CN109576177A - 一种中华微杆菌株sm8及其在耐盐促生中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种中华微杆菌新菌种SM8 CGMCC No.15757菌株，具有在低温、高温条件下均生长的特点，耐高盐和高pH，能将土壤中不溶性磷转换为可被植物直接吸收、利用的有效磷，并具有能够合成吲哚乙酸、产ACC脱氨酶，起到促植物生长的作用。相关菌剂的使用能明显提高棉花在盐胁迫下的发芽率和生长速率，具有明显耐盐促生作用。不仅可以减少化学肥料的用量，还可以节省农民开支，增加经济收入，还具有良好的生态效益和社会效益。

Description

一种中华微杆菌株SM8及其在耐盐促生中的应用

技术领域：

本发明涉及一株具有耐盐促生作用的中华微杆菌SM8及其在提高农作物盐胁迫耐受性并促进作物苗期生长方面的应用，属于微生物菌种及其应用技术领域。

背景技术：

盐碱土是不同程度盐化、碱化土壤的总称。其中，表土层含可溶性盐含量超过0.6～2％的土壤称之为盐土；土壤胶体中交换性钠离子比较多(碱化度达15％或20％)呈碱性反应(pH8.5-11.0)的土壤称之为碱土。根据联合国教科文组织和粮农组织不完全统计，全世界盐碱地的面积为9.5亿公顷。其中，我国占全球的10％以上，盐碱地面积达到0.99亿公顷，大部分与土壤中碳酸盐的累积有关，因而碱化度普遍较高。

新疆地处欧亚大陆腹地，由于其特殊的地理、气候、土壤质地和地下水条件的影响，盐碱土地分布广，盐碱化种类多样，被称为世界盐碱土的博物馆。据不完全统计，新疆盐碱土面积为0.22亿公顷，占全国盐碱土总面积的22％左右。同时，由于长期耕作管理不当以及当前膜下滴灌模式的采用，土壤盐渍化和次生盐渍化严重，在0.1亿公顷宜农荒地中，受盐碱限制的面积占总面积的近50％。土壤盐渍化和次生盐渍化通过改变土壤环境影响了农作物的发芽、生长，造成作物缺苗、断垄、减长，严重制约了我区的农业高效可持续发展。

同时，由于新疆盐碱面积大、土壤贫瘠以及缺水的现状，加上固定的种植模式，导致目前国内针对土壤盐碱化防治技术如水利改良技术、物理改良技术、化学改良技术等需要大规模投资、大量用水的技术在我区难以开展。而采用耐盐碱植物品种以及采用生物制剂以提高植物耐盐碱特性，从而克服盐碱对植物胁迫作用的生物改良技术，是新疆可大力开发和利用的技术之一。

近年来研究表明，微生物菌肥能对盐碱土壤改良可起到有效作用。微生物菌肥可以增加土壤养分、生物含量及土壤酶活性，进而提高土壤肥力。同时，有机质的提高，可以形成良好的土质环境，利于土壤团粒构型提高，从而改善其空隙情况，有利于增强土壤水肥的保持能力和透气能力，可阻断土壤深处盐分向耕层的积累。其次，微生物菌肥中微生物可有效分解土壤中的有机质而产生有机酸、腐殖质等，可降低土壤pH值，活化土壤离子交换吸附能力，产生强大的金属离子吸附力，从而固定土壤碱性盐成分，进而降低土壤中的盐碱程度。另外，微生物菌肥中的微生物可以定植于植物根际周围，为植物生长提供营养成分和抗逆因子，从而有利于提升植物的抗逆能力。相关研究表明，部分具有溶磷、溶钾功能的微生物可以将土壤中磷、钾释放出来，以利于植物吸收利用；部分固氮菌可以利用空气中的氮气产生利于植物利用的氨根离子，提升土壤肥力；部分菌可以产生细胞分裂素、植物激素从而促进植物的生长。而另有一些抗逆菌株可以产生甜菜碱、甘露醇等小分子化合物，直接提高植物对盐碱的胁迫作用，从而提升植物的抗逆能力。

尽管目前国内外已发现大量植物促生菌，但由于新疆地区环境干旱，盐碱多样，存在相关微生物适应性差、效果不佳的问题。因此，筛选并开发适宜于新疆特殊地理气候条件并对植物有良好缓解盐胁迫、促进作物生长的微生物菌剂，对于解决目前土壤盐渍化具有重要的实用价值。同时，利用微生物资源来改善盐渍化土壤问题，具有投入小、效果好、周期短、环境兼容性好等优点，具有广阔的产业化前景。

