CN113980855A - 一种复合微生物菌剂的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种复合微生物菌剂的构建方法；本方法利用合成生物学中基于约束的代谢模型重建方法，预测潜在互作关系，对各菌株的促生关系进行评价，划线对峙实验评价菌株间的拮抗关系，测定各菌株的碳源利用谱并对生态学测度进行计算，最后定量PCR检测菌群在植物根际条件各成员动态变化，同时验证促生效果，得到复合微生物菌剂。本发明得到的复合菌群在根际原位环境下结构稳定，有明显的促生效果。

Description

一种复合微生物菌剂的构建方法
技术领域
本发明涉及一种复合微生物菌剂的构建方法、该构建方法得到的复合微生物菌剂及其应用，属于合成生物学和生物肥料学领域。
背景技术
生物肥料在我国土壤培肥改良、作物提质增产、化肥减施增效和资源化循环利用等方面发挥了至关重要的作用；在国家绿色农业发展和乡村振兴计划等战略中，生物肥料的基础研究、应用创新和产业发展已成为新时期的重点发展目标。我国的生物肥料产业经过近20年的稳定快速发展，目前获得农业农村部登记的微生物肥料产品有9200余个，有效登记证8385个，其中微生物菌剂类产品4335个，生物有机肥2460个，复合微生物肥料1590个；使用的功能菌种已达到200余种，年产量超过3000万吨，应用面积超5亿亩以上，年产值能达400亿元以上；全国微生物肥料企业约有2800多家。
传统的单一菌种微生物肥料养分功能单一、田间效果不稳定，无法满足农业生产中多元素平衡供应、促进植物生长、拮抗土传病害等的综合需求。另一方面，随着微生物组和合成生物学技术的快速发展，基于合成微生物学的原理和技术构建结构稳定的多功能合成菌群微生物肥料既是科学发展的前沿也是产业更新换代的发展的方向。目前对于合成菌群的构建策略主要分为两种：在自然界中获取已经稳定的核心菌群，即从上到下(Top-Down)的策略；根据已有的知识，理性设计人工合成稳定菌群，即从下到上(Bottom-up)的策略。
传统微生物菌剂复配的从上到下(Top-Down)方法大多是从自然界中获取稳定的菌群，缺点是菌群内部成员大多未知，研究群落成员内部协同互作关系难度较大；传统的从下到上(Bottom-up)方法大多直接将各类功能的微生物简单配伍并最终验证复合菌剂的功能，在构建菌群时并未过多的体现理性设计原则，缺点是无法有效的整合现有技术方法，理性高效的设计复合菌剂。
本发明利用系统生物学中的基于约束的代谢建模方法，选择优异的肥效微生物菌种，结合从上到下的策略构建微生物之间可以协同增效、代谢互补的合成菌群微生物肥料，引领微生物肥料新产品开发方向。
发明内容
为了解决单一菌种微生物肥料功能单一、及田间效果不稳定以及从上到下(Bottom-up)方法效率低，无法体现理性设计原则等问题，本发明的第一个目的是提供一种复合微生物菌剂的构建方法；第二个目的是提供上述构建方法构建得到的复合微生物菌剂；第三个目的是提供上述复合微生物菌剂作为实际生产中微生物肥料的应用。本发明基于合成生物学领域的合成菌群学原理，应用约束代谢模型重建方法，构建了多功能、生态稳定的复合微生物菌剂，本发明的复合微生物菌剂在接入植物根际土壤之后群落内部成员能保持相对稳定的状态，并显著促进植物生长。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种复合微生物菌剂的构建方法，利用合成生物学中基于约束的代谢模型重建方法，预测潜在互作关系，对各菌株的促生关系进行评价，划线对峙实验评价菌株间的拮抗关系，测定各菌株的碳源利用谱并对生态学测度进行计算，最后定量PCR检测菌群在植物根际条件各成员动态变化，同时验证促生效果，得到复合微生物菌剂。
本发明还保护前文所述的构建方法构建得到的复合微生物菌剂。
所述的复合微生物菌剂中每株菌都进行了全基因组测序，并获取了基因组全图，利用合成生物学与系统生物学中的基于基因组约束代谢建模的技术对合成菌群中的每株菌进行代谢模型的构建，并预测菌群内部潜在的互作关系。
