pH는 배양 후 1일째부터 4일째까지 변화가 없었으며 5일째 가용성인산량이 다소 감소하는 것으로 나타났다. Phosphatase의 활성 또한 일별 큰 변화를 보이지는 않았으나 배양 후 3일째활성을 가장 많이 나타나는 것으로 조사되었다.

실시예 6: 선발균주의 동정

상기 실시예1에서 분리한 선발균주(13-2)의 동정을 위하여 염기서열분석을 한 결과 첨부된 서열목록에 나타낸 바와 같다.

즉, 염기서열 분석결과를 토대로 염기서열 유사도가 높은 표준균주와의 유연관계를 확인하기 위하여 유전자은행에 등록된 균주들과 비교하여 계통수(phylogenetic tree)를 조사하였다.

그 결과 도 5에 나타나 있듯이, 표준균주와의 유연관계는 바실러스 네마토토시타(Bacillus nematotocita) AY820954 (99%)와 가장 유사한 관계를 보여 선발균주를 Bacillus nematototicita로 동정하였다.

또한, 상기 선발균주를 그람염색법으로 염색한 결과 도 6에 나타나 있듯이 형태학적 특성으로 그람음성균 간균이며, 첨부된 기탁증명서에 기재되어 있듯이, 토양 신규미생물인 바실러스 네마토토시타(Bacillus nematotocita ) CJ 13-2로 명명하였으며, 이 균주를 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하여 2011년 08월 12일 수탁번호 KACC91662P를 부여받았다.

이에, 본 발명에서 토양내 유기물분해를 촉진하고 불용성 인산염을 가용화 시키는 능력이 우수한 신규 미생물인 바실러스 네마토토시타(Bacillus nematotocita) CJ 13-2를 제공함으로써 좀 더 효율적인 작물재배를 할 수 있게 되어 토양의 개량을 위한 비료의 유효성분으로도 이용가능하게 된다.

상기의 본 발명은 바람직한 실시예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

국립농업과학원 농업유전자원센터 KACC91662P 20110812

서열목록 전자파일 첨부

Claims (5)

1. 서열번호 1로 표현되는, 신규 미생물 바실러스 네마토토시타(Bacillus nematotocita) CJ 13-2 균주 KACC(91662P).
   
2. 제1항에 있어서,
   토양내 유기물분해를 촉진하고 불용성 인산염을 가용화함으로써 작물생육을 촉진시키는,
   신규 미생물 바실러스 네마토토시타(Bacillus nematotocita) CJ 13-2 균주 KACC(91662P).
   
3. 제1항에 있어서,
   미생물 농약, 종자코팅제, 토양개량제, 퇴비부숙제, 엽면살포제 또는 관주살포제 중 어느 하나의 유효성분으로 이용되는,
   신규 미생물 바실러스 네마토토시타(Bacillus nematotocita) CJ 13-2 균주 KACC(91662P).
   
4. 제1항의 서열번호1로 표현되는 바실러스 네마토토시타(Bacillus nematotocita) CJ 13-2 균주 KACC(91662P)의 균체 또는 배양액 중 어느 하나 이상을 포함하는, 토양미생물 비료.
   
5. 제4항의 토양미생물 비료를 토양에 살포 또는 관주하여 토양내 인산가용화능을 높여주는 방법.
   

Images