发明内容：

本发明的目的是通过分离筛选获得一株中华微杆菌属(Sinomicrobium)新菌种，该菌种具有解磷、分泌吲哚乙酸、产ACC脱氨酶等能力，利用液体发酵技术制备的微生物菌肥，能明显提高植物的耐盐特性，并可促进作物生长。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明的技术方案：通过从新疆和硕地区盐生植物根际分离筛选获得一株中华微杆菌新菌种SM8，利用液体发酵技术制备了耐盐促生微生物菌肥，获得良好的效果。本发明综合解决了微生物菌肥在盐碱地的适应性及解磷、促生的效果，同时制作简单，方便实用。

具体的，本发明提供了一株分离自新疆和硕地区盐生植物根际的中华微杆菌新菌种SM8 CGMCC No.15757。该菌株具有耐盐、耐低温、耐高温，促生、解磷和分泌吲哚乙酸和产ACC脱氨酶等能力，可应用于提高植物盐碱抗性和促进生长，具有被开发为生物肥料的良好应用前景。

本发明所提供的中华微杆菌新菌种SM8 CGMCC No.15757，从新疆和硕县盐碱荒漠地区植物根际分离、筛选、驯化获得，菌种编号为SM8，经微生物分类学检测鉴定，确定为细菌中华微杆菌(Sinomicrobium)属的潜在新种。目前，该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏日期为2018年05月14日，保藏号为CGMCC No.15757。

本发明具体提供的耐盐促生菌中华微杆菌新菌种SM8CGMCC No.15757为革兰氏阴性杆菌、不产芽孢，好氧，具有运动性；在含2％NaCl的TSA培养基(胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠20g，琼脂15g，蒸馏水1000毫升，pH7.3±0.2)，30℃下培养2-4天后，菌落圆形、边缘整齐、略微凸起，呈灰白色，不透明。菌株可在5-45℃，0-10％NaCl，pH 4-10条件下生长。

以中华微杆菌新菌种SM8 CGMCC No.15757菌株的基因组总DNA为模板扩增其16SrDNA序列，进行测序，获取长度为1442bp的16S r DNA序列，序列参见附后提供的SEQ IDNO:1所示，其与GenBank数据库收录的相关菌株进行同源性比对分析，确定该菌隶属Sinomicrobium菌属，与该属标准模式菌Sinomicrobium pectinilyticum 5DNS001^T同源性仅为94.9％，利用本领域常见采用的MEGA 5.0软件通过Neighbor-Joining方法建立系统进化树，结果经比对分析发现，菌株SM8与Sinomicrobium ectinilyticum 5DNS001^T(JN609388)菌株来源于同一分支的可信度为100％，与Sinomicrobium oceani SCSIO03483^T(JQ352762)菌株来源于同一分支的可信度为98％，标明该菌种作为新菌种的支持率极高，在进化树中体现极好的稳定性，经过系列菌种鉴定可知该菌株SM8确定其为中华微杆菌新菌种，具有新菌种典型性的特点。

目前尚未对该菌株进行正式的微生物分类学命名，暂定菌株名称为SM8。

本发明所述的中华微杆菌新菌种SM8 CGMCC No.15757菌株特点在于能够在低温或高温、盐碱条件下良好生长，能明显缓解盐对以棉花为主的经济作物造成的盐碱胁迫，特别是能通过生长代谢分泌植物生长素以促进棉花在盐胁迫下的生长，并具有溶磷、溶钾作用，可提高作物对磷、钾元素的吸收。

本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的中华微杆菌新菌种SM8 CGMCC No.15757菌株，具有低温、高温生长的特点，耐高盐和高pH，能将土壤中不溶性磷转换为可被植物直接吸收、利用的有效磷，因而可促进作物生长。并具有能够合成吲哚乙酸、产ACC脱氨酶，起到促植物生长的作用。

本发明提供的中华微杆菌新菌种SM8 CGMCC No.15757菌株，经菌液稀释液浸泡后的棉种发芽率显著提高了35％。生长15天后，中华微杆菌SM8浸泡对棉种的促进作用明显，与对照组相比，使用了菌剂的处理组株高和根长分别显著增加了3.87％和64.46％，单株平均干重增加了31.34％，证明使用菌剂中华微杆菌SM8能明显提高棉花在盐胁迫下的发芽率和生长速率，具有明显耐盐促生作用。不仅可以减少化学肥料的用量，还可以节省农民开支，增加经济收入，还具有良好的生态效益和社会效益。