作为本申请的优选技术方案，所述复合微生物菌剂的活性成分选自纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans)(又称纤维化纤维微菌Cel_cel)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)(又称施氏假单胞菌Pse_stu)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)(又称荧光假单胞菌Pse_flu)、巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)(又称巴西固氮螺菌Azo_bra)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)(又称巨大芽孢杆菌Bac_meg)中的任意2种或2种以上。
其中，所述解淀粉芽孢杆菌为SQR9。
作为本申请的优选技术方案，所述复合微生物菌剂的活性成分选自1)-5)中任一种：
1)纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)；
2)纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)；
3)纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SQR9、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)；
4)纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SQR9、巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)；
5)纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SQR9、巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。
优选的，所述所述复合微生物菌剂的活性成分选自A)-C)中任一种：
A)纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)；
B)纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SQR9、巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)；
C)纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SQR9、巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。
作为本申请的优选技术方案，前文所述的菌四株购买于中国农业微生物菌种保藏管理中心，其中纤维化纤维微细菌Cel_cel编号为ACCC 01019、施氏假单胞菌Pse_stu编号为ACCC 06513、荧光假单胞菌Pse_flu编号为ACCC 10190、巨大芽孢杆菌Bac_meg编号为ACCC 10010；一株购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心，巴西固氮螺菌Azo_bra编号为CGMCC 1.10379；解淀粉芽孢杆菌SQR9的保藏编号为CGMCC No.5808。
可见所述的复合微生物菌剂中的菌种均购自/选自各微生物保藏中心，通过已有的研究表明均具有作为微生物肥料的潜力。
本发明的复合微生物菌剂形成的菌群具备多种促生及拮抗功能，纤维化纤维微细菌Cel_cel、巴西固氮螺菌Azo_bra、施氏假单胞菌Pse_stu具有固氮能力，解淀粉芽孢杆菌SQR9、施氏假单胞菌Pse_stu、巨大芽孢杆菌Bac_meg、荧光假单胞菌Pse_flu具有产IAA能力，纤维化纤维微细菌Cel_cel、施氏假单胞菌Pse_stu、解淀粉芽孢杆菌SQR9、荧光假单胞菌Pse_flu、巨大芽孢杆菌Bac_meg具有解磷能力，施氏假单胞菌Pse_stu、荧光假单胞菌Pse_flu有产嗜铁素能力，解淀粉芽孢杆菌SQR9、巨大芽孢杆菌Bac_meg有拮抗病原菌的能力。
本发明的复合微生物菌剂的各菌株之间具备代谢接力、代谢互养的特征，纤维化纤维微细菌Cel_cel的代谢产物能够显著的促进解淀粉芽孢杆菌SQR9、荧光假单胞菌Pse_flu的生长，施氏假单胞菌Pse_stu的代谢产物能显著的促进纤维化纤维微细菌Cel_cel、解淀粉芽孢杆菌SQR9的生长，荧光假单胞菌Pse_flu和巴西固氮螺菌Azo_bra的代谢产物可以促进纤维化纤维微细菌Cel_cel的生长。
所述复合微生物菌剂的内部成员之间均无明显的拮抗关系。
