CN113322209A

CN113322209A - 基于菌株间生态关系生产植物促生复合菌剂及其应用

Info

Publication number: CN113322209A
Application number: CN202110749176.7A
Authority: CN
Inventors: 沈其荣; 徐志辉; 刘妍; 张瑞福; 邵佳慧; 解继驭
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2021-07-01
Filing date: 2021-07-01
Publication date: 2021-08-31
Anticipated expiration: 2041-07-01
Also published as: CN113322209B

Abstract

本发明提供了基于菌株间生态关系生产植物促生复合菌剂及其应用。一种植物促生复合菌剂，由解淀粉芽孢杆菌SQR9、解淀粉芽孢杆菌RF‑CU‑1、赖氨酸芽孢杆菌RF‑CU‑2和美丽短芽孢杆菌RF‑CU‑3的菌液混合而成。本发明芽孢杆菌合成菌群能相互合作并显著促进黄瓜植株生长，在实验室无菌水培条件下，随着接种菌群多样性的提高其促生效果也显著提高。

Description

基于菌株间生态关系生产植物促生复合菌剂及其应用

技术领域

本发明属于农业微生物领域，涉及基于菌株间生态关系生产植物促生复合菌剂的设计方法及其应用。

背景技术

植物根际微生物被认为是植物的第二基因组，在宿主的营养吸收和协助植物应对各类生物和非生物胁迫等方面起到关键作用，应用植物根际促生菌提高作物产量和品质是现代绿色农业发展的重要趋势之一。目前，限制生物肥料产业发展的主要瓶颈是田间应用效果的不稳定性，肥料中的功能微生物施入土壤后面临土著微生物的排斥和竞争，微生物肥料生物功能的稳定发挥难以保障。科学研究表明，提高功能微生物的物种多样性即施用复合微生物菌剂可以增强微生物肥料各类生物功能的发挥和稳定性。

复合微生物是由两种或两种以上且互不拮抗的微生物共同组成的群落。相比于单一微生物菌剂，功能性更强更全面，更能适应复杂环境，在发酵，废物处理及农业等生物技术过程中得到广泛应用。在农业生产上使用复合微生物菌剂，能够有效提高农作物品质和产量以及抗病能力，从而达到减肥减药的效果，有助于实现农业集约化生产和可持续发展。

微生物间的亲缘识别，是指微生物个体通过一定的识别机制，识别与自身有密切关系的个体，并确保自身无私行为的受益者属于关系很近的个体。研究证实，亲缘识别是微生物辨别敌友关系，进而开展社会性生态行为的基础。芽孢杆菌的合作菌株在游动(Swarming)培养基上形成融合表型，而非合作菌株形成边界表型，抵御对方对自身资源的侵蚀。形成融合表型的芽孢杆菌菌株证明可以相互合作。植物根表定殖实验表明，合作的菌株组合能共同定殖于植物根表，而非合作的菌株组合只有一类芽孢杆菌能成功定殖，并通过排斥系统阻止了其他芽孢杆菌的定殖，说明芽孢杆菌菌群的根际定殖能力与菌株间的合作关系密切相关。

发明内容

本发明的目的在于进一步提高微生物肥料的应用效果，开发研制出一种基于菌株间生态关系构建一个稳定且对植物有益的芽孢杆菌复合菌群，为复合微生物肥料产业提供技术支持。

本发明的又一目的是提供芽孢杆菌复合菌剂的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种植物促生复合菌剂，由解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SQR9、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)RF-CU-1、赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macrolides)RF-CU-2和美丽短芽孢杆菌(Brevibacillus formosus)RF-CU-3的菌液混合而成；所述的四株芽孢杆菌菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其中解淀粉芽孢杆菌SQR9保藏日期为2012年2月27日，保藏编号为CGMCCNO.5808；解淀粉芽孢杆菌RF-CU-1保藏日期为2020年12月7日，保藏号为CGMCC NO.21330；赖氨酸芽孢杆菌RF-CU-2保藏日期为2020年12月7日，保藏号为CGMCC NO.21331；美丽短芽孢杆菌RF-CU-3保藏日期为2020年12月7日，保藏号为CGMCC NO.21332。

本发明所述的植物促生复合菌剂通过以下原则筛选后组成：

(1)：所选菌株均来自于植物根际。植物根表定殖的芽孢杆菌在游动培养基上挑选出来后做分子鉴定，同时置于半固体Swarming培养基上进行对峙试验，选取相互之间为融合表型的菌株，完成初筛。

