CN102898197A

CN102898197A - 以藻泥作为添加剂生产促生生物有机肥的工艺及产品

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Publication number: CN102898197A
Application number: CN2012104363880A
Authority: CN
Inventors: 沈其荣; 李�荣; 张苗; 曹亮亮; 施娟娟; 黄炎; 刘红军; 杨兴明
Original assignee: JIANGSU XINTIANDI BIO-FERTILIZER ENGINEERING CENTER CO LTD; Nanjing Agricultural University
Current assignee: JIANGSU XINTIANDI BIO-FERTILIZER ENGINEERING CENTER CO LTD; Nanjing Agricultural University
Priority date: 2012-11-01
Filing date: 2012-11-01
Publication date: 2013-01-30

Abstract

本发明提供了一种以藻泥作为添加剂生产的低成本促生生物有机肥及其生产工艺，属于农业集约化生产技术。所用配方为腐熟牛粪普通肥(95％，重量比，下同)和藻泥(5％干重)；所用菌株为促生解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciensSQR-9；工艺流程为将原料以上述最优配方混合，5％接入促生菌，条垛式发酵，每天翻抛1次，发酵6-7天。所生产的肥料有益活菌数大于2×10⁷CFU/g(肥料干重)，全氮含量为1.2-2.0％，总氮磷钾养分≥5％，有机质含量超过45％，微囊藻毒素LR和RR的含量均低于4ug/kg。富含有益氨基酸，生产成本低、促生效果好、可应用于粮食作物、蔬菜等。

Description

以藻泥作为添加剂生产促生生物有机肥的工艺及产品

一、技术领域

本发明提供一种以藻泥作为添加剂生产促生生物有机肥的工艺及产品，属于农业集约化生产技术，该生物有机肥富含大量促进作物生长功能菌，同时含有游离氨基酸，能够显著促进农作物生长。

二、背景技术

近年来，国内外各大湖泊相继出现蓝藻水华暴发的现象，湖泊富营养化问题日益得到人们的关注。每年夏、秋季，我国巢湖、滇池、太湖、东湖等各大湖泊由于水体富营养化严重，频频暴发水华，给城市居民用水带来严重危机。清除蓝藻的方法很多，直接清除水体中蓝藻，并移出水体，即打捞蓝藻法，这是目前非常有效的和学术界没有争议的一种方法。由于捞藻含水量较大，达到98％，占地较多，蓝藻作为一种生物质资源，探索其资源化利用较有意义。通过对蓝藻资源利用的可行性研究，试图寻找出一种有效的蓝藻利用途径，从而为从太湖打捞出来的大量蓝藻寻找出一种有效的处理途径，这将可能实现太湖蓝藻的利用，减少捞藻的二次污染，使其变废为宝，化害为利。打捞藻泥的含水量在86-89％之间，藻泥干物质全N含量为7.5-8.5％，全P含量为0.44％，全K含量为0.5％；有机质含量大于70％。(1、沈银武，刘永定，吴国樵，等.富营养化湖泊滇池水华蓝藻的机械清除[J].水生生物学报，2004，25(2)：131-136.2、蓝藻快速好氧堆肥的研究江南大学硕士论文2009第2页)。但原料蓝藻里面含毒素、蛋白等大分子物质，不经过处理会二次污染环境(氮、磷、藻毒素)，而且养分不能直接被植物所利用(杜静，《太湖水华蓝藻资源化技术研究》【D】，南京农业大学，2008，硕士学位论文；韩志国，武宝王，郑解生，等.淡水水体中的蓝藻毒素研究进展(综述)[J].暨南大学学报：自然科学版，2001，22(3)：129-134；杨海麟，李克朗，张玲，等.蓝藻资源无害化利用技术的研究[J].生物技术，2008，18(6)：95-98)。本专利从打捞藻泥富含的丰富植物蛋白、多糖出发，利用该类资源与普通腐熟牛粪堆肥二次固体发酵根际促生芽孢杆菌，研发出了作物促生生物有机肥。

