CN110016445A - 一株具有固氮能力的巨大芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一株具有固氮能力的巨大芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株具有固氮能力的巨大芽孢杆菌及其应用。一株具有固氮能力的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)N3，2019年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.17170。由N3制备的菌剂在促进二月兰生长、养分积累中的应用。由N3制备的菌剂在土壤生物修复中的应用。本发明的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium N3)具有很好的产IAA能力，固氮能力和解磷能力，同时以其制备的菌剂能够显著促进二月兰植株的生长，促进二月兰植株体内养分的增加，以及显著改良土壤，提高土壤生物活性，和速效养分含量。

Description

一株具有固氮能力的巨大芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于植物促生菌技术领域，具体涉及一株具有固氮能力的菌株，及其对二月兰的促生和对土壤的改良应用。
背景技术
二月兰(Orychophragmus violaceus)是十字花科植物，具有观赏和绿化的价值，是北方地区不可多得的早春观花，冬季观绿的地被植物。它还是一种实用性冬绿肥，盛花期含有丰富的氮、磷、钾等矿质元素，可以提高土壤有机碳含量，促进土壤微生物的活动，有利于保持土壤肥力，还能提高主作物的产量和品质。绿肥生物量是发挥其地面覆盖、土壤残留氮素截获、土壤固碳和养分循环等农田生态服务功能的重要基础。研究表明施用氮肥可以显著提高二月兰的鲜草产量、养分累积量和籽粒产量。但现在大部分氮的施入是通过施加化肥，对土壤、作物和环境都会带来一系列的危害。有研究表明通过接种植物促生菌可以提高植株生物量和养分含量并对土壤有一定的改良作用。
土壤供氮是绿肥作物生长的重要限制因子，对于非豆科绿肥作物而言，其生长所需氮素主要来源于土壤残留无机氮和绿肥生长季土壤矿化氮。固氮微生物通过生命活动，将空气中游离态的氮素直接转变为含氮化合物，固定的氮素除供自身生长发育外，部分以无机状态或简单的有机氮化物分泌于体外，供植物吸收利用。因此从植物根际土壤中分离筛选高效固氮类的植物促生菌接种绿肥既能解决鲜草高产问题，又能避免施加化肥带来一系列的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一株具有固氮、产IAA和溶磷促生作用的巨大芽孢杆菌。
本发明的另一目的是提供该巨大芽孢杆菌的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一株具有固氮能力的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)N3，2019年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.17170。
本发明所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)N3制备的菌剂。
本发明所述的菌剂在促进二月兰生长中的应用。
本发明所述的菌剂在促进二月兰养分积累中的应用。
本发明所述的菌剂在土壤生物修复中的应用。
本发明所述的菌剂在改良土壤，提高土壤生物活性，和速效养分含量中的应用。
有益效果：
本发明的一种巨大芽孢杆菌具有固氮、产IAA和溶磷促生性质，其固氮酶活性达C2H4 28.33nmol/(h.ml)；在180rpm、30℃培养24h，IAA产生量达7.47mg/l；在180rpm、30℃培养4d，对磷酸三钙的转化量达25.89mg/l。以其制备的菌剂能够显著促进二月兰植株的生长和根系发育，促进二月兰植株体内养分的增加，以及显著改良土壤，提高土壤生物活性，和速效养分含量。
附图说明
图1是本发明菌株N3的菌落图；
图2菌株N3对二月兰促生盆栽图片。左边为不接菌处理，右边为接种N3菌株处理。
图3接种菌株N3对土壤微生物量碳、氮的影响
生物样品保藏信息
N3，分类学名为巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年1月14日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCC No.17170。
具体实施方式
实施例1：固氮菌的筛选、鉴定
1.1筛选及纯化
筛选固氮菌的培养基为阿须贝无氮固体培养基(Ashby)，葡萄糖10g，磷酸二氢钾0.2g，七水合硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，碳酸钙5g，二水合硫酸钙0.1g，琼脂18g，pH 6.8-7.0，补水至1000ml。121℃灭菌20min。
称取10g(采自山东泰安植物根际)土样，将其置于装有适量玻璃珠和90ml无菌水的250ml 三角瓶中，30℃、180r·min-1振荡20min，静置10min，得到土壤悬浮液。采用梯度稀释法稀释至10-6后，吸取0.1ml涂布在Ashby固体培养基上，平板置于30℃恒温箱中倒置培养24h 后，将不同类型典型单个菌落挑出，经平板多次纯化后，4℃保存在Ashby固体培养基斜面待用。
1.2形态观察及鉴定
筛选出的固氮菌株，如图1所示，该菌株形成的菌落较小为白色、隆起，边缘整齐，表面光滑湿润，不透明，不规则杆状排列，株型命名为N3。
1.3研究结果