(2)：所选菌株进行生物膜共培养试验，选取共培养后生物膜生物量增加的菌株组合，完成复筛。

(3)：最终确定菌株进行根际定殖试验，复合菌群的根际定殖能力显著高于单菌且根际定殖数量随芽孢杆菌菌株多样性的增强而提高，确定菌群组合。

本发明所述的植物促生复合菌剂的制备方法，分别将活化后的菌株SQR9、RF-CU-1、RF-CU-2和RF-CU-3接种于LB液体培养基30-37℃150-170r min^-1培养18-26小时；离心、清洗获得菌体，用等量无菌超纯水重悬菌体；等量混合四种菌液调节OD₆₀₀至3-5，即为所述的植物促生复合菌剂。

本发明所述的植物促生复合菌剂在促进蔬菜生长中的应用，优选在促进黄瓜生长中的应用。

本发明所述的植物促生复合菌剂在黄瓜幼苗期和全生育期的应用。

有益效果

本发明提供一种由四种芽孢杆菌组成的复合菌剂及其制作工艺。使用上述菌群设计思路设计的芽孢杆菌合成菌群能相互合作并显著促进黄瓜植株生长，不同菌株多样性的处理信息详见表1。在实验室无菌水培条件下，随着接种菌群多样性的提高其促生效果也显著提高(接种不同多样性的芽孢杆菌后，黄瓜株高和干重指标与未接菌的对照(CK)相比，其株高平均提高了21.1％(1种芽孢杆菌)、29.4％(2种芽孢杆菌)、45.6％(3种芽孢杆菌)和58.3％(4种芽孢杆菌)；其干重平均提高了17.8％(1种芽孢杆菌)、29.4％(2种芽孢杆菌)、45.5％(3种芽孢杆菌)和79.6％(4种芽孢杆菌))，其中接种四种菌株的合成菌群效果最好，其黄瓜苗在株高和干重上比没有接菌的对照相比分别提高了58.3％和79.6％(图6)。在自然土培条件下，与水培培养趋势一致，随着接种菌群多样性的提高也显著提高黄瓜植株的促生效果。其中接种四株菌株的合成菌群的促生效果最好，随着接种菌群多样性的提高其促生效果也显著提高(接种不同多样性的芽孢杆菌后，黄瓜株高和干重指标与未接菌的对照(CK)相比，其株高平均提高了2.2％(1种芽孢杆菌)、18.4％(2种芽孢杆菌)、26.7％(3种芽孢杆菌)和32.5％(4种芽孢杆菌)；其干重平均提高了14.7％(1种芽孢杆菌)、51.1％(2种芽孢杆菌)、72.6％(3种芽孢杆菌)和84.2％(4种芽孢杆菌))，

其中接种4种菌株的合成菌群处理黄瓜植株在株高和干重上比没有接菌的对照相比分别提高了32.5％和84.2％(图7)。本发明对科学组合芽孢杆菌复合菌剂产品具有重要指导意义。

附图说明

图1黄瓜根系Swarming平板实验。

a：放置在半固体的Swarming平板上黄瓜根系，菌株从根系游出到平板上；b：荧光体视显微镜下，绿色荧光场和自然光明场下平板菌株形态，使用了绿色荧光标记的菌株SQR9在激发光下呈现绿色。

图2菌株间Swarming平板对峙实验。图中SQR9代表解淀粉芽孢杆菌SQR9，A代表解淀粉芽孢杆菌RF-CU-1，B代表赖氨酸芽孢杆菌RF-CU-2，C代表美丽短芽孢杆菌RF-CU-3。其中SQR9-A代表解淀粉芽孢杆菌SQR9与解淀粉芽孢杆菌RF-CU-1的Swarming对峙，其他处理依次类推。

图3菌株单独培养和混合培养的生物膜形成能力的定量测定。随着芽孢杆菌多样性的增加，生物膜形成能力逐步增加。图中数字1-4代表芽孢杆菌的多样性，1代表一种芽孢杆菌，2代表两种芽孢杆菌，依次类推。多菌复合菌群的具体施用菌株间表1中的处理说明。

图4菌株单独接种和混合接种的根际定殖能力测定。图中数字1-4代表芽孢杆菌的多样性，处理信息见表1中的处理说明。

图5芽孢杆菌菌株(SQR9、RF-CU-1、RF-CU-2和RF-CU-3)的系统发育树。

图6多菌复合菌剂在水培体系下对黄瓜植株苗期的促生效果。其中柱状图中的不同颜色的长方形代表不同的芽孢杆菌菌株。图中数字1-4代表芽孢杆菌的多样性，处理信息见表1中的处理说明。