另外，荧光定量PCR数据显示在植物根际原位条件下所述复合微生物菌剂形成的微生物群落组成稳定。
作为本申请的优选技术方案，所述复合微生物菌剂的总有效活菌数为1×107～9×109cfu/g。
作为本申请的优选技术方案，所述复合微生物菌剂中的组合中每种微生物数量按照等比例混合。
本发明还保护前文所述的复合微生物菌剂作为生物肥料的应用。
优选的，前文所述复合微生物菌剂液体发酵后制成合成菌群生物菌剂施用于土壤。
本发明还保护前文所述的复合微生物菌剂在促进农作物生长的应用。
优选的，所述农作物为番茄、黄瓜等，更优选为番茄。
有益效果
本发明构建的成菌群微生物肥料接入土壤之后通过荧光定量PCR显示，在植物根际周围菌群成员相对稳定，利于微生物定殖于根际。
本发明利用系统生物学中的基于约束的代谢建模方法，选择优异的肥效微生物菌种，结合从上到下的策略构建微生物之间可以协同增效、代谢互补的合成菌群微生物肥料，克服了传统微生物菌剂复配的从上到下方法中菌群内部成员大多未知，无法针对具体农作物做适用性调整的问题；同时克服了传统的从下到上的方法将各类功能的微生物简单配伍、试验次数多、效率低不理性的问题。
本发明利用系统生物学中的基于约束的代谢建模方法，选择优异的肥效微生物菌种，结合从上到下的策略构建微生物之间可以协同增效、代谢互补的合成菌群微生物肥料，引领微生物肥料新产品开发方向。
附图说明
图1为除解淀粉芽孢杆菌SQR9外各菌株全基因组测序结果；
图2为各菌株的产嗜铁素能力；
图3为各菌株的解磷能力；
图4为各菌株的产IAA能力；
图5为各菌株之间平板对峙、拮抗效果；
图6各菌株对于常见根际碳源的利用谱；
图7为各菌株之间相互利用代谢产物的能力；
图8各复合菌群在植物根际原位条件下，各成员的动态变化情况；
图9两种复合菌群对于番茄的促生效果。
具体实施方法
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例共选用6株菌，其中4株购买于中国农业微生物菌种保藏管理中心，分别为：纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans)编号为ACCC 01019、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)编号为ACCC 06513、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)编号为ACCC 10190、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)编号为ACCC10010；1株购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心，巴西固氮螺菌(Azospirillumbrasilense)编号为CGMCC 1.10379；另1株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)SQR9的保藏编号为CGMCC No.5808。
实施例1：重建各菌株基因组规模的代谢模型
将实验中每株菌进行基因组测序，获取每株菌的完成图。通过自动化(ModelSEED)或者半自动化手段重建基因组草图；手动优化重建的基因组草图，确定并验证底物和辅酶，代谢物的分子式以及带电性，反应的化学计量系数和方向性，确定基因蛋白反应关联，添加代谢物标识符，添加自发反应、转运反应和交换反应、确定生物量组成；将重构的模型转化为数学模型，初始化COBRA Toolbox、加载重建模型到MATLAB中，验证化学计量矩阵S并设置目标函数和约束；对模型进行调试，检查模型质量平衡电荷平衡，对不平衡的反应进行更正，测试化学平衡循环，测试是否在标准培养基中产生生物质前体，检查是否能够产生已知的分泌物，检查反应是否受阻，测试生物的已知能力，测试模型是否可以正确预测生长率；生成模型。
结果与分析：
如图1所示，各菌株的全基因组圈图，经过基因组规模的代谢模型预测分析，各菌株能在根际提供的营养环境下生长，菌株间存在潜在的代谢互作。
实施例2：各菌株的嗜铁素产生能力
配制CAS蓝色检测液溶液，A：将60.5mg CAS溶于50mL去离子水，加入10mL FeCl3溶液(含1mM FeCl3·6H2O，10mM HCl)；溶液B：将72.9mg HDTMA(十六烷基三甲基溴化铵)溶于40mL去离子水；将溶液A沿烧杯壁缓缓注入到溶液B中，即得CAS蓝色检测液。
