CN105462898A - 一株有效促进作物生长的海水芽孢杆菌l-60及其应用 - Google Patents

一株有效促进作物生长的海水芽孢杆菌l-60及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株有效促进作物生长的海水芽孢杆菌L-60及其应用，该菌株分离于马铃薯根际，基于生理生化特性和16S？rDNA分析被归类为海水芽孢杆菌(Bacillus？aquimaris)。高效液相色谱分析结果表明，菌株L-60具备强产吲哚乙酸(IAA)能力；盆栽试验结果表明，基于该菌株研制的促生生物肥料能够显著性促进玉米、黄瓜和蕃茄植株的生长。

Description

一株有效促进作物生长的海水芽孢杆菌L-60及其应用
技术领域
本发明属于农业微生物领域，具体涉及一株有效促进作物生长的海水芽孢杆菌L-60及其应用。
背景技术
植物根际促生菌(PlantGrowth-promotingRhizobacteria,PGPR)是指存在于植物根际表面及根系周围土壤微环境中，能通过直接或间接的方式显著促进植物生长的微生物(Ahmadetal,2008)。通常根际促生菌最显著的促生能力是能分泌植物激素，研究较多的为吲哚乙酸(Indole-3-aceticacid,IAA)，IAA通过促进细胞的伸长和有丝分裂促进植物生长(Glicketal,1998)，并且IAA能溶解土壤中难溶的磷，提高作物对土壤中磷的吸收(李海宗等，2014)。从根际分离获得高效促生菌株，成为微生物肥料领域的热点。目前，尚未见Bacillusaquimaris能够分泌IAA，促进植物生长方面的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，提供一株有效促进作物生长的海水芽孢杆菌L-60。
本发明的另一目的是提供该细菌的应用。
本发明的又一目的是提供该细菌制备的生物肥料及其应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一株用于促进作物生长的促生菌株L-60，分离自甘肃马铃薯长期定位点的马铃薯根际，分类命名为海水芽孢杆菌(Bacillusaquimaris)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年1月7日，保藏编号为CGMCCNo.10285。
菌株L-60在LB平板上呈饱满突起规则圆形，表面光滑，淡黄色。革兰氏染色阳性，接触酶和利用柠檬酸盐反应呈阳性，硝酸盐还原呈阳性，可水解明胶，不耐受10％NaCl。菌株16SrDNA序列构建的系统发育树分析表明，菌株L-60位于Bacillusaquimaris分支上，结合生理生化试验将L-60鉴定为海水芽孢杆菌。
本发明所述海水芽孢杆菌L-60在产植物激素IAA和/或促进植物生长中的应用。
本发明所述海水芽孢杆菌L-60在制备促进植物生长的生物肥料中的应用。
由本发明所述海水芽孢杆菌L-60制备的生物肥料。
所述的生物肥料优选主要通以下方法制备：将保藏号为CGMCCNo.10285的海水芽孢杆菌L-60接种到PDA液体培养基中，进行液体发酵生产，发酵生产的条件为：pH6.0～7.0，发酵温度范围30～35℃，搅拌速度为170～200转/分钟，发酵时间为48h，使发酵液中含菌量≥1×1010个/mL。所用PDA培养液配制方法为，以配制1L培养基为例：用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值调至7.2-7.4，121℃灭菌20min。
所述的生物肥料进一步优选将得到的发酵液按照常规方法制备为其他的生物肥料常用剂型，优选制备为粉剂、颗粒剂或悬浮剂。
本发明所述的生物肥料在产IAA和/或促进植物生长中的应用。
所述的应用，优选将所述的发酵液直接加至植物根际，或将所述的发酵液6000～8000r/min离心8～10min后，采用与发酵液体积相等的生理盐水(浓度0.9％)重悬菌体制备成菌悬液，然后直接加至植物根际。以降低成本为基准，发酵液或菌悬液的灌菌量优选按菌液体积与土壤重量比为20～30mL·kg-1来施用，进一步优选按照25mL·kg-1来施用。
有益效果：
本发明主要利用分离筛选出的能够高产IAA和根际有效定植的海水芽孢杆菌的施用，显著提高作物苗期的生长速度，促进作物对土壤中养分的吸收利用，从而促进作物生长。本发明促生菌L-60在多季盆栽试验中表现出的稳定促生能力。本发明生物肥料应用后促生效果明显，适合蔬菜作物产区大面积使用。
附图说明
图1基于菌株L-60的16SrDNA基因序列采用邻接法建立的系统发育树
图2第一季玉米盆栽效果图
图3第二季玉米盆栽效果图
图4第一季黄瓜盆栽效果图
图5第二季黄瓜盆栽效果图
图6第一季番茄盆栽效果图
生物材料保藏信息
菌株L-60，分类命名为海水芽孢杆菌Bacillusaquimaris，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2015年1月7日，保藏编号为CGMCCNo.10285。
具体实施方式
实施例1、功能菌株的分离及鉴定
将5g剪成小段的马铃薯根置于盛有45ml无菌水的三角瓶中，30℃振荡30min(170r/min)制成根际土悬液，将该悬液于80℃水浴20min，然后依次配备10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的土壤稀释液。吸取0.1mL不同稀释梯度根际土悬液置于LB平板并涂布，放置于30℃培养箱中培养24h，观察平板上菌落生长情况，挑选差异菌落纯化，将纯化后的菌株接种到斜面培养基上并置于4℃冰箱保存待用。
从分离出的细菌中筛选出能产IAA的功能菌株，筛选方法为：将已过滤除菌的2mg/mLL-色氨酸母液加入3mL液体LB培养基中，使其终浓度为500μg/mL，将待测菌种接种于该液体培养基后，于30℃、170r/min培养24h，离心取上清与Salkowski比色液等量混合于白瓷板上，暗处放置30min后观察显色情况，每个样品设3个重复，空白对照为未接菌的培养基与比色剂的混合液，能发生显色反应即可产生IAA。