图7多菌复合菌剂接种黄瓜盆栽实验(土培)。图A和B中柱状图中的不同颜色的长方形代表不同的芽孢杆菌菌株，图中数字1-4代表芽孢杆菌的多样性，处理信息见表1中的处理说明。图C展示了部分接菌处理对植物的促生效果，图中9代表接种菌株SQR9处理及其重复，9A代表接种2株菌(SQR9和RF-CU-1)处理及其重复，9AB代表接种3株菌(SQR9、RF-CU-1和RF-CU-2)处理及其重复，9ABC代表接种4株菌(SQR9、RF-CU-1、RF-CU-2和RF-CU-3)处理及其重复。

生物材料保存信息

RF-CU-1，分类命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年12月7日，保藏号为CGMCCNO.21330，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

RF-CU-2，分类命名为Lysinibacillus macrolides，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年12月7日，保藏号为CGMCC NO.21331，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

RF-CU-3，分类命名为美丽短芽孢杆Brevibacillus formosus，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年12月7日，保藏号为CGMCCNO.21332，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

具体实施方式

1.菌株筛选和分离鉴定

(1)菌株初筛和16S rDNA鉴定

将菌株SQR9-gfp接入黄瓜盆栽中，接菌量为终浓度10⁶CFU/g，两周后取黄瓜根系，用去离子纯水洗去根表面土壤，置于半固体Swarming培养基上，定殖在根表上的菌株会从根上游出至培养基，荧光体视镜下，SQR9-gfp会发出绿色荧光(图1)，挑取其周围融合菌株，平板划线分离，并进行16S rDNA测序鉴定，获得100多株细菌，甘油管保存于-80℃冰箱。

(2)菌株复筛和表型鉴定

基于16S rDNA序列，建立系统发育树，系统发育树同一树枝上的菌株，利用Swarming半固体培养基进行成对菌株对峙实验(图2)，去除重复菌株，初步筛选到菌株RF-CU-1、RF-CU-2和RF-CU-3。Swarming培养基配方为：15mM(NH₄)₂SO₄，8mM MgSO₄×7H₂O，27mMKCl，50mM Tris·HCl，2mM CaCl₂×2H₂O,1μM FeSO₄×7H₂O，10μM MnSO₄×4H₂O，0.6mMKH₂PO₄，4.5mM谷氨酸钠，0.86mM赖氨酸，0.78mM色氨酸，0.2％葡萄糖，7mM二水合柠檬酸钠，0.7％琼脂，pH 7，115℃高压灭菌30min。

2.复合菌剂制备方法，优选具体包括以下步骤：

(1)单菌株发酵液的生产：菌株SQR9、RF-CU-1、RF-CU-2和RF-CU-3分别在LB固体培养基上划线，37℃过夜培养获得单菌落，挑取单菌落于盛有3mL LB液体培养基的试管中，37℃ 170r min^-1过夜培养活化，取1mL接种于盛有100mL LB液体培养基的500mL三角瓶中，37℃ 170r min^-1培养24h；

(2)发酵液中培养基的去除及菌体清洗：将细菌发酵液分装于50mL离心管中，配平后使用4℃预冷的离心机，5000rpm离心5min，弃上清后取等量无菌超纯水轻轻重悬，采用同上条件再次离心，弃上清后等量无菌超纯水重悬第二次，同上条件离心，弃上清后等量无菌超纯水重悬；

(3)调节四株菌OD₆₀₀值相同：使用分光光度计分别测定四种菌液的OD₆₀₀值并用无菌超纯水调节；

(4)取调节OD₆₀₀后的四种菌液，等量混合将OD₆₀₀调节至4(大于2×10⁸CFU/mL)即为多菌复合菌剂。

3.黄瓜盆栽实验验证多菌复合菌剂促生效果

无菌水培试验：选用津春四号黄瓜品种，浸种后表面消毒，放置在无菌润湿滤纸上生根后，移入无菌三角瓶中种植。设置CK、1、2、3和4四个处理，CK代表不接菌，1代表接种单菌、2代表接种两菌、3代表接种三菌、4代表接种4菌菌剂，具体处理见表1，每种菌株组合5个生物学重复。移栽一周后接菌，接种量为终浓度10⁶CFU/mL，接菌20天后取样测定黄瓜植株各项生物学指标，每组多个处理取平均值，结果见图6。结果表明，在实验室无菌水培条件下，随着接种菌群多样性的提高其促生效果也显著提高(接种不同多样性的芽孢杆菌后，黄瓜株高和干重指标与未接菌的对照(CK)相比，其株高平均提高了21.1％(1种芽孢杆菌)、29.4％(2种芽孢杆菌)、45.6％(3种芽孢杆菌)和58.3％(4种芽孢杆菌)；其干重平均提高了17.8％(1种芽孢杆菌)、29.4％(2种芽孢杆菌)、45.5％(3种芽孢杆菌)和79.6％(4种芽孢杆菌))，其中接种4种菌株的合成菌群效果最好，其黄瓜苗在株高和干重上比没有接菌的对照相比分别提高了58.3％和79.6％。