将菌株的培养液上清过膜除菌后，与CAS检测液等体积混合，充分反应，测OD630，得吸光值As，以双蒸水作为对照调零；未接种的培养基与CAS检测液等体积混合，测OD630，得吸光值Ar。
结果与分析：
As/Ar值代表样品中嗜铁素的相对含量，嗜铁素含量测定重复3次，As/Ar值越低，产嗜铁素能力越强；如图2所示，解淀粉芽孢杆菌SQR9、巨大芽孢杆菌Bac_meg、荧光假单胞菌Pse_flu三株菌产嗜铁素能力较强。
实施例3：各菌株解磷能力测定
按下面配方配制NBRIP培养基：葡萄糖10g，硫酸铵0.1g，氯化钾0.2g，磷酸钙5g，六水合氯化镁5g，七水合硫酸镁0.25g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0。
将各菌株在LB培养基中活化，将待测菌株接入磷酸盐液体养基(NBRIP)，不接菌为空白对照，28℃、170r min-1条件下振荡培养7d，钼锑抗比色法定量测定溶磷含量及对应pH值。
结果与分析：
如图3所示，荧光假单胞菌Pse_flu、巨大芽孢杆菌Bac_meg有较高的解磷能力。
实施例4：各菌株产IAA能力测定
配制Landy培养基，A：葡萄糖40蒸馏水定容至500mL，B：酵母粉1g，L-谷氨酸5g，L-苯丙氨酸2mg，L-色氨酸1g，氯化钾0.5g，磷酸二氢钾1g，七水合硫酸镁0.5g，四水合硫酸锰5mg，七水合硫酸铜0.16mg，七水合硫酸亚铁0.15mg，蒸馏水定容至500mL，调整pH＝7.0。将A、B分别灭菌后混合在一起。
待测菌株在Landy培养基中25℃、140r min-1条件下振荡培养72h，取培养液1mL，12000×g离心5min，取500μL上清液加入等体积的Salkowski试剂(Salkowski试剂的配方：10.8mol L-1硫酸含4.5g三氯化铁)，室温暗处显色30min后，于530nm处测光密度值，以空白培养基作对照，并以纯IAA对应的光密度作标准曲线，计算IAA的产出量。
结果与分析：
如图4所示，施氏假单胞菌Pse_stu、解淀粉芽孢杆菌SQR9、荧光假单胞菌Pse_flu、巨大芽孢杆菌Bac_meg产IAA的能力较强。
实施例5：菌株间拮抗关系评价
对每株菌进行平板对峙实验，将每株菌在LB平板上划线培养，置于30℃恒温培养箱中培养。待形成单菌落后，取无菌接种环挑取一种菌，在新的LB平板上V字划线，再用新的无菌接种环挑取另外一种菌，以相反的防线进行V字划线，在平板上形成两次交叉。六株菌共14个处理，将划好线的平板置于30℃恒温培养箱中培养，观察并记录平板对峙情况。
结果与分析：
如图5所示，在平板拮抗实验中表明，不同菌株在划线交汇处无明显菌落变淡的现象，证明菌株间无强烈的拮抗关系。
实施例6：菌株根际常见碳源利用谱的测定
物种除了通过接触产生直接拮抗，还可以通过资源竞争相互作用产生间接拮抗，为了排除菌株间因资源竞争导致可能的拮抗，对于根际碳源(糖类、有机酸、氨基酸)资源消耗模式进行表征，即细菌对植物根际常见碳源进行测定，获取微生物根际碳源利用谱，并利用生态学理论对每株菌的生态位宽度进行计算来表征微生物对于根际资源的开发利用度，同时比较菌株间的生态位相似比例和生态位重叠数来表征微生物在相同等级资源重叠状况。
利用表型芯片技术对每株菌的根际碳源利用谱进行测定，原理为PM系统在96孔PM板中固定不同的干化细胞培养基，当加入细胞悬液和显色物质并培养后，细胞表型就可以通过颜色变化表现出来，如果细胞发生呼吸代谢，那么显色剂就会从无色的氧化态还原为紫色的还原态，表型反应为阳性，如无颜色变化，则表型为阴性。
将菌株在LB平板上进行划线培养，30℃恒温培养箱中培养过夜。将12.5mL的Biolog IF-0a培养基(1.2倍浓度)移液到无菌加盖的试管中，并加入2.5mL水。将10mL的该溶液(现在浓度为1x)移至另一个无菌加盖的试管中。剩余的5mL应放在一侧，如有必要，可在后续调整细胞悬液的密度时用于样品稀释。用无菌棉签从30℃过夜培养的琼脂平板上移出几个菌落，然后转移到装有10mL IF-0a的试管中。轻轻地完全混合悬浮液。在Biolog浊度计中检查浊度，并进行调整浊度至42％，制备好的菌悬液待用。向IF-0a填加染料混合物，将15.25mL Biolog IF-0a培养基(1.2x浓度)移至无菌的30–50mL容器中，然后添加0.22mLBiolog染料混合物(100x)和2.83mL水。取3.7mL制备好的菌悬液添加到IF-0a加染料混合物中，轻柔地充分混合，制备1：5稀释的最终菌悬液，此时菌悬液的浊度应为85％。将最终菌悬液加入PM板中，每个空添加100μL。在Omnilog系统中30℃培养，每隔30分钟进行读数，生成最终的数据。
