CN113337421A

CN113337421A - 一种复合微生物菌剂及其应用

Info

Publication number: CN113337421A
Application number: CN202110494439.4A
Authority: CN
Inventors: 沈家葆; 李华一
Original assignee: Guangdong Lihao Biological Agriculture Co ltd
Current assignee: Guangdong Lihao Biological Agriculture Co ltd
Priority date: 2021-05-06
Filing date: 2021-05-06
Publication date: 2021-09-03

Abstract

本发明属于微生物领域，具体涉及一种复合微生物菌剂及其应用，本发明提供的复合微生物菌剂，以菌种发酵液的重量分数计，包括：固氮菌10wt％～60wt％、促生根瘤菌10wt％～50wt％、嗜氢菌15wt％～35wt％和兼性菌15wt％～65wt％；微生物菌剂中固氮菌、促生根瘤菌、嗜氢菌、兼性菌的含量均不低于1×10⁶CFU/mL。按照本发明提供的微生物种类及其配比制得的微生物菌剂，能够在土壤中长期定殖，具有丰富土壤微生物种类，并促进作为生长，长期施用本发明微生物菌剂具有“改善土壤菌群‑增加土壤肥力‑降低施肥量”的良性循环。

Description

一种复合微生物菌剂及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种复合微生物菌剂及其应用。

背景技术

随着农业产品越来越高的需求及耕地面积减少，农田复种指数以及化肥施用量也随之连年升高，这导致土壤退化的速度远高于对土壤保养及修复的速度。具体表现在土壤吸水保水能力变低、土壤过营养化，化肥利用率降低、土壤团聚结构被破坏、土壤pH失控、土壤固氮能力低下、土传病害发生风险加重。在微生物层面上则表现为：土壤土著菌群多样性大幅降低、处于生产者生态位的有益菌群活性抑制、处于分解者生态位的有益菌群消失、固氮菌活性抑制、抗逆菌群多样性大幅减少。随之而来对作物的影响表现为：作物固氮能力严重缺乏、作物吸收磷肥缓慢、更加依赖化肥；作物抗逆性表现不足，根系萎缩、叶片萎蔫、叶片叶绿素含量降低；作物生长调控出现问题，如过早生殖生长、生长周期延长。而微生物菌剂是一类含有活体微生物的特定制品，其主要功能在于通过微生物的生命活动及其代谢产物帮助作物生长。因此，研发强有力的微生物制剂，是土壤改良及促进作物生长的一个重要途径。

目前国内市场上出售的约7900种微生物菌剂为解决现有的土壤问题贡献的智慧不可磨灭，但是依旧存在如下问题。

(1)现有微生物菌剂难以同植物建立稳定的互作关系进而促进作物生长。

现如今在农业部登记的菌种，在菌种类别上来说，70％都属于芽孢杆菌；在菌种多样性上来说，85％以上都是单一菌种。芽孢杆菌属是革兰氏阳性菌的一种，由于其对外界有害因子抵抗力强，分布广，所以研究广泛，枯草芽孢杆菌更是研究的热点。但现有研究表明，革兰氏阳性菌难以同植物建立稳定的互作关系，以芽孢杆菌为主要活性菌的微生物菌剂很容易受到大田环境如干旱、盐渍、水涝、温度变化、植物根系分泌物等的影响进而不被植物选择，发挥不了全部功效甚至不发挥作用。

革兰氏阳性菌往往缺乏与植物紧密的互作关系，在植物微生态环境中往往生长不受植物保护也不受植物限制。即使有效定殖在植物根圈环境或植物内环境中也会威胁微生态中的菌群平衡。例如巨大芽孢杆菌，有研究证实在缺乏短小芽孢杆菌定殖的植株在接种巨大芽孢杆菌后会很快产生一系列的问题，其原因是巨大芽孢杆菌由于其繁殖能力过快，对养分的竞争使得植物微生态中其它菌的生存空间被挤压殆尽，造成根圈环境中的土著微生物被挤出生态位，进而随时间推移而消失，导致植物缺乏有益菌保护，降低了植物吸收养料和抗逆的能力。

在作物营养生长过程中，根际吸收能力决定地上部分的干重、可溶性淀粉占比，现有的微生物菌剂往往缺乏对作物根际吸收能力的促进。另外，在大田种植中，往往面临着各种各样的逆境挑战，例如大风、干旱、强降水，现有微生物菌剂大多只有单一功能，缺乏在结构上对作物的改良。此外，在作物生长的各个阶段，都会受到各类病虫害的影响。现有的微生物菌剂往往不能解决问题，或是只能降低某一种或某一类病害的影响。