从能发生显色反应的菌株中筛选IAA产量高的菌株，方法为：将待测菌株接种于75mL含100μg/mLIAA的LB培养基中，于30℃、170r/min培养48h，将培养液于4℃、10000rpm离心10min，取上清液，加入等量的乙酸乙酯混匀后静置浸提一小时，浸提两次，取上层浸提液于30℃条件下旋转蒸发，并用2mL色谱纯的甲醇溶解旋转蒸发后的物质，每株菌3个重复，最后用0.45μm的有机相滤膜过滤溶有旋蒸物的甲醇，得到的滤液即可用于高效液相色谱检测(液相条件为：流动相为甲醇：0.1％乙酸＝60：40，测样温度30℃，进样速度1mL/min，波长230nm，进样量10μl，测样时间15min。)。
通过两次筛选最终获得一株细菌命名为L-60，菌株L-60在LB平板上呈饱满突起规则圆形，表面光滑，淡黄色。革兰氏染色阳性，接触酶和利用柠檬酸盐反应呈阳性，硝酸盐还原呈阳性，可水解明胶，不耐受10％NaCl。菌株16SrDNA序列构建的系统发育树分析表明，菌株L-60位于Bacillusaquimaris分支上，结合生理生化试验将L-60归类为Bacillusaquimaris，将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.10285。
实施例2、功能菌灌菌菌悬液的产生
将菌株L-60(CGMCCNo.10285)接种至PDA培养液中液体发酵生产，发酵生产的条件为：pH7.0，发酵温度范围30℃，搅拌速度为170转/分钟，发酵时间为48h，使发酵液中含菌量≥1×1010个/mL；灌菌液为发酵液6000r/min离心8min后，采用等体积0.9％的生理盐水重悬菌体获得的菌悬液，或直接使用发酵液作为灌菌液。
其中所用PDA培养液配制方法为，以配制1L培养基为例：用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值调至7.2-7.4，121℃灭菌20min。
实施例3、盆栽促生效果试验
3.1促生生物肥在玉米(第一季、第二季)上的应用效果
促生盆栽试验在国家有机类肥料工程技术研究中心(宜兴)温网室内进行，供试玉米品种为苏玉29，将玉米种子浸泡在常温水中4h，放置在湿润的纱布上于30℃培养箱中催芽2～3d，待75％以上种子萌发后，选取露白的种子移至育苗盘育苗，待长出2片真叶后挑选长势一致幼苗移栽盆中。试验设置两个处理：1)CK，只施用腐熟鸡粪；2)处理L-60，施用腐熟鸡粪和L-60的菌悬液。每个处理8盆，每盆装2kg土，腐熟鸡粪添加量为1.5％(质量百分比，以2kg土为基准)，L-60的菌悬液按菌液体积与土壤重量比为25mL·kg-1来施用，常规管理，40d左右后测量植株的生理指标。
第一季玉米促生效果如图2、生物量情况如表1所示，盆栽培养40d后，施用腐熟鸡粪和L-60菌悬液处理(L-60)与单施腐熟鸡粪(CK)，在各项指标中除茎粗和叶绿素外，其余均达到显著性差异(p<0.05)。于CK相比，施用腐熟鸡粪和L-60菌悬液(L-60)处理在株高、地上部鲜重和地上部干重方面分别增加了20％、32％和20％。
第二季玉米促生效果如图3、生物量情况如表2所示，盆栽培养40d后，施用腐熟鸡粪和L-60菌悬液(L-60)后使得玉米植株的地上部干重、地下部鲜重和地下部干重均显著高于单施腐熟鸡粪(CK)处理(p<0.05)。与CK相比，施用腐熟鸡粪和L-60菌悬液的处理在株高、叶绿素、地上部鲜重、地上部干重、地下部鲜重和地下部干重方面，分别增加了5.7％、10.％、24.％、35％、53％和23％。
综上两季盆栽结果表明，施用腐熟鸡粪和L-60菌悬液(L-60)处理与单施腐熟鸡粪(CK)处理的玉米株高、地上部鲜重、地上部干重、地下部鲜重和地下部干重之间差异明显，说明L-60菌株的促生效果明显。
表1、第一季玉米促生盆栽试验生物量情况
SIG意为“显著性”，后面的值就是统计出的P值，如果P值0.01<P<0.05,则为差异显著，如果P<0.01,则差异极显著。下同。
表2、第二季玉米盆栽促生试验生物量情况
3.2促生生物肥在黄瓜(第一季、第二季)上的应用效果
黄瓜品种为新津研7号，两季黄瓜盆栽采用上述同样的育苗方式和处理。第一季黄瓜盆栽促生效果如图4、生物量结果如表3所示，盆栽培养40d后，施用腐熟鸡粪和L-60菌悬液后黄瓜植株的地上部干重都显著性增加(p<0.05)，相对于单施腐熟鸡粪(CK)处理分别增加了10％和12％。
第二季黄瓜盆栽促生效果图如图5、生物量结果如表4所示，盆栽培养40d后，施用腐熟鸡粪和L-60菌悬液(L-60)后，相对于单施腐熟鸡粪(CK)，黄瓜植株的株高、茎粗、叶绿素、地上部鲜重和地上部干重分别增加了3.2％、2.3％、4.5％、16.6％和8.5％。
综上两季盆栽结果表明，施用腐熟鸡粪和L-60菌悬液(L-60)处理黄瓜植株长势优于单施腐熟鸡粪(CK)处理，且在株高和地上部干重方面与单施腐熟鸡粪(CK)处理之间差异明显。说明L-60菌株对黄瓜具有较好促生效果。
表3、第一季黄瓜盆栽促生试验生物量情况
表4、第二季黄瓜盆栽促生试验生物量情况
3.3促生生物肥在番茄(第一季、第二季)上的应用效果
番茄品种为合作906粉红番茄，两季番茄盆栽采用与玉米同样的育苗方式和处理。第一季番茄盆栽促生效果如图6、生物量结果如表5所示，盆栽培养40d后，施用腐熟鸡粪和L-60菌悬液使得番茄植株的株高和茎粗显著性增加(p<0.05)，相比于单施腐熟鸡粪(CK)处理分别增加了36％和24％。
第二季番茄盆栽生物量结果如表6所示，盆栽培养40d后，施用腐熟鸡粪和L-60菌悬液(L-60)处理的番茄植株除地下部鲜重外，其它指标均与单施腐熟鸡粪(CK)处理之间达到显著性差异(p<0.05)。与CK相比，施用腐熟鸡粪和L-60菌悬液(L-60)处理的番茄株高、茎粗、叶绿素、地上部鲜重、地上部干重、地下部鲜重和地下部干重分别增加了16％、16％、13％、33％、20％、4％和22％。
综上两季盆栽结果表明，施用腐熟鸡粪和L-60菌悬液(L-60)处理番茄植株长势优于单施腐熟鸡粪(CK)处理，且在株高、茎粗、地上部鲜重、地上部干重和地下部干重方面达到显著性差异，表明L-60菌株具有明显的促生效果。
表5、第一季番茄盆栽促生试验生物量情况
表6、第二季番茄盆栽促生试验生物量情况