生态位宽度计算公式如下所示：
Figure BDA0003354548820000091
Nij：i利用资源j的数值；
生态位重叠计算公式如下所示：
Figure BDA0003354548820000092
Cih：生态位重叠指数；Nij：i在资源j中出现数值；Ni：i在所有资源中的数值
生态位相似度比例的计算：
Figure BDA0003354548820000093
Cih：i物种和h物种之间的比例相似性；Nij：i在资源j中出现数值；Ni：i在所有资源中的数值；Nhj：h在资源j中出现数值；Nh：h在所有资源中的数值
结果与分析：
如图6所示，各个菌株对于根际常见碳源的利用谱表明，各菌株对于根际碳源利用差异较大，纤维化纤维微细菌Cel_cel倾向利用根际碳源中的糖类，巴西固氮螺菌Azo_bra倾向利用根际碳源中的有机酸，施氏假单胞菌Pse_stu与荧光假单胞菌Pse_flu倾向于利用根际碳源中的有机酸和氨基酸。然后将每个微生物在资源水平上的生物量作为生态学基础数据，最终量化为不同生态位测度，据此进一步理性设计合成菌群。
如表1所示，巨大芽孢杆菌Bac_meg、荧光假单胞菌Pse_flu、解淀粉芽孢杆菌SQR9具有较高的生态位宽度，证明其可以利用的碳源种类比其他菌株多。
表1各菌株的生态位宽度
Figure BDA0003354548820000094
Figure BDA0003354548820000101
如表2与表3所示，纤维化纤维微细菌Cel_cel与施氏假单胞菌Pse_stu、解淀粉芽孢杆菌SQR9、荧光假单胞菌Pse_flu生态位重叠低，纤维化纤维微细菌Cel_cel、巴西固氮螺菌Azo_bra与其余的菌株生态位相似度较低。解淀粉芽孢杆菌SQR9、巨大芽孢杆菌Bac_meg与其他菌的生态位重叠高。这些生态位测度为合成菌群的设计提供了参考，在设计菌群的时候尽量选择合成菌群内部成员生态位重叠度低，并且合成菌群能较大范围的覆盖根际碳源。
表2各菌株生态位重叠指数
Figure BDA0003354548820000102
表3各菌株生态位相似性比例
Figure BDA0003354548820000103
实施例7：合成菌群内部成员代谢接力实验
为了探究菌株间代谢互养关系，通过菌株产生的代谢产物对其他菌的生物量的影响来表征菌株间代谢合作关系或是抑制关系。
人工复配根系分泌物培养基：葡萄糖0.36g、果糖0.36g、蔗糖0.72g、阿拉伯糖0.30g、木糖0.30g、麦芽糖0.72g、半乳糖0.36g；琥珀酸0.118g、苹果酸0.134g、酒石酸0.168g、乳酸0.090g、草酸0.126g、柠檬酸0.235g、丙二酸0.104g；谷氨酸0.0185g、天冬氨酸0.0168g、丙氨酸0.0112g、苏氨酸0.0150g、丝氨酸0.0132g、缬氨酸0.0147g、甘氨酸0.0094g、亮氨酸0.0195g、组氨酸0.0195g、赖氨酸0.0184g、精氨酸0.0219g、苯丙氨酸0.0208g；硝酸铵2.0g、磷酸氢二钾1.5g、磷酸二氢钾3.0g、七水硫酸镁0.1g、七水合硫酸亚铁0.2g、七水硫酸铜0.1g、无水氯化钙0.01g、乙二胺四乙酸二钠0.01g，超纯水定容至1000mL，调整pH＝7，采用过膜法灭菌。
利用人工复配的根系分泌物培养基进行代谢接力实验，首先平板划线活化菌株，形成单菌落后，挑取单菌落于3mL的LB液体培养基中，170rpm，30℃震荡培养过夜。吸取1mL菌液与无菌的离心管中，7500rpm离心4分钟，再用无菌水洗涤2遍重悬，获得供试菌株菌悬液。将每株菌调整到统一的浓度，按1％接种量接种，30℃，170rpm培养48h，得到含有菌株代谢物的第二代培养基，然后过膜除菌待用。将平板划线活化菌株，挑取单菌落于3mL的LB液体培养基中，170rpm，30℃震荡培养过夜。吸取1mL菌液与无菌的离心管中，7500rpm离心4分钟，再用无菌水洗涤2遍重悬，获得供试菌株菌悬液除菌的含有代谢物的培养基，分别在12h、24h、36h、48h取样测量OD值。
结果与分析：
物种间存在多种相互作用的类型，包括正向作用、负向作用、中性作用，了解微生物之间的相互作用有助于确定研究和操作群落相互作用网络的策略。微生物生态系统如何相互作用的定量理解，对于预测微生物网络以及帮助设计有特定功能的合成群落至关重要。
