CN102061273B - 一株具有解磷作用的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株具有解磷作用的枯草芽孢杆菌及其应用。涉及一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XF-8，CCTCC NO：M 2010182以及利用该菌产生中性植酸酶的方法。菌种接至LB培养基，30℃振荡培养过夜，以1～5％接种量接种于产酶培养基中，pH：5.5～7.5，25～37℃振荡培养2～4天；4℃，5000rpm，离心15min，取上清，得到中性植酸酶粗酶；稀释10倍后，测定发酵液的酶活；其中产酶培养基的碳源为麦麸，氮源为酪蛋白胨和(NH4)2SO4。该菌产生的中性植酸酶在pH 7.0时具有很高的酶活；能够应用于鱼类饲料开发，降低水体中磷的污染；还能用于研制生物菌肥，有效利用土壤中有机磷，减少磷肥施用量，改善土壤微环境，提高农产品的品质。

Description

一株具有解磷作用的枯草芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及枯草芽孢杆菌新菌株及其应用，特别是涉及一株具有解磷作用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XF-8及应用此菌产生中性植酸酶的方法。
背景技术
磷是动植物生长的必需元素，在生命活动过程中发挥着重要的作用。土壤中的磷大部分以植酸态、核酸、磷脂态等有机磷形式存在，不能被植物直接吸收利用，并且作为磷肥原料来源的磷矿石地下储存量非常有限，这将使磷成为制约现代农业可持续发展的一个重要因素。另一方面，水产养殖业中，鱼类饲料中40～70％的磷也以植酸态形式存在，因鱼类消化道内缺乏水解植酸磷的酶类，磷大部分随粪便排出，不但不能充分利用饲料中的磷源，而且造成严重的水体磷污染。因此，急需解磷菌产生出酶类物质将有机磷转化成生物体易于吸收的磷。植酸酶就可以催化植酸及植酸盐水解成低磷酸化的肌醇衍生物和磷酸(或磷酸盐)，提高磷和其它微量元素的生物利用率。但目前大多植酸酶都属酸性植酸酶(pH2.5～5.5)。因此，研究开发新的菌株，使其能产生中性植酸酶，有效pH作用范围在6.5～7.5之间，能够提高中性条件下的解磷效果，应用于磷细菌肥料和鱼类(消化道呈中性)饲料的开发，提高土壤或饲料中磷的利用率，改善土壤及水体生态环境，具有重要意义。
发明内容
本发明的目的之一是提供一株能产生中性植酸酶的具有解磷作用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XF-8。
本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XF-8分离自山东省济宁市田间土壤，在筛选平板上产生水解圈，菌落边缘整起，湿润，革兰氏阳性，并结合16SrDNA和BIOLOG微生物鉴定系统进行鉴定，确定该菌株为枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XF-8。该菌已于2010年7月16日保藏在中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2010182。
本发明的第二个目的是提供利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XF-8CCTCC NO：M 2010182产生中性植酸酶的方法。
为实现这目的，本发明采取以下技术方案：菌种接至LB培养基，30℃振荡培养过夜，以1～5％接种量接种于产酶培养基中，pH 5.5～7.5，25～37℃振荡培养2～4天。4℃，5000rpm，离心15min，取上清，得到中性植酸酶粗酶；稀释10倍后，测定发酵液的酶活。
利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XF-8CCTCC NO：M 2010182发酵产生植酸酶的培养基碳源为麦麸，氮源为酪蛋白胨和(NH4)2SO4，其中的酪蛋白胨有利于诱导植酸酶的产生。
由本发明所得到的中性植酸酶具有良好的热稳定性，其pH作用范围在6.5～7.5之间，可以有效弥补酸性植酸酶的不足，能够应用于鱼类饲料开发，降低水体中磷的污染；还能用于研制生物菌肥，有效利用土壤中有机磷，减少磷肥施用量，改善土壤微环境，提高农产品的品质。
附图说明
图1为植酸酶标准曲线。
具体实施方式
在下面的实施例中所用菌种均为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XF-8CCTCCNO：M 2010182，实施例中不同培养基及溶液配方如下：
1.LB培养基：1000ml水，10.0g蛋白胨，5.0g酵母浸粉，5.0gNaCl，pH 7.0-7.2。
2.筛选培养基：1000ml水，20.00g葡萄糖，2.00g CaCl2，5.00g NH4NO3，0.50g KCl，0.50g·MgSO4·7H2O，0.01g FeSO4·7H2O，0.01g MnSO4，3.00g植酸钙，15.00g琼脂。
3.产酶培养基：称取100g麦麸加入900ml H2O中，121℃下60min，6层纱布过滤，滤液定容至1L，加入0.4g(NH4)2SO4，0.2g MgSO4·7H2O，0.5g KH2PO4，0.4g K2HPO4，2.0g CaCl2，10.0g酪蛋白胨。
4.酶活测定溶液：
酶稀释液：2mmol/L CaCl2，50mmol/L Tris-HCl，pH 7.0，10％甘油；
底物溶液：2mmol/L植酸钠(100mmol/LTris-HCl pH 7.0，2mmol/L CaCl2)
终止液：20％三氯乙酸(TCA)；
硫酸亚铁·硫酸铵显色液：[(1.5％钼酸铵∶5.5％硫酸)∶(2.7％硫酸亚铁)＝4∶1，v/v]