Claims (10)

1.一株海水芽孢杆菌(Bacillusaquimaris)L-60，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年1月7日，菌种保藏号为CGMCCNo.10285。
2.权利要求1所述的海水芽孢杆菌L-60在产植物激素IAA和/或促进植物生长中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述植物为玉米、黄瓜和/或番茄。
4.权利要求1所述的海水芽孢杆菌L-60在制备促进植物生长的生物肥料中的应用。
5.由权利要求1所述的海水芽孢杆菌L-60制备的生物肥料。
6.根据权利要求5所述的生物肥料，其特征在于主要通过以下方法制备：将保藏号为CGMCCNo.10285的海水芽孢杆菌L-60接种到PDA液体培养基中，进行液体发酵生产，发酵生产的条件为：pH6.0～7.0，发酵温度范围30～35℃，搅拌速度为170～200转/分钟，发酵时间为48h，使发酵液中含菌量≥1×1010个/mL。
7.根据权利要求6所述的生物肥料，其特征在于得到发酵液后将其按照常规方法制备为其他的生物肥料常用剂型，优选制备为粉剂、颗粒剂或悬浮剂。
8.权利要求5-7中任一项所述的生物肥料在产IAA和/或促进植物生长中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于将权利要求6所述的发酵液直接加至植物根际，或将权利要求6所述的发酵液6000～8000r/min离心8～10min后，采用与发酵液体积相等的生理盐水重悬菌体制备成菌悬液，然后直接加至植物根际，发酵液或菌悬液的灌菌量按菌液体积与土壤重量比为20～30mL·kg-1来施用，优选按照25mL·kg-1来施用。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述植物为玉米、黄瓜和/或番茄。
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