如图7所示，结果中可以看出纤维化纤维微细菌Cel_cel的代谢产物对解淀粉芽孢杆菌SQR9,荧光假单胞菌Pse_flu有促进作用；施氏假单胞菌Pse_stu的代谢产物对纤维化纤维微细菌Cel_cel,解淀粉芽孢杆菌SQR9有促进作用；解淀粉芽孢杆菌SQR9的代谢产物对其他菌株无明显促进作用；荧光假单胞菌Pse_flu的代谢产物对纤维化纤维微细菌Cel_cel有明显促进作用；巨大芽孢杆菌Bac_meg的代谢产物对解淀粉芽孢杆菌SQR9有明显促进作用；巴西固氮螺菌Azo_bra的代谢产物对解淀粉芽孢杆菌SQR9、纤维化纤维微细菌Cel_cel有促进作用。
综上，纤维化纤维微细菌Cel_cel与荧光假单胞菌Pse_flu在以人工复配的根系分泌物的培养基里面可能存在潜在的代谢互养；解淀粉芽孢杆菌SQR9可以利用大部分菌代谢；纤维化纤维微细菌Cel_cel可以利用施氏假单胞菌Pse_stu,荧光假单胞菌Pse_flu,巴西固氮螺菌Azo_bra的代谢产物。
实施例8：植物促生实验及根际原位菌群内部动态变化
取大约60℃温水，对番茄种子进行浸种，大概4～6h，在超净台中，使用75％的乙醇对种子进行杀菌，约1min，无菌水洗3次；再用2％的次氯酸钠对种子表面进行消毒6min，洗去种子外面的杂质；最后，使用无菌水洗5次，洗净种子待用；将无菌滤纸放入无菌培养皿中，用无菌注射器加2mL无菌水润湿，注意不要有水流浸出，之后将种子均匀的摆在滤纸上，30℃左右培养至出芽，准备灭过菌的1×MS固体培养基，种子于无菌的培养基中，根朝下，每个小组培瓶中种4-5颗苗，待幼苗长到7-10cm转移到装有无菌的1/4MS液体培养基的三角瓶里，温室内培养。
将土壤进行辐照灭菌，然后进行菌液拌土(菌液培养条件同实施例7，无菌水进行重悬，菌群组合中每种微生物数量按照等比例混合后与无菌土拌匀，菌种的终浓度为107cfu/g土)并转移至无菌的组培瓶中，取涨势一致的幼苗进行移栽，最后用封口膜封住瓶口。每个处理6个生物学重复。将实验材料置于温室培养(光照24℃，16h；黑暗18℃，8h)用无菌移液枪头与移栽后的第0、4、8、12、16、20天取样，土壤充分混匀后，转移0.5-1.0g土壤到2mL离心管中，-80℃保存。所有土壤样品DNA提取均使用
Figure BDA0003354548820000121
DNA提取试剂盒(MoBioLaboratories,Inc.,Carlsbad,CA,USA)，使用Vazyme chamQ SYBR color qPCR MasterMIX进行定量PCR，定量菌群内部的成员的绝对含量。
根据代谢模型构建结果、促生功能特点、各生态位测度、以及代谢接力实验结果，选取五个组合进行根际原位菌群内部动态变化实验：组合纤维化纤维微细菌Cel_cel、荧光假单胞菌Pse_flu、巴西固氮螺菌Azo_bra，菌群缩写为EJK；组合纤维化纤维微细菌Cel_cel、施氏假单胞菌Pse_stu、巨大芽孢杆菌Bac_meg，菌群缩写为EGL；组合纤维化纤维微细菌Cel_cel、解淀粉芽孢杆菌SQR9、荧光假单胞菌Pse_flu、巴西固氮螺菌Azo_bra，菌群缩写为EIJK；组合纤维化纤维微细菌Cel_cel、斯氏假单胞菌Pse_stu、解淀粉芽孢杆菌SQR9、巴西固氮螺菌Azo_bra，菌群缩写为EGIK；组合纤维化纤维微细菌Cel_cel、斯氏假单胞菌Pse_stu、解淀粉芽孢杆菌SQR9、巴西固氮螺菌Azo_bra、巨大芽孢杆菌Bac_meg，菌群缩写为EGIKL。
菌株特异性引物的设计：
首先获取目标微生物的全基因组序列和带有基因注释的文件，组装拼接所有菌的基因注释文件，组成一个文件，在本地blast上进行比对，先进行makeblastdb本地建库，建立一个本地的数据库。进行比对，库文件本身作为查询文件与数据库进行对比，并将结果输出。找到差异基因，将输出的CSV文件进行分析，将与自身相似度100％且与其他基因相似度为0％的基因找到，整理到一个文件中，作为引物设计备选基因。将备选基因从库文件中抽离出来，进行引物设计。将设计好的forward primer导出并处理，使文件变成blast可以识别的fasta文件。以所有菌的全基因组makeblastdb建库，将这个带有forward primer的文件作为query sequence与数据库进行比对，找到特异的引物。最后在线Blast或者snapgene验证引物，检查目的片段特异性。合成引物并进行验证。