(2)现有微生物菌剂难以在土壤中长期定殖进而发挥药效。

现有微生物菌剂在面对连年施用化肥造成的土壤退化、土壤板结、土壤沙质化、土壤盐渍化时，效果甚微，究其原因是在于其对于土壤土著菌群的不够重视。以单一菌株为主要活性菌的微生物菌剂施用入大田中，势必会遭到土壤原有的土著菌群抵触，环境的更替让本就处于适应期的单一菌株参加到与土著菌群的养分竞争中，可以稳定在大田土壤中繁殖且发挥作用的单一菌株少之又少。定殖在根际环境且稳定存在是菌株产生其应有的效果的前提，单一菌株难以融入大田根圈环境微生态进而发挥有效功效。而易融入大田根圈微生态的菌株往往依赖于其他菌或植物才能繁衍，它们的存活、培养、扩繁又成为一个难题，这导致这类菌株难以被生产和研究，进而没有相对应的产品。

(3)现有的微生物菌剂难以对土壤中过量肥力进行降解利用以及对源于农药的有毒物进行降解。

传统的种植技术往往依赖大量的化肥，但大量的化肥施用进田地中势必造成肥料利用率的降低，无机肥矿质化、被螯合，有机肥降解缓，造成“增加施肥量——破坏土著菌群——降低土壤肥力——增加施肥量”的恶性循环。现有的微生物菌剂对田间潜在的肥力缺乏有效利用措施，难以改善上述恶性循环。

另外，为避免作物遭受病虫害的侵袭，大量施用农药，造成农药中的有毒化合物如拟除虫菊酯类、有机磷农药、二甲戊灵、氨基甲酸酯等在土壤中不断富集，而现有的微生物菌剂无法对上述有毒化合物进行降解，以降低土壤或作物毒素含量。

总之，现有农业微生物菌剂多以革兰氏阳性菌为主，在根圈环境中难以定殖和发挥效用，而少量以革兰氏阴性菌为主的微生物菌剂产品又因为其菌种单一、自身生活力低下、对大田多样性的适应不足，难以生产、稳定保存同时难以在大田中定殖和发挥作用，另外，面对土壤中肥料利用率低、农药毒素积累，现有的微生物菌剂难以同时实现在土壤中长期定殖发挥药效，同时又能够对过量的肥力进行有效利用，并对土壤中的毒素进行降解。

发明内容

本发明旨在提供一种对土壤具有极好改良效果的复合微生物菌剂及其应用，该菌剂中微生物能够在土壤中长期定殖，丰富土壤微生物种类，并促进作物生长，实现“改善土壤菌群-增加土壤肥力-减少施肥量”的良性循环。

基于上述目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供一种复合微生物菌剂，以菌种发酵液的重量分数计，该微生物菌剂包括：固氮菌10wt％～60wt％、促生根瘤菌10wt％～50wt％、嗜氢菌15wt％～35wt％和兼性菌15wt％～65wt％；所述微生物菌剂中固氮菌、促生根瘤菌、嗜氢菌、兼性菌的含量均不低于1×10⁶CFU/mL。

按照上述配比的固氮菌、促生根瘤菌、嗜氢菌和兼性菌组成的微生物菌剂，其中，固氮菌占据含氮化合物生产者的地位，促生根瘤菌可以加强植物与细菌合作，促进植物根瘤的生长，进而加速植物根部对氮素的吸收；嗜氢菌占据含碳化合物生产者的地位，同时调控植物吸收有机化合物的过程；兼性菌通过灵活改变自己的生活方式和代谢通路，调控菌与菌之间的生态平衡及稳定，同时可以通过调控菌与菌的关系进而控制土壤中大量元素与微量元素的平衡，还可以通过产生一系列微生物蛋白，进而调控土壤与土壤中微生物的关系；故而本发明提供的上述四种微生物之间具有良好的互作关系，菌剂内部形成生态链，对不同的大田生态环境适应能力更强，更易在土壤中长期定殖。

本发明提供的固氮菌、促生根瘤菌、嗜氢菌和兼性菌从土壤中分离得到，并且四种微生物之间良好的互作，具有生理活性灵活、代谢通路多样，对土著菌群非但没有压制作用，由于其在固氮的过程中产生大量氢气，对根圈环境中原有的一些嗜氢菌还有促进作用，因此，施用到缺乏该类菌的土壤中可以有效恢复土壤微生物菌群的多样性。