生物有机肥是指特定功能微生物与主要以动植物残体(如畜禽粪便、农作物秸秆等)为来源并经无害化处理、腐熟的有机物料复合而成的一类兼具微生物肥料和有机肥效应的肥料。其本质特征是含有特定功能的、表现出一定肥料效应的微生物，这些功能微生物的生命活动是生物有机肥优于其它肥料的关键因素。生物有机肥发挥作用的关键在于肥料中有益微生物的数量，因此研究不同的配方和二次固体发酵工艺确保肥料中活菌数达到最高变得尤为重要。目前提高生物有机肥中功能微生物数量，常用的方法是在二次固体发酵过程中加入大量的外源氨基酸。该类氨基酸的种类很多，如菜饼、豆饼等，但此类氨基酸成本很高，尤其是豆饼，因此目前市场上的生物有机肥产品主要集中在蔬菜、果树等附加值较高的经济作物上，粮食作物上鲜有该类高端肥料的应用。探求和开发出新型低成本氨基酸，大幅度降低生物有机肥的成本，从而将生物有机肥应用于粮食作物上去，进一步提高我国粮食作物的产量，变得意义尤为重大。

三、发明内容

技术问题本发明目的在于针对生物有机肥生产成本昂贵的问题，开发出一种利用藻泥为生物有机肥配方中的添加剂，研制低成本生物有机肥的配方和工艺。

技术方案下面为本发明的主要内容：

所用菌株为根际促生芽孢杆菌SQR9，分离自黄瓜根际土壤，该菌株革兰氏染色为阳性，保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.5808，根据形态、生理生化特征及16S rDNA序列分析鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。SQR9菌株在培养温度为30℃，初始pH为7.0～8.0，碳源为葡萄糖或蔗糖，氮源为蛋白胨或酵母膏时可达到最大的生长量。幼龄培养物形态均为杆状、具有运动性，产芽孢、芽孢形状呈椭圆形，孢囊膨大，菌落不规则、干燥、不透明。

以藻泥作为添加剂生产促生生物有机肥的工艺，包括：

1)将保藏号CGMCC NO.5808的根际促生解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)SQR9接种到PDA培养液中，进行液体发酵生产，发酵生产的条件为：pH生长范围自然，培养温度范围30～35℃，搅拌速度为180～300转/分钟，发酵中后期形成芽孢，使发酵液中含菌或芽孢量≥1×10⁹个/ml。所用PDA培养液配制方法为，以配制1L培养基为例：用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值调至7.0-7.6，121℃灭菌20min。

2)将腐熟后的牛粪堆肥和藻泥按干重比9.5∶0.5进行均匀混合；

3)将促生菌接种入藻泥和腐熟后的牛粪堆肥混合物进行固体发酵，每吨固体有机物料中加入促生菌液50L，固体发酵过程中每天翻堆1次，使固体发酵温度不超过50℃，发酵6-7天后结束，促生菌含量可达到2×10⁷CFU/g(肥料干重)以上，最后在温度不超过60℃的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30％以下，包装出厂即为成品促生生物有机肥。所用腐熟后的牛粪堆肥其发芽指数为98％以上，有机质质量比含量≥45％，有机氮质量比含量为2-3％，含水量质量比为25-30％。

用上述配方工艺生产的促生生物有机肥中有益活菌数超过2×10⁷CFU/g(肥料干重)，全氮含量为1.2-2％，总氮磷钾养分≥5％、有机质含量≥45％。该产品中微囊藻毒素LR和RR的含量均低于4ug/kg。

有益效果本发明提供一种利用藻泥作为添加剂和腐熟牛粪发酵根际促生芽孢杆菌研制低成本促生生物有机肥的配方及工艺。

使用该发明生产的促生生物有机肥具有生产成本低，使用方便，促生效果好的优点，适合粮食作物、蔬菜、果树等种植区域大面积使用。本发明对于保护生态环境，保护人民的身体健康，提高农产品的附加值具有重要的意义。

产品与目前市场上的产品相比具有如下优点：

1)本专利太湖打捞藻泥和腐熟牛粪普通肥作为配方，二次固体发酵根际促生Bacillus amyloliquefaciens SQR9，研制出了低成本促生生物有机肥，该配方及工艺能够大幅度降低生物有机肥的成本，生产的产品不仅能够应用于高附加经济作物，同时能够应用与粮食作物，同时通过微生物的作用，蓝藻里的大分子藻蛋白能够被分解成小分子的氨基酸，可供植物直接利用，藻毒素能够被大幅度降低，具有很强的市场竞争力。

2)藻泥中蛋白含量可高达50％以上，氨基酸组份比较齐全，肥料产品中含有丰富的可溶性有机碳氮和种类齐全的游离氨基酸，能给功能菌提供十分优越的生长环境，肥料中高效菌株的含量大于2×10⁷CFU/g(肥料干重)以上，施入土壤后能形成优势群，并在土壤中存活下来，大地提高了促生菌在土壤中的定殖和发挥功能的能力。