将验证正确的引物，以对应的DNA作为模板进行PCR扩增，将得到的片段进行回收。然后使用Takarap MDTM19-T Vector Cloning Kit进行TA克隆，将酶连产物与大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态混合冰浴30min，42℃热激90s，立即冰浴2min，转接800μLLB液体培养基中，于37℃，100r min-1条件下复苏1h后涂布于Amp-X-Gal-IPTG平板中(100ml固体LB)培养基中加入100mg mL-1Amp 100μL，20mg mL-1X-Gal 200μL，24mg mL-1IPTG 100μL)，37℃培养16h后挑取白斑，用Vazyme FastPure Plasmid Mini Kit质粒提取试剂盒提取质粒，经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，将大小正确的质粒送至生工公司测序以保证融合片段序列的正确性。将质粒稀释至不同的梯度，用来获取绝对定量PCR的标准曲线。
结果与分析：
菌株特异性引物序列：纤维化纤维微细菌Cel_cel(F:ACTCAACGACTCCA TCTACAA；R:GTTGATGTAGAGCCAGATGTC)，施氏假单胞菌Pse_stu(F:CA GAACACCTACAAAACACTCG；R:GTTCTTCAGCCGGTACTTGT)，解淀粉芽孢杆菌SQR9(F:GGAATACTGGCAGGAATGG；R:GTCCGTATGATTGAGAGG TT)荧光假单胞菌Pse_flu(F:GTTGTTCAATGAGGAAGTGT；R:AGCAAGGTGTAGTTGTCAA)巴西固氮螺菌Azo_bra(F:TTCTCCAGCTACATGATTCAG；R:GTAATAGACGCCTTCCTTCTC)巨大芽孢杆菌Bac_meg(F:GGTCGGGTAC AGTATTCTGATT；R:TAGTCATACGCATAGCCATACC)。
如图8所示，组合纤维化纤维微细菌Cel_cel、施氏假单胞菌Pse_stu、巨大芽孢杆菌Bac_meg；纤维化纤维微细菌Cel_cel、施氏假单胞菌Pse_stu、解淀粉芽孢杆菌SQR9、巴西固氮螺菌Azo_bra；纤维化纤维微细菌Cel_cel、施氏假单胞菌Pse_stu、解淀粉芽孢杆菌SQR9、巴西固氮螺菌Azo_bra、巨大芽孢杆菌Bac_meg的组合能在番茄植物根际为期20天的实验中较稳定的共存。
图9为各复合菌剂对比单菌处理番茄的促生效果。各处理缩写如下：不接菌空白对照缩写为ck；斯氏假单胞菌Pse_stu缩写为G；解淀粉芽孢杆菌SQR9缩写为I；巴西固氮螺菌Azo_bra缩写为K；组合纤维化纤维微细菌Cel_cel、施氏假单胞菌Pse_stu、巨大芽孢杆菌Bac_meg，菌群缩写为EGL；组合纤维化纤维微细菌Cel_cel、解淀粉芽孢杆菌SQR9、荧光假单胞菌Pse_flu、巴西固氮螺菌Azo_bra，菌群缩写为EIJK；组合纤维化纤维微细菌Cel_cel、斯氏假单胞菌Pse_stu、解淀粉芽孢杆菌SQR9、巴西固氮螺菌Azo_bra、巨大芽孢杆菌Bac_meg，菌群缩写为EGIKL。如图所示，组合EGIKL和EIJK能够显著的促进番茄的生长。各处理的促生指标如表4所示。
表4复合微生物菌剂的促生效果
Figure BDA0003354548820000151
本申请的构建方法，仅需要5个组合，即可筛选出合适的微生物菌剂，如采用自下而上的方法，也是具体实施方式部分的6种菌株，则需要通过30组以上的实验，才能得到本申请的复合微生物菌剂，试验次数多、效率低，违背了理性设计原则；同时相较传统的自上而下的方法，本申请的菌株已知，对于群落成员内部协同互作关系也更加明晰。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。

Claims (10)

1.一种复合微生物菌剂的构建方法，其特征在于，利用合成生物学中基于约束的代谢模型重建方法，预测潜在互作关系，对各菌株的促生关系进行评价，划线对峙实验评价菌株间的拮抗关系，测定各菌株的碳源利用谱并对生态学测度进行计算，最后定量PCR检测菌群在植物根际条件各成员动态变化，同时验证促生效果，得到复合微生物菌剂。
2.权利要求1所述的构建方法构建得到的复合微生物菌剂。