本发明提供的微生物菌剂中微生物拥有解磷、解硫、氧化胺等一系列改善无机肥的能力，同时拥有降解长链芳香烃、苯环、含碳杂环等一系列改善有机肥的能力，增强降解后的无机肥和有机肥的水溶性，提高被植物吸收利用率。同时，本文所述微生物组可以通过分泌带有大量粘性末端的高分子化合物，来保持水土、减少毛细效应，提高土壤保水能力。因此，施用本发明微生物菌剂能够将“增加施肥量-破坏土著菌群-降低土壤肥力-增加施肥量”的恶性循环改变为“施用本文所述微生物菌剂-改善土壤菌群-增加土壤肥力-减少施肥量”的良性循环。

本发明提供的微生物菌剂可以通过分泌植物激素调控植物生长，进而有效促进作物根的生长，促进毛根形成，增强根尖成熟区的吸收能力；能够增强作物地表处茎节的结构强度，使作物不易倒伏；改善作物蜡质层厚度，让作物更耐干旱；改善植物地上部分如木质部、气生根的透气性，让作物不易受水涝影响；还可以调控作物地上部分蜡质层生长，对风媒病害也有一定的抑制作用。

本发明提供的微生物菌剂能够对农田生态环境中含有的有毒化合物、无机肥矿质化产生的矿质结晶、土壤中的作物残体进行降解；进而调控土壤毒性、无机物、有机物占比，达到综合改善农田生态环境的效果。

进一步地，以菌种发酵液的重量分数计，微生物菌剂包括：固氮菌30wt％、促生根瘤菌10wt％、嗜氢菌35wt％和兼性菌25wt％；所述微生物菌剂中固氮菌、促生根瘤菌、嗜氢菌、兼性菌的含量均不低于1×10⁶CFU/mL。

经试验发现，当固氮菌、促生根瘤菌、嗜氢菌和兼性菌按照上述配比形成的微生物菌剂具有更为优的土壤改良效果。

进一步地，固氮菌为嗜水红树小杆菌(Mangrovibacterium marinum)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、好斗趋磁螺菌(Magnetospirillum bellicus)、圆柱类鱼腥藻(Anabaena cylindrica)、巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)、蜜糖草固氮螺菌(Azospirillum melinis)、伊拉克固氮螺菌(Azospirillum irakense)、鲁戈苏固氮螺菌(Azospirillum rugosum)、稻固氮螺菌(Azospira oryzae)、脂铁螺旋菌(Azospirillum lipoferum)、棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、浸麻芽孢杆菌(Bacillus macerans)中的至少一种。

进一步地，促生根瘤菌为豆科根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)、氧化胺黄色杆菌(Xanthobacter aminoxidans)、动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、假红农杆菌(Agrobacterium Pseudorhodobacter)中的至少一种。

进一步地，嗜氢菌为普通脱硫弧菌(Desulfovibrio vulgaris)、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)、非典型氢嗜孢菌(Hydrogenophaga atypica)、帕氏氢嗜孢菌(Hydrogenophaga palleronii)、黄色氢嗜孢菌(Hydrogenophaga flava)中的至少一种。

进一步地，兼性菌为门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)、籼假单胞菌(Pseudomonas indica)、瓦登斯假单胞菌(Pseudomonas wadenswilerensis)、里沃利黄杆菌(Flavobacterium rivuli)、稻黄杆菌(Flavobacterium oryzae)、伯卡利新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium pokkalii)、黄色短波单胞菌(Brevundimonas aurantiaca)中的至少一种。

进一步地，固氮菌为巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)，促生根瘤菌为动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)，嗜氢菌为非典型氢嗜孢菌(Hydrogenophagaatypica)，兼性菌为稻黄杆菌(Flavobacterium oryzae)。

进一步地，微生物菌剂还包括放线菌或真菌或革兰氏阳性菌或有机肥或无机肥。

本发明微生物菌剂中的四种微生物具有良好的互作关系，形成内部生态链，具有极强的土壤定殖能力，与放线菌、真菌或革兰氏阳性菌等组合，能够增强放线菌、真菌或革兰氏阳性菌在土壤中定殖能力，进而发挥其药效。