表1:不同芽孢杆菌多样性处理的菌株施用信息

自然土壤盆栽试验：选用津春四号黄瓜品种，浸种后表面消毒，放置在润湿滤纸上生根后，播种到100孔育苗盘中，置于温度25℃、湿度50％人工气候室培养至两叶一心，选取大小一致的幼苗，移栽到盛有3kg水稻土的盆钵中，设置CK、1、2、3和4四个处理，CK代表不接菌，1代表接种单菌、2代表接种两菌、3代表接种三菌、4代表接种4菌菌剂，具体处理见表一，每种菌株组合5个生物学重复。移栽一周后接菌，接种量为终浓度10⁶CFU/g土壤，接菌65天后取样测定黄瓜植株各项生物学指标，结果见图7。结果表明，在自然土培条件下，与水培培养趋势一致，随着接种菌群多样性的提高也显著提高黄瓜植株的促生效果。其中接种四株菌株的合成菌群的促生效果最好，随着接种菌群多样性的提高其促生效果也显著提高(接种不同多样性的芽孢杆菌后，黄瓜株高和干重指标与未接菌的对照(CK)相比，其株高平均提高了2.2％(1种芽孢杆菌)、18.4％(2种芽孢杆菌)、26.7％(3种芽孢杆菌)和32.5％(4种芽孢杆菌)；其干重平均提高了14.7％(1种芽孢杆菌)、51.1％(2种芽孢杆菌)、72.6％(3种芽孢杆菌)和84.2％(4种芽孢杆菌))，其中接种4种菌株的合成菌群处理黄瓜植株在株高和干重上比没有接菌的对照相比分别提高了32.5％和84.2％，比单接。图7C展示了部分接菌处理对植物的促生效果，复合菌剂的植物促生表型随着菌株数量的增加而逐步增强。图7C中9代表接种菌株SQR9处理及其重复，9A代表接种2株菌(SQR9和RF-CU-1)处理及其重复，9AB代表接种3株菌(SQR9、RF-CU-1和RF-CU-2)处理及其重复，9ABC代表接种4株菌(SQR9、RF-CU-1、RF-CU-2和RF-CU-3)处理及其重复。

Claims

1.一种植物促生复合菌剂，其特征在于由解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)SQR9、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)RF-CU-1、赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus macrolides)RF-CU-2RF-CU-2和美丽短芽孢杆菌(Brevibacillus formosus)RF-CU-3RF-CU-3的菌液混合而成；所述的四株芽孢杆菌菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其中解淀粉芽孢杆菌SQR9保藏日期为2012年2月27日，保藏编号为CGMCC NO.5808；解淀粉芽孢杆菌RF-CU-1保藏日期为2020年12月7日，保藏号为CGMCC NO.21330；赖氨酸芽孢杆菌RF-CU-2保藏日期为2020年12月7日，保藏号为CGMCC NO.21331；美丽短芽孢杆菌RF-CU-3保藏日期为2020年12月7日，保藏号为CGMCC NO.21332。

2.根据权利要求1所述的植物促生复合菌剂，其特征在于所述的植物促生复合菌剂的细胞数高于2×10⁸CFU/mL。

3.根据权利要求1所述的植物促生复合菌剂，其特征在于所述的植物促生复合菌剂主要通过以下方法制备：分别将活化后的菌株SQR9、RF-CU-1、RF-CU-2和RF-CU-3接种于LB液体培养基30-37℃、150-170r min^-1培养18-26小时；离心、清洗获得菌体，用等量无菌超纯水重悬菌体；等量混合四种菌液调节OD₆₀₀至3-5，即为所述的植物促生复合菌剂。

4.权利要求1所述的植物促生复合菌剂的制备方法，其特征在于包括：分别将活化后的菌株SQR9、RF-CU-1、RF-CU-2和RF-CU-3接种于LB液体培养基30-37℃150-170r min^-1培养18-26小时；离心、清洗获得菌体，用等量无菌超纯水重悬菌体；等量混合四种菌液调节OD₆₀₀至3-5，即为所述的植物促生复合菌剂。

5.权利要求1所述的植物促生复合菌剂在促进蔬菜生长中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的蔬菜为黄瓜。