CN104818233A - 一株含死谷芽孢杆菌及其制备的功能型蔬菜育苗生物基质 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株含死谷芽孢杆菌及其制备的功能型蔬菜育苗生物基质。一种死谷芽孢杆菌N23，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.9920。所述的功能型蔬菜育苗生物基质是于普通育苗基质中添加功能菌株N23所得。本产品针对西瓜，辣椒，番茄，黄瓜等作物培育种苗，选择特定的死谷芽孢杆菌N23，并将其保活添加至基质中得到活性生物基质产品，使用该产品，对西瓜，辣椒，番茄，黄瓜苗期的促生效果好，能够育出根际带有大量活性功能微生物的优质种苗，同时有益微生物能够在种苗根际大量定殖，不仅能够促进所育种苗后期栽培过程中的生长，还能提高该类作物在大田种植中的产量。

Description

一株含死谷芽孢杆菌及其制备的功能型蔬菜育苗生物基质

技术领域

本发明属于农业微生物领域，涉及一株含死谷芽孢杆菌及其制备的功能型蔬菜育苗生物基质。

背景技术

随着我国现代农业的发展，蔬菜工厂化育苗越来越受到人们的重视,穴盘育苗是当前工厂化育苗的主要措施。据不完全统计，我国需要育苗的作物面积非常大，其中水稻种植面积就超过3亿亩/年，经济作物超过5亿亩次/年。目前国内一般以富含有机质的材料(如泥炭、腐熟植物残体等)为主，再配以适当比例的轻质无机材料，如蛭石、膨胀珍珠岩等制成育苗基质。由于材料来源受地区和成本的限制，且泥炭为不可再生资源，限制着基质无土育苗的可持续发展，现已成为草炭匮乏地区蔬菜工厂化育苗发展的瓶颈。国外工厂化育苗发展很快，进口基质保水性明显优于国产泥炭基质，进口基质中有机质和速效磷、钾含量明显高于国产泥炭基质。因此提升国内育苗基质的整体水平变得尤为迫切。将促进作物生长的根际微生物与不同腐熟废弃物料(普通完全或部分替代泥炭物料研制成的基质)相结合，研制成有机活性育苗生物基质，将打破传统育苗基质的配方及工艺，成为提升我国育苗基质整体水平的一个重大突破。目前，国内已有部分专家在尝试此方面工作，主要集中在利用AM菌根接种现有基质进行育苗，虽取得一些成果，但研究均不够系统深入，也没有形成大规模推广并被广大农民认可的产品，因而本专利的研究变得尤为重要。

植物根际促生菌是指定殖于植物根际系统，并能促进植物生长的一类微生物总称。能依靠直接产生信号物质，或者提高植物抗性、加速土壤养素循环等方式促进植物生长、提高防病能力、增加作物的产量。因而成为许多学者研究的热点。

植物根际(rhizosphere)是一个非常特殊的生态环境，是土壤-植物生态系统物质交换的活跃界面，植物进行光合作用，将光合产物运至地下，促进根际微生物的生长和代谢，而根际微生物将有机态养分转化为无机形态，利于植物吸收，同时，很多根际微生物能分泌促进根系生长的促生物质、拮抗土传病原菌的拮抗物质。植物根际形成了根际微生物的生境，特定作物根系分泌物造就了特定的土壤细菌和真菌的群落结构。与动物不同，植物生长位点是固定的，植物与其他生物的互作主要依靠分泌的各种化学信号物质。植物通过根系分泌能被土壤微生物识别的信号分子启动微生物与植物根系的对话，这种对话又反过来使微生物产生一些信号来启动微生物在根部的定殖。自然条件下，特定作物的根系分泌物被某些有益微生物所爱好，如果我们在育苗的时候能够将这些特定的针对不同作物根际的功能微生物，保活添加到基质中，研制成具有不同功能的活性微生物育苗基质，从而进一步育出根际带有大量活性功能微生物的优质种苗，必定能够提高该类作物在大田种植中的产量。