进一步地，根际放线菌为链霉菌属(Streptomyces sp)或小单孢菌属(Micromonospora sp)或诺卡氏菌属(Nocardia sp)；所述真菌为黏帚霉属(Gliocladiumsp)或青霉属(Penicillium sp)或曲霉属(Aspergillus sp)或腐霉属(Pythium sp)或木霉属(Trichoderma sp)。

第二方面，本发明提供上述复合微生物菌剂在土壤改良中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

(1)按照本发明配比的固氮菌、促生根瘤菌、嗜氢菌和兼性菌组成的微生物菌剂，四种微生物之间具有良好的互作关系，菌剂内部形成生态链，对不同的大田生态环境适应能力更强，更易在土壤中长期定殖。

(2)本发明提供的微生物菌剂具有生理活性灵活、代谢通路多样，对土壤中的土著菌群非但没有压制作用，还能够促进土壤微生物的生长，能够恢复土壤微生物菌群多样性。

(3)本发明微生物菌剂能够将土壤中的有机、无机肥进行降解，提高土壤氮含量，便于植物吸收利用，同时能够分泌带有大量粘性末端的高分子化合物，来保持水土、减少毛细效应，提高土壤保水能力，因此，施用本发明微生物菌剂能够具有“施用本文所述微生物菌剂-改善土壤菌群-增加土壤肥力-减少施肥量”的良性循环。

综上所述，本发明微生物菌剂能够在土壤中长期定殖，具有丰富土壤微生物种类，并促进作为生长，长期施用本发明微生物菌剂具有改善土壤菌群-增加土壤肥力-降低施肥量的良性循环。

附图说明

图1为实施例2中巴西固氮螺菌镜检图；

图2为实施例2中动胶菌样申氏菌镜检图；

图3为实施例2中非典型氢嗜孢菌镜检图；

图4为实施例2中稻黄杆菌镜检图；

图5为巴西固氮螺菌的平板菌落图；

图6为非典型氢嗜孢菌的平板菌落图；

图7为动胶菌样申氏菌的平板菌落图；

图8为稻黄杆菌的平板菌落图；

图9为实施例2中混合培养镜检图；

图10为实施例2中混合培养镜检图；

图11为实施例3实验组玉组织切片图；

图12为实施例3对照组玉米茎组织切片图；

图13为实施例3中在气候箱中对照组和实验组鲁寿花生种植14天的植株样本图；

图14为在自然条件下实验组鲁寿花生种植14天的植株样本图；

图15为在自然条件下对照组鲁寿花生种植14天的植株样本图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例提供一种复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：

1、复合微生物菌剂中四种微生物的单菌株培养

将从商业渠道获得的固氮菌菌样、嗜氢菌菌样、促生根瘤菌菌样、兼性菌菌样分别置于0.3mL相应发酵液中，获得复苏菌样悬浮液，将复苏后的菌样悬浮液作为种子液加入相应菌种的发酵液中，按照每100mL发酵液加入0.3mL种子液的比例进行接种，随后置于恒温振荡培养箱中培养，于26～30℃、150～200rpm/min条件下，发酵24～48h，分别得到固氮菌培养液、嗜氢菌培养液、促生根瘤菌培养液和兼性菌培养液。

其中，用于培养固氮菌的发酵液的配方为：酵母提取物0.5g、甘露醇20.0g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钾0.8g、七水硫酸镁0.2g、硫酸钙0.1g、氯化铁0.0005g、钼酸钠0.0005g、蒸馏水1L，发酵液pH＝7.2。

固氮菌为嗜水红树小杆菌(Mangrovibacterium marinum)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、好斗趋磁螺菌(Magnetospirillum bellicus)、圆柱类鱼腥藻(Anabaena cylindrica)、巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)、蜜糖草固氮螺菌(Azospirillum melinis)、伊拉克固氮螺菌(Azospirillum irakense)、鲁戈苏固氮螺菌(Azospirillum rugosum)、稻固氮螺菌(Azospira oryzae)、脂铁螺旋菌(Azospirillum lipoferum)、棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、浸麻芽孢杆菌(Bacillus macerans)中的至少一种。

用于培养嗜氢菌的发酵液的配方为：蛋白胨10.0g、牛肉浸取物3.0g、氯化钠5.0g、蒸馏水1L，发酵液pH＝7.0。

嗜氢菌为普通脱硫弧菌(Desulfovibrio vulgaris)、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)、非典型氢嗜孢菌(Hydrogenophaga atypica)、帕氏氢嗜孢菌(Hydrogenophaga palleronii)、黄色氢嗜孢菌(Hydrogenophaga flava)中的至少一种。