3.根据权利要求2所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂的活性成分选自纤维化纤维微细菌（Cellulosimicrobium cellulans）、施氏假单胞菌（Pseudomonasstutzeri）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、荧光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens）、巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）、巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium）中的任意2种或2种以上。
4.根据权利要求2或3所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂的活性成分选自1）-5）中任一种：
1）纤维化纤维微细菌（Cellulosimicrobium cellulans）、荧光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens）、巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）；
2）纤维化纤维微细菌（Cellulosimicrobium cellulans）、施氏假单胞菌（Pseudomonasstutzeri）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）；
3）纤维化纤维微细菌（Cellulosimicrobium cellulans）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）SQR9、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）；
4）纤维化纤维微细菌（Cellulosimicrobium cellulans）、施氏假单胞菌（Pseudomonasstutzeri）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）SQR9、巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）；
5）纤维化纤维微细菌（Cellulosimicrobium cellulans）、施氏假单胞菌（Pseudomonasstutzeri）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）SQR9、巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）。
5.根据权利要求3所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述纤维化纤维微细菌（Cellulosimicrobium cellulans）购买编号为ACCC 01019、施氏假单胞菌（Pseudomonasstutzeri）购买编号为ACCC 06513、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）购买编号为ACCC 10190、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）购买编号为ACCC 10010；巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）购买编号为CGMCC 1.10379；解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）保藏编号为CGMCC No.5808。
6.根据权利要求3所述的复合微生物菌剂，其特征在于，其总有效活菌数为1×107~9×109cfu/g。
7.根据权利要求3所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂中的菌等比例混合。
8.权利要求2-7任一所述的复合微生物菌剂作为生物肥料的应用。
9.权利要求2-7中所述的复合微生物菌剂在促进农作物生长中的应用。
10.根据权利要求9的应用，其特征在于，所述农作物为番茄。
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