发明内容

本发明目的在于针对目前国内育苗生物基质发展缓慢的难题，提供一种用于制备功能型蔬菜育苗生物基质的死谷芽孢杆菌。

本发明的另一目的是提供含该根际功能细菌的功能型蔬菜育苗生物基质。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种死谷芽孢杆菌N23，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2014年11月3日，保藏号为CGMCC NO.9920。

本发明所述的死谷芽孢杆菌N23在制备功能型蔬菜育苗生物基质中的应用。

本发明所述的死谷芽孢杆菌N23的发酵液在制备功能型蔬菜育苗生物基质中的应用。

一种含死谷芽孢杆菌N23的功能型蔬菜育苗生物基质，普通育苗基质中添加所述的死谷芽孢杆菌N23发酵液，所述的死谷芽孢杆菌N23，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2014年11月3日，保藏号为CGMCC NO.9920。

所述的功能型蔬菜育苗生物基质中所述的死谷芽孢杆菌N23活菌数≥1.0×10⁷CFU/g基质干重，有机质≥20％，总养分(N+P₂O₅+K₂O)1.5％～7％，水分≤55％，pH值5.5～7.5，Ec≤2.5ms/cm。

所述的功能型菌株N23发酵液优选通过以下发酵方法制备：

将保藏号为CGMCC NO.9920的死谷芽孢杆菌N23按基质干重的5％接种到PDA培养液中，进行液体发酵生产，发酵生产的条件为：pH6.0～7.0，发酵温度范围30～35℃，搅拌速度为170～200转/分钟，发酵中后期形成芽孢，发酵时间为43～50h，使发酵液中含菌或芽孢量≥1×10¹⁰个/ml；

其中所用PDA培养基配制方法为，以配制1L培养基为例：200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min后过滤，滤液中加20g普通蔗糖后定容至1000ml，pH值自然，121℃灭菌20min。

所述的蔬菜选自西瓜、黄瓜、辣椒或番茄中的任意一种。

本发明所述的含死谷芽孢杆菌N23的功能型蔬菜育苗生物基质的制备方法，包含以下步骤：

(1)制备保藏号为CGMCC NO.9920的死谷芽孢杆菌N23发酵液；

(2)将步骤(1)制备的发酵液按基质干重的5％加入普通育苗基质混合均匀得功能型蔬菜育苗生物基质，使其中活菌数≥1.0×10⁷CFU/g基质干重。

所得产品中有益活菌数≥1.0×10⁷CFU/g(基质干重)。有机质(基质干重，下同)≥20％，总养分(N+P₂O₅+K₂O)1.5％～7％，水分≤55％，pH值5.5～7.5，Ec≤2.5ms/cm。

有益效果

本发明提供了一种死谷芽孢杆菌N23及由其研制的功能型蔬菜育苗生物基质产品。

由于基质的良好通透性和优质保水性，普通基质与功能菌N23结合(按基质干重的5％接菌，下同)后，能够大幅度促进N23的存活能力，从而确保所育种苗根际带有大量活性功能菌。

使用该产品，对蔬果苗期的促生效果好，能够得到优质的种苗，同时有益微生物能够在种苗根际大量定殖。本产品中包含的活性微生物，具有高效的促生能力，技术优势和功能优势明显。该基质能够显著促进所育种苗后期栽培过程中的生长。

产品与目前市场上的产品相比具有如下优点：

1)产品中功能微生物为具有促生作用的死谷芽孢杆菌，该菌株能够有效的在种苗根际定殖，菌株较强的促生功能，产品中稳定含有1.0×10⁷CFU/g(基质干重)以上的活性功能微生物。

2)本产品所育种苗根际能够有效定殖大量的功能微生物死谷芽孢杆菌N23，能够增强所育种苗后期盆栽及田间种植中的生长。

附图说明

图1 G10在LB平板上的菌落形态

图2基于菌株N23的16S rRNA基因序列采用邻接法建立的系统发育树

图35％功能菌接入量生物基质育辣椒苗的促生效果

其中，A为CK1：未接菌的空白培养基对照，B为N23处理组；C为CK2:为水对照。

生物材料保藏信息

N23，分类命名为死谷芽孢杆菌Bacillus vallismortis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2014年11月3日，保藏号为CGMCC NO.9920。