附图说明：

图1所示为中华微杆菌SM8 CGMCC No.15757的菌落形态。

图2所示为中华微杆菌SM8 CGMCC No.15757系统发育树。

图3所示为中华微杆菌SM8 CGMCC No.15757在发酵培养基中的生长曲线

图4所示为中华微杆菌SM8 CGMCC No.15757对棉花发芽率的影响。

图5所示为中华微杆菌SM8 CGMCC No.15757对棉花幼苗的促生作用。

图6所示为中华微杆菌SM8 CGMCC No.15757对棉花幼苗干重的影响。

具体实施方式：

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

2％NaCl TSA培养基：胰酪蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，NaCl 20g，琼脂15g，H₂O1000ml，pH 7.3。

发酵培养基组分(g/L)：葡萄糖3.0，蛋白胨5.0，酵母浸粉2.0，K₂HPO₄3.0，NaCl20.0，pH 7.0-7.2。

解磷细菌培养基(g/L)：葡萄糖10.0，酵母粉0.5，(NH₄)₂SO₄0.5，NaCl 20，MgSO₄·7H₂O 0.3，MnSO₄0.03，K₂SO₄0.3，FeSO₄·7H₂O 0.03，Ca₃(PO₄)₂5.0，(卵磷脂0.5)，琼脂15.0，H₂O 1000mL，pH值7.0-7.5。

DF培养基(g/L)：KH₂PO₄4.0，Na₂HPO₄6.0，MgSO₄·7H₂O 0.2，葡萄糖2，葡萄糖酸钠2，柠檬酸2，(NH₄)₂SO₄2.0，FeSO₄·7H₂O 0.001，组分一、二微量元素溶液各0.1mL，样品逐个加入，充分溶解，121℃高压灭菌20min。微量元素溶液：组分一：H₃BO₃10mg、MnSO₄·H₂O11.19mg、ZnSO₄·7H₂O 124.6mg、CuSO₄·5H₂O 78.22mg、MoO₃10mg、H₂O 100mL，溶于100mL无菌蒸馏水中。组分二：将100mg FeSO₄·7H₂O溶于100mL无菌蒸馏水中。

实施例一 中华微杆菌SM8 CGMCC No.15757菌株的分离筛选、纯化和保藏

采集新疆和硕地区盐生植物根际土壤样品，通过梯度稀释法进行微生物的分离和纯化。称取土样10g，放入100ml无菌水中(加入玻璃珠)，200rpm，30℃，震荡20min，使样品充分分散。采用梯度稀释后，用无菌水稀释制备10^-2-10^-5的样品悬浊稀释液。取100μL的各浓度稀释液，采用常规涂布法在含2％NaCl的TSA固体培养基平板上涂布，放置于30℃恒温培养箱内培养。48小时后，待平板上长出菌落后，挑取平板上的单菌落进行纯化培养。对纯化后的单菌落(图1)，转接到含2％NaCl TSA培养基斜面上保存备用。

实施例二 中华微杆菌SM8 CGMCC No.15757菌株的鉴定

中华微杆菌新菌种CGMCC No.15757 16S rDNA的序列测定与分析：

(1)PCR模板DNA的提取：

将纯化后的菌种IS7接种到2％NaCl TSA培养基中，30℃摇床培养2天，收集菌体，采用DNA抽提试剂盒提取基因组总DNA。

(2)PCR扩增

采用特异性引物:

27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，

1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；

PCR反应体系总体积25μL，PCR扩增条件为，94℃5min；94℃45s，56℃45s，72℃45s，30个循环；72℃10min。

(3)序列测定

PCR扩增产物经电泳检测和纯化后测序，获取长度为1442bp的16S r DNA序列，序列参见附后提供的SEQ ID NO:1所示，所得序列经常见的NCBI网站进行比对分析。经比对分析发现，该菌隶属于Sinomicrobium菌属，与该属标准模式菌株Sinomicrobiumpectinilyticum 5DNS001^T同源性94.9％，利用本领域常见采用的MEGA 5.0软件通过Neighbor-Joining方法建立系统进化树，结果经比对分析发现，菌株SM8与Sinomicrobiumectinilyticum 5DNS001^T(JN609388)菌株来源于同一分支的可信度为100％，表明来源于同一分支的可信度为100％，标明该菌种作为新菌种的支持率最高，在进化树中体现极好的稳定性，与Sinomicrobium oceani SCSIO 03483^T(JQ352762)菌株来源于同一分支的可信度为98％，标明该菌种作为新菌种的支持率极高，在进化树中体现极好的稳定性，经过系列菌种鉴定可知该菌株SM8确定其为中华微杆菌新菌种，具有新菌种典型性的特点。目前尚未对该菌株进行正式的微生物分类学命名，暂定菌株名称为SM8，该菌的系统发育树见图1。