1.5g钼酸铵溶于水，加入98％浓硫酸5.6mL，定容至100mL；0.68g硫酸亚铁溶于25mL水，两部分混匀，存放于4℃。
5.磷标准液(用于计算直线回归方程)：
A、50mM磷酸盐母液：1.3609g KH2PO4(干燥)溶于200ml重蒸水中(定容)。
B、磷标准液：将母液按一定比例，分别稀释成0.2mM，0.4mM，0.8mM，1.6mM，3.2mM的工作液。
实施例1、分离鉴定枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XF-8，CCTCC NO：M2010182
实验材料来自山东省济宁市田间土壤。
具体实施步骤如下：在无菌操作下，称取1.0g土样溶于9ml无菌生理盐水中，充分振荡后，置于85℃水浴锅中15min，并梯度稀释后，涂布于已制好的筛选平板上。倒放于28～30℃恒温箱中培养2～3天，用接种针挑起有透明圈的菌落，进一步分离、纯化。再将菌株接于产酶培养基中，进行复筛，以确定产植酸酶的菌株。经过革兰氏染色、16S rDNA基因序列分析及BIOLOG鉴定确定该菌株为枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XF-8，经保藏编号为：CCTCC NO：M 2010182。
实施例2、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XF-8，CCTCC NO：M 2010182的产酶培养实验1
采用产酶培养基，具体步骤如下：菌种接至LB培养基，30℃振荡培养过夜，以1.0％接种量接种于产酶培养基中，25℃，pH 5.5，160rpm振荡培养2天。4℃，5000rpm，离心15min，取上清，得到中性植酸酶粗酶；稀释10倍后，测定发酵液的酶活。
磷标准曲线的绘制
采用溶液4、5制作磷标准曲线。具体步骤如下：用不同浓度的磷标准溶液250μl加入1ml底物溶液，37℃水浴30min后，加入1.25ml终止液；对照组为250μl双蒸水中加入1.25ml终止液，37℃水浴30min后，加入1ml底物溶液，实验组和对照组均加入2.5ml显色液，生成磷钼酸盐在700nm下测定OD值。得到的磷标准曲线如说明书附图1所示。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XF-8，CCTCC NO：M 2010182产生的中性植酸酶酶活测定
酶活定义为：在pH 7.0时，每分钟释放1μM磷所需的酶的量。
将样品用缓冲液做适当稀释后，取250μl酶液加入1ml底物溶液，37℃水浴30min后，加入1.25ml终止液，终止酶反应；对照组250μl酶液加入1.25ml终止液终止酶反应，37℃水浴30min后，加入1ml底物溶液，实验组和对照组均加入2.5ml显色液，生成磷钼酸盐在700nm下测定OD值。根据标准曲线所得方程及酶活定义代入酶活计算公式：
酶活性(U/ml)＝(1.8149x-0.0166)×4×n/t
x：OD700的值；
4：250μl稀释酶液中的酶活换算成1ml酶液的酶活；
n：酶液稀释倍数；
t：反应时间
计算枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XF-8的中性植酸酶酶活为0.32U/ml。实施例3、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XF-8，CCTCC NO：M 2010182的产酶培养实验2
采用产酶培养基，具体步骤如下：菌种接至LB培养基，30℃振荡培养过夜，以2.5％接种量接种于产酶培养基中，30℃，pH 6.5，160rpm振荡培养3天，4℃，5000rpm，离心15min，取上清，得到中性植酸酶粗酶；稀释10倍后，测定发酵液的酶活。
磷标准曲线的绘制和中性植酸酶酶活测定方法同实施例2。
根据标准曲线所得方程及酶活定义计算枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XF-8的中性植酸酶酶活为0.51U/ml。
实施例4、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XF-8，CCTCC NO：M 2010182的产酶培养实验3
采用产酶培养基，具体步骤如下：菌种接至LB培养基，30℃振荡培养过夜，以5.0％接种量接种于产酶培养基中，37℃，pH 7.5，160rpm振荡培养4天。4℃，5000rpm，离心15min，取上清，得到中性植酸酶粗酶；稀释10倍后，测定发酵液的酶活。
磷标准曲线的绘制和中性植酸酶酶活测定方法同实施例2。
根据标准曲线所得方程及酶活定义计算枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XF-8的中性植酸酶酶活为0.40U/ml。

Claims (2)

1.一株具有解磷作用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XF-8，CCTCC NO：M2010182。
2.利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XF-8，CCTCC NO：M2010182产生中性植酸酶的方法，其特征在于包括如下步骤：菌种接至LB培养基，30℃振荡培养过夜，以1～5％接种量接种于产酶培养基中，pH 5.5～7.5，25～37℃振荡培养2～4天；4℃，5000rpm，离心15min，取上清，得到中性植酸酶粗酶；稀释10倍后，测定发酵液的酶活；其中产酶培养基的碳源为麦麸，氮源为酪蛋白胨和(NH4)2SO4。
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