具体实施方案

实施例1菌株的分离及鉴定

取西瓜根部，切成长约3cm小段，取10g植物根于盛有90ml无菌水的三角瓶内，在30℃，170r/min条件下的摇床中振荡20min，制成土壤悬浮液，80℃水浴20min后，稀释成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5等不同梯度稀释液后涂LB平板，培养箱中黑暗培养1至2天，后挑取单菌落，经平板纯化后，共挑选126株纯菌，分别测定各菌株产植物生长素吲哚乙酸(IAA)(方法参考文献：Glickmann E,Dessaux Y.A critical examination of the specificity of the salkowskireagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria.[J].Applied and environmentalmicrobiology,1995,612)及产ACC脱氨酶的能力(方法参考文献：Glick BR.Modulation of plantethylene levels by the bacterial enzyme ACC deaminase[J].FEMS Microbiology Letter,2005,251:1-7)。并进行多季育苗试验，采用同样的方法，结果初筛和复筛，获得一株对西瓜苗促生能力优异的菌株N23，保存留待进一步研究。

菌株N23在LB平板上的菌落呈乳白色，表面干涩，平滑，边缘不整齐，易挑起。在显微镜下所观察到的营养体细胞，革兰氏染色阳性，菌体着色均匀，呈杆状，两端钝平，多数菌体连接成串，呈不规则形状(图1)。生理生化测定结果表明：淀粉水解反应，V.P反应，接触酶反应，利用柠檬酸盐反应，硝酸盐还原，石蕊牛奶还原胨化，甲基红反应，明胶液化反应均呈阳性，D-果糖，麦芽糖，阿拉伯糖，木糖，乳糖利用均呈阳性，发酵葡萄糖产酸不产气，厌氧条件下不生长，7％NaCl生长。

菌株16S rDNA序列构建的系统发育树见附图2。菌株N23位于Bacillus vallismortis分支上，与死谷芽孢杆菌Bacillus vallismortis DSM11031相似性在98％以上，结合生理生化试验将N23鉴定为死谷芽孢杆菌。将N23保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年11月3日，保藏编号为CGMCC NO.9920。

实施例2、N23发酵液的生产

将菌株N23(CGMCC NO.9920)接种至PDA培养液中液体发酵生产，发酵生产的条件为：pH6.5，发酵温度范围30℃，搅拌速度为170转/分钟，发酵中后期形成芽孢，发酵时间为48h，使发酵液中含菌或芽孢量≥1×10¹⁰个/ml；

其中所用PDA培养基配制方法为，以配制1L培养基为例：200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min后过滤，滤液中加20g普通蔗糖后定容至1000ml，pH值自然，121℃灭菌20min。

实施例3、功能型生物基质研发

3.1以菌株N23为功能菌的生物基质育苗效果

基质的研发：菌株N23接种(按基质干重的5％接菌，下同)至普通育苗基质中，混合均匀。基质中功能菌株N23的计数采用选择性培养基：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，琼脂2.0％，去离子水1000mL，pH 7.2-7.4，121℃高压灭菌20min；1％多粘菌素2mL，1％放线菌酮4mL(抗生素在培养基倒前冷却后加入)：功能菌N23菌落数以每克基质干重计算。经计数，生物基质中含功能菌数约为3.35×10⁷CFU/g。

育苗试验处理如下：1)普通育苗基质(CK2)；2)添加未接菌PDA培养基的育苗基质(CK1)；3)添加菌株N23发酵液(按基质干重的5％接菌，下同)的育苗生物基质(N23)。将西瓜种子消毒浸种催芽，露白后，埋入三个处理的基质中，每个处理50个重复。30天左右分别测定相关生长指标：株高、茎粗、SPAD、叶面积、地上部鲜重、地上部干重、地下部鲜重、地下部干重和真叶数(表1)。并稀释涂布计数各处理中功能菌N23在根际的定殖数量。