该菌为革兰氏阴性杆菌、不产芽孢，好氧，具有运动性；在2％NaCl TSA培养基(胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠20g，琼脂15g，蒸馏水1000毫升，pH7.3±0.2)，在30℃下培养2-4天后，菌落圆形、边缘整齐、略微凸起，呈灰白色，不透明，参见附图2。菌株可在5-45℃，0-10％NaCl，pH 4-10条件下生长。菌株氧化酶、明胶、淀粉和果胶水解阳性，过氧化氢酶、硝酸盐还原、D-葡萄糖发酵和脲酶活性为阴性。使用Biolog菌种鉴定仪GN测试板鉴定确定其能利用a-环糊精、糊精、糖原、吐温20、吐温40、吐温80、N acetyl-D-半乳糖胺、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、松果醇、L-阿拉伯糖、纤维二糖、D-果糖、L-岩藻糖、D-半乳糖、龙胆二糖、a-D-葡萄糖、乳糖、麦芽糖e、甘露糖、蜜二糖、甲基b-D-葡萄糖苷棉子糖、D-山梨醇、蔗糖、海藻糖、乙酸、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖醛酸、a-羟基丁酸、c-羟基丁酸、a-酮丁酸、a-酮戊二酸酸，α-酮戊二酸，DL-乳酸，丙酸，琥珀酸，L-丙氨酸，L-丙氨酸，L-丙酰甘氨酸，L-天冬酰胺，L-谷氨酸，L-亮氨酸，L-鸟氨酸，L-脯氨酸，L-脯氨酸，L-s酪氨酸、L-苏氨酸、肌苷、尿苷、2,3-丁二醇、甘油、DL-a-甘油磷酸酯、琥珀酸、L-苯丙氨酸、DL-肉碱、葡萄糖1-磷酸酯等唯一碳源。其生理生化检测表明，其与该属同源性最近的标准模式菌Sinomicrobium pectinilyticum 5DNS001^T存在多项不同，是该属的潜在新种，相关多相系统鉴定有待进一步开展，暂定菌株名称为SM8。

目前，该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏日期为2018年5月14日，保藏号为CGMCC No.15757

实施例三 中华微杆菌SM8 CGMCC No.15757菌株的耐盐、促生能力检测

在TSA培养基中加入10％NaCl后，倒平板，接种中华微杆菌SM8 CGMCC No.15757。在30℃培养，2-5d观察该菌的生长情况。

将中华微杆菌SM8 CGMCC No.15757接种于解磷(无机磷和有机磷)细菌培养基上，30℃，培养一周后观察透明圈的大小。

将中华微杆菌SM8 CGMCC No.15757接种于含L-色氨酸(100mg/L)的2％NaCl的TSA液体培养基中，摇床培养(30℃，180r/min)1d后，取50μL菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加入等体积的Salkowski比色液(50mL 35％HClO₄+1mL 0.5mol/L FeCl₃)，并以加入50μL未接菌的2％的TSA液体培养基与等体积比色液的混合溶液为对照。将白色陶瓷板于室温避光放置30min后观察颜色变红的情况。

将中华微杆菌SM8 CGMCC No.15757接种于含3mM ACC的DF固体培养基，传代3次后，观察其在ACC为唯一氮源培养基上的生长情况，菌株生长视为产脱氨酶阳性菌株。

研究表明(表1)：中华微杆菌SM8 CGMCC No.15757具有耐盐、解磷、产IAA和ACC促生作用。

表1中华微杆菌SM8的功能特性

实施例四 中华微杆菌SM8 CGMCC No.15757菌剂制备

将中华微杆菌SM8 CGMCC No.15757接种在含2％NaCl的TSA固体培养基上进行活化后，转接于含2％NaCl的TSA液体培养基中(500mL三角瓶装100mL)，30℃下180rpm培养18h，获得种子液。将种子液按1:100比例接种于发酵培养基中，30℃，200rpm培养48h，菌剂最高浓度可达5×10⁹，即得微生物菌剂。在实际使用中可根据需要，将发酵菌剂稀释一定倍数后使用。图3为该菌在发酵培养基中的生长曲线。