用于培养促生根瘤菌的培养液的配方为：蛋白胨10.0g、牛肉浸取物3.0g、氯化钠5.0g、蒸馏水1L，发酵液pH＝7.0。

促生根瘤菌为豆科根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)、苜蓿根瘤菌(Rhizobiummeliloti)、氧化胺黄色杆菌(Xanthobacter aminoxidans)、动胶菌样申氏菌(Shinellazoogloeoides)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、假红农杆菌(AgrobacteriumPseudorhodobacter)中的至少一种。

用于培养兼性菌的培养液的配方为：蔗糖15.0g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钾0.8g、七水硫酸镁0.2g、氯化钠0.2g、氯化钙0.05g、硫酸亚铁0.025g，硫酸锰0.0005g、钨酸钠0.0005g、钼酸钠取微量0.0005g、蒸馏水1L。

兼性菌为门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)、籼假单胞菌(Pseudomonasindica)、瓦登斯假单胞菌(Pseudomonas wadenswilerensis)、里沃利黄杆菌(Flavobacterium rivuli)、稻黄杆菌(Flavobacterium oryzae)、伯卡利新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium pokkalii)、黄色短波单胞菌(Brevundimonas aurantiaca)中的至少一种。

2、四种微生物的共培养

将步骤1获得的四种单菌株培养液按照固氮菌30wt％、促生根瘤菌10wt％、嗜氢菌35wt％和兼性菌25wt％的比例复配作为种子液，按照每100mL培养基加1mL种子液总重的比例，将种子液接种于改良BPY培养基中，置于恒温培养箱中发酵，于28℃、150～200rpm/min发酵条件下发酵24～48h，制得混合发酵液，即本发明复合微生物菌剂。

实施例2

本实施例提供一种复合微生物菌剂的制备方法，与实施例1的区别仅在于，本实施例菌剂中微生物的种类具体如下：固氮菌为巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)，促生根瘤菌为动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)，嗜氢菌为非典型氢嗜孢菌(Hydrogenophaga atypica)，兼性菌为稻黄杆菌(Flavobacterium oryzae)。

其中，在“步骤1、复合微生物菌剂中四种微生物的单菌株培养”中分别得到巴西固氮螺菌培养液、动胶菌样申氏菌培养液、非典型氢嗜孢菌培养液、稻黄杆菌培养液，分别取0.3mL上述四种培养液滴在载玻片上，在干燥箱中干燥后用油镜观察，巴西固氮螺菌、动胶菌样申氏菌、非典型氢嗜孢菌、稻黄杆菌的镜检图分别如图1～4所示，上述四种培养液中相应的活性菌的数量均不低于1×10⁸CFU/mL。巴西固氮螺菌的平板菌落如图5所示，非典型氢嗜孢菌的平板菌落如图6所示，动胶菌样申氏菌的平板菌落如图7所示，稻黄杆菌的平板菌落如图8所示。

在“步骤2、四种微生物的共培养”中对制得的混合发酵液进行镜检，如图9和图10所示，混合发酵液中总活菌菌体浓度不低于1×10⁹CFU/mL，单株菌浓度不低于1×10⁶CFU/mL。

对由巴西固氮螺菌、动胶菌样申氏菌、非典型氢嗜孢菌、稻黄杆菌制得的复合微生物菌剂的性能从如下三个方面进行检测，具体如下。

1、复合微生物菌剂固氮能力检测

以乙炔还原法分别测定微生物组及其组分的固氮能力。具体实施步骤为：将巴西固氮螺菌培养液、动胶菌样申氏菌培养液、稻黄杆菌培养液以及四种菌株的混合发酵液分别与LB琼脂混合制成斜面培养基，同时以等量的无菌清水作为对照，取5mL斜面培养基加入规格为15mm*150mm的试管中，以软橡胶塞封口培养，静置24h待长出菌苔后，抽出5mL空气，注射5mL乙炔，培养48h后吸取100μL试管内气体，用气相色谱仪测乙烯生成量，以每小时每mg的菌液产生乙炔的nmol量以评价各个菌株或混合菌株的固氮能力，乙烯生成量越高，表明微生物菌剂的固氮能力越强。