同样的处理，重复做第二季和第三季(表2，表3)。

综上所述，三季苗盘育苗试验中：相比于普通育苗基质(CK2)及添加未接菌空白培养基的育苗基质(CK1)，添加功能菌研制成的育苗生物基质(N23)均对西瓜苗的生长有明显的促生效果，除SPAD值外，其他生长指标均有显著性差异。(表1，表2，表3)。在功能菌方面，三季苗盘育苗实验中，添加菌株N23发酵液的育苗生物基质所育西瓜种苗30天左右根际含有功能菌的数量分别为1.08×10⁷CFU/g、3.56×10⁷CFU/g、5.04×10⁷CFU/g(根际基质干重)。

表1 第一季生物基质育苗30天对西瓜苗期生长的影响

      

表2 第二季生物基质育苗30天对西瓜苗期生长的影响

      

表3 第三季生物基质育苗30天对西瓜苗期生长的影响

      

3.2功能型育苗基质所育西瓜苗的盆栽试验

将功能型基质以及普通基质所育的西瓜种苗进行盆栽试验，共设三个处理：1)普通基质所育种苗(CK)；2)添加功能菌N23的生物基质(按基质干重的5％接菌，下同)所育种苗(N23)。每个处理6盆，每盆2.5公斤土，每盆施入1.5％的普通有机肥与土拌匀作为基肥，30d左右测定各处理株高、茎粗、叶面积、SPAD值、地上部鲜重、地上部干重、真叶数(表4)，并取样涂布计数西瓜根际的功能菌N23数量。(涂布计数方法同上)。

同样的处理，重复种第二季(表5)

两季盆栽结果一致，相比于普通育苗基质(CK)，添加功能菌研制成的育苗生物基质(N23)均对西瓜苗的生长有明显的促生效果，除SPAD值外，其他生长指标均有显著性差异(表4，表5)。在功能菌方面，两季盆栽试验中，使用生物基质所育西瓜苗的根际土中含有功能菌的数量为1.23×10⁷CFU/g、0.67×10⁷CFU/g(根际土干重)。

在盆栽试验结果中，活性基质所育种苗，由于根际已经定殖有大量的功能菌N23，在盆栽试验中功能菌N23能够更好的发挥其功能，无论是功能菌定殖情况以及盆栽效果均显著优于普通育苗基质所育种苗的效果。

表4 第一季移苗30天对西瓜生长的影响

      

表5 第二季移苗30天对西瓜生长的影响

      

3.3功能型育苗基质对不同种作物促生效果的苗盘试验

将功能型基质以及普通基质分别对黄瓜、辣椒和番茄进行批量育苗，处理如下：1)CK，使用普通育苗基质育黄瓜、辣椒和番茄苗；2)使用添加功能菌株N23发酵液(按基质干重的5％接菌，下同)的生物基质育黄瓜、辣椒和番茄苗。将黄瓜、辣椒和番茄种子消毒浸种催芽，露白后，埋入填满普通基质和生物基质的72孔穴盘中，每个处理216个重复。30天后分别测定黄瓜、辣椒和番茄的相关指标：株高、茎粗、叶面积、地上部鲜重和地上部干重。结果表明，相比于普通育苗基质，添加功能菌研制成的育苗生物基质均能增加植株的株高、茎粗、地上部鲜重和地上部干重且各指标，均达到显著差异水平。(表6)

表6功能型育苗基质对不同种作物苗期生长促生效果

      

      

3.4功能型育苗基质对不同种作物促生效果田间试验

将功能型基质和普通基质分别育黄瓜、辣椒和番茄种苗，待种苗长势两叶一心时移栽到蔬菜大棚中进行田间实验，处理如下：1)CK，使用普通育苗基质育黄瓜、辣椒和番茄种苗；2)使用添加功能菌株N23发酵液(按基质干重的5％接菌，下同)的生物基质育黄瓜、辣椒和番茄种苗。移栽20天后分别测定黄瓜、辣椒和番茄的相关指标：株高、茎粗。移栽60天开始计数各处理作物的产量，所采记产作物按统一规格采摘，且之后每隔一段时间计产一次，共计产4次。结果表明，相比于普通育苗基质，添加功能菌研制成的育苗生物基质均能增加植株的株高和茎粗，在作物产量上也均达到显著差异水平。(表7、表8)