实施例五 中华微杆菌SM8 CGMCC No.15757对棉花幼苗的促生作用

选择颗粒饱满且无明显破损的棉种，使用0.1％的升汞消毒5min，无菌水洗净后，用1/100浓度菌液浸泡种子4h；不接菌的对照处理种子浸于灭菌蒸馏水中。

采用4×5穴的穴栽盆，以水洗黄沙烘干后为穴栽土壤。土壤用适量5％NaCl溶液浸润后，添加过夜放置自来水并混匀，最终使土壤含水量达到50％，含盐量达到0.75％。实验设计各处理10穴，将各处理棉种点植入穴栽盆中，每穴4粒，深度约1.5cm，并用塑料薄膜覆盖，置于人工气候室中培养。培养条件20℃、无光照8h；22℃、30％光照2h；25℃、100％光照12h；30％光照2h。至种子发芽后，揭去薄膜，每隔5天浇灌一次(每穴约10mL)。待发芽15d后测量试验组和对照组棉花植株的各种形态学参数，包括发芽率、株高、根长和干重。

实验结果表明，与对照处理相比，经菌剂稀释液浸泡后的棉种发芽率显著提高了35％(图4)。生长15天后，中华微杆菌SM8浸泡对棉种的促进作用明显，与对照组相比，使用了菌剂的处理组株高和根长分别显著增加了3.87％和64.46％(图5)，单株平均干重增加了31.34％(图6)，证明使用了菌剂中华微杆菌SM8能明显提高棉花在盐胁迫下的发芽率和生长速率，具有明显耐盐促生作用。

如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

序列表

<110> 新疆农业科学院土壤肥料与农业节水研究所（新疆维吾尔自治区新型肥料研究中心）

新疆农业科学院微生物应用研究所（中国新疆-亚美尼亚生物工程研究开发中心）

<120> 一种中华微杆菌株SM8及其在耐盐促生中的应用

<141> 2018-12-12

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1442

<212> DNA

<213> 中华微杆菌(Sinomicrobium sp.SM8)

<400> 1

gcggggggga ttcctctcgg cagtcgaggg gtataaggag cttgctcctt agagaccggc 60

gcacgggtgc gtagcgcgta tgcaatctac cttatgcggg ggaatagccc gaagaaattt 120

ggattaatgc cccatggtat atagaatggg catctgtttt atattaaagc tgaggcggca 180

taagatgagc atgcgtccca ttagctagtt ggtatggtaa cggcatacca aggcaacgat 240

gggtaggggt cctgagaggg agatccccca cactggtact gagacacgga ccagactcct 300

acgggaggca gcagtgagga atattggaca atggtcggga gactgatcca gccatgccgc 360

gtgcaggaag actgccctat gggttgtaaa ctgcttttct acgagaagaa taagaggtac 420

gtgtaccttg atgacggtat cgtaggaata agcaccggct aactccgtgc cagcagccgc 480

ggtaatacgg agggtgcaag cgttatccgg aatcattggg tttaaagggt ccgtaggcgg 540

gctgttaagt caggggtgaa agtttgccgc ttaacggtaa aattgccttt gatactggcg 600

gtcttgaatg tgtgtgaagt gattagaata tgtagtgtag cggtgaaatg catagatatt 660

acatagaata ccgattgcga aggcaggtca ctaacacatt attgacgctg atggacgaaa 720

gcgtgggtag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atggatacta 780

gctgttgggg tgcaaacctc agtggctaag cgaaagtgat aagtatccca cctggggagt 840

acgttcgcaa gaatgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg 900

tggtttaatt cgatgatacg cgaggaacct taccaaggct taaatgtgga ttgacgtaat 960

tggaaacagt tatttcttcg gacattcaca ggtgctgcat gattgtcgtc agctcgtgcc 1020

gtgagtgtca ggttagtcct tataacgagc gcaacccctg gtggttagtt accagcatgt 1080

aagatgggga ctcctattca gactgcccgt gcaaccgtgg agagtgggga tgacgtcaaa 1140

tcatcacggc ctacgtcttg gcctacaacg tgcacatgat cggtacagga agcagcgact 1200

gggtgagcag ggcccgaatc tttaaaaccg atcacagttc ggatcgcagt ctgcaactcg 1260

actgcgtgaa gctggaatcg ctagtaatcg gatatcagcc atgatccggt gaatacgttc 1320

ccgggccttg tacacaccgc ccgtcaagcc atggaagccg ggggtacctg aagtcggtga 1380

ccgcaaggag ctgcctaggg taagaccggt aactggggct aagtcgtaac aaggtagccg 1440

ta 1442

Claims (4)

1.一种中华微杆菌SM8，其特征在于，所述的中华微杆菌SM8的菌种保藏号为CGMCCNo.15757。

2.如权利要求1所述的中华微杆菌SM8 16S r DNA序列，基因序列如SEQ ID NO:1所示。

3.如权利要求1所述的中华微杆菌SM8在提高棉花盐胁迫耐受性中的应用。

4.如权利要求1所述的中华微杆菌SM8在促进作物苗期生长中的应用。