将上述方法筛选分离出的菌株，经南京思普金生物科技有限公司测序，根据16SrDNA的测序结果，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov在线查询分析，利用Blast软件在GenBank中与其它的16S rDNA序列进行同源性比较，选择相近的序列与N3的序列用MEGAversion 5.1 软件构建N3的16SrDNA系统进化树。根据该菌株的生理生化特征，鉴定为巨大芽孢杆菌 (Bacillus megaterium N3)，同源性为99％。将该菌株于2019年1月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.17170。
实施例2：N3菌株促生性质测定
2.1固氮酶活性测定
将分离纯化后的菌株接入LB液体培养基中，培养24h后用离心法收集菌细胞，再用无氮液体培养重悬菌体，制成108CFU/ml的固氮菌悬液，作为待接种菌液。
接种制好的待接种菌液于装有2ml无氮液体培养基的青霉素小瓶中，30℃培养24h；用密封性好的注射器先从培养有菌的青霉素小瓶抽取1mL空气，再注入1ml乙炔，用胶布密封针眼；继续培养24h，取100ul气样在气相色谱仪上测定乙烯峰值。
2.2产IAA能力测定
将分离纯化后的细菌，接种于含有L-色氨酸(100mg/l)的LB液体培养基中，180r·min-1、 30℃条件下摇床培养1d。吸取2ml菌液于离心管中，10000r/min,离心10min，取1.5ml上清液并加入等体积Salkowski比色液于5ml离心管中，避光静置30min，测定其OD530值。对照标准曲线计算单位体积发酵液中IAA的含量。标准曲线的绘制采用分析纯的IAA梯度稀释制备。
2.3溶磷能力测定
无机磷细菌培养基(PKO)：磷酸三钙5g，葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，七水合硫酸镁0.3g，氯化钾0.3g，硫酸锰0.03g，七水合硫酸亚铁0.03g，pH 7.0-7.2，蒸馏水1000ml。121℃灭菌20min。
将分离纯化后的细菌接种于装有50mlPKO液体培养基的250ml三角瓶中，不接菌为空白对照，180r·min-1、30℃培养4d后，将培养液装入离心管4℃下10000r·min-1离心10min。取上清液用钼蓝比色法测定有效磷含量。
2.4研究结果
通测定，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium N3)固氮酶活性达C2H4 28.33nmol/(h.ml)；具有一定的产IAA能力，在180rpm、30℃培养24h，IAA产生量达15.76mg/l；具有一定的溶磷能力，在180rpm、30℃培养4d，对磷酸三钙的转化量达25.89mg/l。
实施例3：菌株在绿肥作物二月兰促生上的应用
3.1菌剂制备
将分离纯化后的固氮菌接种于LB液体培养基，30℃、180rpm摇床培养24h后，无菌条件下把菌液倒入已灭菌的离心管中，8000rpm离心5min，去掉上清液，再用无菌水重悬菌体，制成浓度大致为108CFU/ml的菌悬液，待用。
3.2菌剂接种二月兰
设置两个处理进行二月兰盆栽实验，对照处理(CK)接种等量无菌水，和N3菌剂接种处理(N3)。二月兰种子用95％酒精浸5min，再用3％的NaClO进行表面消毒2min，后无菌水反复冲洗。菌液接种量按108CFU/g土接入，每盆装土3kg，二月兰种植10株，生长100d后，进行采样分析。
3.3研究结果
3.3.1接种菌株N3对二月兰根系形态的影响
结果表明，接入本发明的巨大芽孢杆菌N3(Bacillus megaterium N3)，二月兰根系的发育受到促进，根长、根表面积、根体积、根尖数都有显著性增加(如表1所示)与不接菌处理相比，接种N3菌分别增加了1.27、1.28、1.48、1.11倍。
表1接种菌株N3对二月兰根系的影响
3.3.2接种菌株N3对二月兰生物量及养分积累的影响
N3菌株能够显著提高二月兰地上和地下部生物量、株高、茎粗(表2),二月兰地上、地下部鲜重、株高、茎粗都有显著性增加，较不接菌处理分别提高了227.66％、129.55％、56.12％、 90.15％；
表2接种菌株N3对二月兰植株的影响
同时接种菌株N3可显著提高二月兰植株地上、地下部氮、磷、钾的含量(表3)。
表3接种菌株N3对二月兰植株养分的影响
3.3.3接种菌株N3对土壤性质的影响
相比不接菌处理，接种固氮菌株N3，土壤全氮、速效磷和速效钾含量显著性增加(表4)。土壤微生物量碳、氮显著提高。
表4接种菌株N3对土壤养分含量的影响
综上所述，本发明的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium N3)具有很好的固氮能力以及一定的产IAA能力和解磷能力，同时以其制备的菌剂能够显著促进二月兰植株的生长和根系发育，促进二月兰植株体内养分的增加，以及显著改良土壤，提高土壤生物活性，和速效养分含量。

Claims (6)

1.一株具有固氮能力的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)N3，2019年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.17170。
2.权利要求1所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)N3制备的菌剂。
3.权利要求2所述的菌剂在促进二月兰生长中的应用。
4.权利要求2所述的菌剂在促进二月兰养分积累中的应用。
5.权利要求2所述的菌剂在土壤生物修复中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，权利要求2所述的菌剂在改良土壤，提高土壤生物活性，和速效养分含量中的应用。
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