以上实施例中使用的普通的育苗基质均为江苏淮安柴米河基质肥料有限公司生产的育苗基质，其中含有机质(基质干重，下同)≥20％，总养分(N+P₂O₅+K₂O)1.5％～7％，水分≤55％，pH值5.5～7.5，Ec≤2.5ms/cm。

表7 功能型育苗基质对不同种作物田间生长促生效果

      

表8 功能型育苗基质对不同种作物产量影响

      

Claims (9)

1.一种死谷芽孢杆菌N23，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2014年11月3日，保藏号为CGMCC NO.9920。

2.权利要求1所述的死谷芽孢杆菌N23在制备功能型蔬菜育苗生物基质中的应用。

3.权利要求1所述的死谷芽孢杆菌N23的发酵液在制备功能型蔬菜育苗生物基质中的应用。

4.一种含死谷芽孢杆菌N23的功能型蔬菜育苗生物基质，其特征在于普通育苗基质中添加所述的死谷芽孢杆菌N23发酵液，所述的死谷芽孢杆菌N23，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2014年11月3日，保藏号为CGMCC NO.9920。

5.根据权利要求4所述的含死谷芽孢杆菌N23的功能型蔬菜育苗生物基质，其特征在于所述的功能型蔬菜育苗生物基质中所述的死谷芽孢杆菌N23活菌数≥1.0×10⁷CFU/g基质干重，有机质≥20％，总养分(N+P₂O₅+K₂O)1.5％～7％，水分≤55％，pH值5.5～7.5，Ec≤2.5ms/cm。

6.根据权利要求4所述的功能型蔬菜育苗生物基质，其特征在于所述的功能型菌株N23发酵液通过以下发酵方法制备：

将保藏号为CGMCC NO.9920的死谷芽孢杆菌N23按基质干重的5％(体积质量比)接种到PDA培养液中，进行液体发酵生产，发酵生产的条件为：pH6.0～7.0，发酵温度范围30～35℃，搅拌速度为170～200转/分钟，发酵中后期形成芽孢，发酵时间为43～50h，使发酵液中含菌或芽孢量≥1×10¹⁰个/ml；

其中所用PDA培养基配制方法为，以配制1L培养基为例：200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min后过滤，滤液中加20g普通蔗糖后定容至1000ml，pH值自然，121℃灭菌20min。

7.根据权利要求4所述的功能型蔬菜育苗生物基质，其特征在于所述的蔬菜选自西瓜、黄瓜、辣椒或番茄中的任意一种。

8.权利要求4所述的含死谷芽孢杆菌N23的功能型蔬菜育苗生物基质的制备方法，其特征在于包含以下步骤：

(1)制备保藏号为CGMCC NO.9920的死谷芽孢杆菌N23发酵液；

(2)将步骤(1)制备的发酵液按基质干重的5％加入普通育苗基质混合均匀得功能型蔬菜育苗生物基质，使其中活菌数≥1.0×10⁷CFU/g基质干重。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于所述的功能型菌株N23发酵液通过以下发酵方法制备：

将保藏号为CGMCC NO.9920的死谷芽孢杆菌N23按基质干重的5％接种到PDA培养液中，进行液体发酵生产，发酵生产的条件为：pH6.0～7.0，发酵温度范围30～35℃，搅拌速度为170～200转/分钟，发酵中后期形成芽孢，发酵时间为43～50h，使发酵液中含菌或芽孢量≥1×10¹⁰个/ml；

其中所用PDA培养基配制方法为，以配制1L培养基为例：200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min后过滤，滤液中加20g普通蔗糖后定容至1000ml，pH值自然，121℃灭菌20min。