3)采用液相色谱法测定生物有机肥中藻毒素LR和RR的含量，结果表明微囊藻毒素LR和RR的含量均低于4ug/kg(肥料干重)，而我们测得原料纯藻泥中微囊藻毒素LR和RR(microcystin-LR和microcystin-RR)的含量分别为3.1mg/kg(藻泥鲜重)和62.16mg/kg(藻泥鲜重)，因此放置两月的藻泥再利用本专利技术固体发酵后能够将藻毒素LR和RR的含量降低到4ug/kg(肥料干重)以下，目前国内外还没有肥料中藻毒素的标准，仅仅有地下水中的标准，低于1ug/kg。

4)同时肥料中丰富的氨基酸资源能够促进作物生长，试验结果表明，在粮食作物和蔬菜苗期上上施用本产品后，能显著促进作物的生长。

四、附图说明

图1不同含量藻泥固体发酵促生菌的数量

图25％藻泥固体发酵促生菌的数量

图3低成本生物有机肥游离氨基酸的含量

图4黄瓜促生图

图5茄子促生图

生物保藏

根际促生芽孢杆菌SQR9，2012年2月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.5808。分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

五、具体实施方式

1、藻泥的提供

由太湖周边打捞站免费提供，放置藻泥储存池2个月。

2、功能菌菌剂的生产

将促生菌SQR9接种到PDA培养液中，进行液体发酵生产，发酵生产的条件为：pH生长范围自然，培养温度范围30～35℃，搅拌速度为180～300转/分钟，发酵中后期形成芽孢，使发酵液中含菌或芽孢量≥1×10⁹个/ml。所用PDA培养液配制方法为，以配制1L培养基为例：用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值调至7.0-7.6，121℃灭菌20min。

3、固体发酵生成生物有机肥

3.1固体发酵配方的获得

首先将藻泥以不同梯度加入腐熟牛粪堆肥中，进行固体发酵，每吨固体有机物料中加入促生菌液50L，固体发酵过程中每天翻堆1次，使固体发酵温度不超过 50℃，发酵6天后结束。发酵完后测定各处理中的功能菌的数量，结果如图，表明加入5％(干重)藻泥的堆肥为藻泥梯度中的最佳处理，功能菌数量达到5×10⁷CFU/g(干重)。再进行残留藻毒素的检测，方法如下：向100g肥料中加入100mL5％的乙酸，在-70和常温下反复冻融多次后，12000r/min离心10min，分别取出上清液(I)和沉淀；将沉淀用100mL80％甲醇溶液震荡提取4h，离心15min，得上清液(II)；将上清液(I)与上清液(II)充分混合后得上清液(III)，将上清液(III)用稀盐酸将pH调至3，静置过夜后离心，弃残渣，得上清液(IV)，将上清液(IV)用稀氨水将pH调至7后，40℃旋转蒸发去除甲醇，将剩余样品过0.45μm滤膜得藻毒素粗提液。依次用20mL100％甲醇、20mL超纯水活化C18固相萃取柱(500mg/6ml)，将藻毒素粗提液通过固相萃取柱进行富集浓缩，再分别用20mL10％以及20ml20％甲醇溶液淋洗固定相，最后用10mL80％甲醇溶液(加入0.05％三氟乙酸)将吸附在固定相上的微囊藻毒素洗脱下来，将纯化后的微囊藻毒素通过旋转蒸发除去甲醇得MCs储备液，将储备液冷冻干燥后，用20％甲醇定容到2ml，液体供HPLC上机检测。

采用液相色谱法测定生物有机肥中藻毒素LR和RR的含量，结果表明微囊藻毒素LR和RR的含量均低于4ug/kg(肥料干重)，而我们测得原料纯藻泥中微囊藻毒素LR和RR(microcystin-LR和microcystin-RR)的含量分别为3.1mg/kg(藻泥鲜重)和62.16mg/kg(藻泥鲜重)，因此放置两月的藻泥再利用本专利技术固体发酵后能够将藻毒素LR和RR的含量降低到4ug/kg以下，目前国内外还没有肥料中藻毒素的标准，仅仅有地下水中的标准，低于1ug/kg。

3.2固体大堆发酵生成成品有机肥

根据上述配方和工艺，将腐熟后的牛粪堆肥和藻泥(干重比，9.5∶0.5)进行均匀混合，将促生菌SQR9接入混合堆，每吨固体有机物料中加入促生菌液50L进行固体发酵，每天翻堆1次，使固体发酵温度不超过50℃，发酵6天后结束；设计牛粪腐熟有机肥作为对照。发酵结束后新型生物有机肥中促生菌数量达到6×10⁷CFU/g(干重)(图2)，超过牛粪腐熟有机肥1个数量级。所用腐熟后的牛粪堆肥其发芽指数为98％以上，有机质质量比含量≥45％，有含水量质量比25-30％。研制成的低成本促生生物有机肥含有6×10⁷CFU/g(干重)以上的促生菌SQR-9、全氮含量为1.2-2.0％(90％以上为有机氮)，总氮磷钾养分≥5％、有机质含量大于45％。以上结果表明所研制配方和工艺完全能够最大化的发酵生产新型生物有机肥，且该生物有机肥完全能够符合国家标准。

3.3生物有机肥中的氨基酸含量和成分

利用茚三酮比色法测定所研制的低成本生物有机肥中游离氨基酸的含量，结果见图3，发酵完成后，添加藻泥发酵而成的低成本生物有机肥(BIO)中游离氨基酸的含量(1.69g/kg)远远超过对照牛粪(OF)的含量(0.32g/kg)。

4、温室促生试验

4.1促生有机肥在黄瓜上的应用效果

共设一个对照一个处理，处理添加本专利研制的低成本生物有机肥(BIO)，对照为普通牛粪有机肥(OF)。每个处理12盆，每盆装10kg土，肥料的添加量为2％。肥料与土充分混合均匀，常规管理。定期测定黄瓜生长指数。结果如图5(BOF1：OF处理；BOF7：BIO处理)、表一、表二、表三、和表四，促生有机肥的施用能够显著增加黄瓜植株的株高、地上部鲜重、地上部鲜重和干重、地下部鲜重和地下部干重。株高在移苗30天后达到显著性差异，茎粗一直未见显著性差异，叶地上部鲜重和干重、地下部鲜重和地下部干重30天后即达到显著性差异。

表一不同有机肥对黄瓜株高的影响单位：cm

表二不同有机肥对黄瓜茎粗的影响单位mm

表三不同有机肥对黄瓜鲜重的影响单位：g

表四不同有机肥对黄瓜干重的影响单位：g

4.1促生有机肥在茄子上的应用效果

共设一个对照一个处理，处理添加本专利研制的低成本生物有机肥(BIO)，对照为普通牛粪有机肥(OF)。每个处理12盆，每盆装10kg土，肥料的添加量为2％。肥料与土充分混合均匀，常规管理。定期测定茄子生长指数。结果如图5(BOF1：OF处理；BOF7：BIO处理)、表五、表六、表七、和表八，促生有机肥的施用能够显著增加茄子植株的株高、茎粗、地上部鲜重、地上部鲜重和干重、地下部鲜重和地下部干重。以上指标在移苗30天后达到显著性差异。

表五不同有机肥对茄子株高的影响单位：cm

表六不同有机肥对茄子茎粗的影响单位：mm

表

七不同有机肥对茄子鲜重的影响单位：g

表

八不同有机肥对茄子干重的影响单位：g

Claims

1.以藻泥作为添加剂生产促生生物有机肥的工艺，包括：

1)将保藏号CGMCC NO.5808的根际促生解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)SQR9接种到PDA培养液中，进行液体发酵生产，发酵生产的条件为：pH生长范围自然，培养温度范围30～35℃，搅拌速度为180～300转/分钟，发酵中后期形成芽孢，使发酵液中含菌或芽孢量≥1×10⁹个/ml；所用PDA培养液配制方法为，以配制1L培养基为例：用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值调至7.0-7.6，121℃灭菌20min；

3)将促生菌接种入藻泥和腐熟后的牛粪堆肥混合物进行固体发酵，每吨固体有机物料中加入促生菌液50L，固体发酵过程中每天翻堆1次，使固体发酵温度不超过50℃，发酵6-7天后结束，促生菌含量可达到2×10⁷CFU/g肥料干重以上，最后在温度不超过60℃的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30％以下，包装出厂即为成品促生有机肥；所用腐熟后的牛粪堆肥其发芽指数为98％以上，有机质质量比含量≥45％，有机氮质量比含量为2-3％，含水量质量比为25-30％。

2.权利要求1所述工艺生产的促生有机肥产品，该产品中微囊藻毒素LR和RR的含量均低于4ug/kg。

3.根据权利要求1所述的促生生物有机肥产品，该产品中促生菌SQR9活菌数＞2×10⁷CFU/g肥料干重，全氮含量为1.2-2％，总氮磷钾养分≥5％、有机质含量≥45％。

4.权利要求2和3所述促生生物有机肥产品的应用。