试验结果如表1所示，可以看出，相对于巴西固氮螺菌、动胶菌样申氏菌和稻黄杆菌，复合微生物菌剂的乙烯生成量最高，表明，相对于单一菌株，复合微生物菌剂具有更为优异的固氮能力。

表1不同微生物种类的固氮能力均值

微生物种类	固氮能力均值(nmolC<sub>2</sub>H<sub>4</sub>*mg<sup>-1</sup>h<sup>-1</sup>)
		实施例2制得的复合微生物菌剂	9486
巴西固氮螺菌	3021
		动胶菌样申氏菌	2308
稻黄杆菌	1378
		清水对照	0

2、复合微生物菌剂的产氢能力测定

将非典型氢嗜孢菌培养液以及四种菌株的混合发酵液分别与LB琼脂混合制成斜面培养基，同时以等量的无菌清水作为对照，取5mL斜面培养基加入规格为15mm*150mm的试管中，以软橡胶塞封口培养，静置24h待长出菌苔后，抽取5mL气体，加入5mL氢气，培养48h后抽取100μL试管内气体，用气相色谱仪测量氢气消耗量(即氢气吸收率)。

试验结果如表2所示，表中负值表示H₂的产生率，由表2的结果可知，非典型氢嗜孢菌具有较高的H₂吸收能力，表明非典型氢嗜孢菌在进行生物活动过程中对H₂具有较高的需求，而对复合微生物菌剂的检测结果发现，复合物微生物菌剂产生了H₂，抵消了非典型氢嗜孢菌对H₂的吸收，表明复合微生物菌剂中非典型氢嗜孢菌与其它菌株具有良好的互作关系。

表2不同微生物对H₂的吸收率

微生物种类	H<sub>2</sub>吸收率(％)
		实施例2制得的复合微生物菌剂	-3.48
非典型氢嗜孢菌	42

3、复合微生物菌剂的溶血反应

将复合微生物菌剂接种于血琼脂平板上，于37℃培养24h，观察发现无溶血圈产生，表明本发明复合微生物菌剂可用于制作农用微生物菌剂。

试验中血琼脂平板配方为：蛋白胨10g、牛肉浸出粉10g、氯化钠5g、琼脂15g、蒸馏水1L。

将上述配方原料混合后经高压灭菌冷却到60℃，加入无菌脱纤维绵羊血60mL，旋转充分倒平板。血琼脂层厚度5mm，血琼脂平板的pH＝7.5。

实施例3

本实施例用于探究实施例2制得的复合微生物菌剂对植物的影响，具体通过复合微生物菌剂在花生根际环境定殖情况、复合微生物菌剂对玉米组织发育及可溶性糖含量的影响、复合微生物菌剂对大豆籽蛋白含量的影响、复合微生物菌剂对花生生长的影响这五个方面进行实验分析，具体实验方法及实验结果如下。

1、复合微生物菌剂中的微生物在植物根际环境中定殖实验

在培养箱中盆栽作物，盆栽用土为腐殖土，来源于吉林省长白山。实验用培养钵为21cm*21cm，土壤理化性质为：干态下的平均粒径为223μm，湿态粒径为66.5μm，颗粒体积为4.64*10⁵cm³，干腐殖土的密度约为2.47g/cm³。有机质质量分数为29.13％，含固率为89.50％，种植植物为鲁豫花生。

将鲁豫花生以稀释25倍的复合微生物菌剂浸种，以每盆4株种到培养钵内，每隔2周以稀释100倍的上述复合微生物菌剂进行叶面及根部喷施。2月后分离土壤根际环境中的细菌，采用平板计数法估测复合微生物菌剂中各微生物的含量。

实验结果如表3所示，可以看出，试验进行2个月依然能够从花生根际土壤中分离出较高浓度的巴西固氮螺菌、动胶菌样申氏菌、非典型氢嗜孢菌和稻黄杆菌，表明本发明复合微生物菌剂可以有效定殖在作物根圈环境中。

表3试验两周于植物根际土壤中分离出的四种微生物的含量

微生物种类	含量(CFU/g)
		巴西固氮螺菌	2.3×10<sup>7</sup>
动胶菌样申氏菌	7.1×10<sup>6</sup>
		非典型氢嗜孢菌	9.8×10<sup>7</sup>
稻黄杆菌	1.1×10<sup>8</sup>

2、复合微生物菌剂对植物组织发育的影响

取在培养箱环境下于培养钵中种植1月的玉米进行茎部植物组织切片，以探寻复合微生物菌剂对植物组织发育的影响，具体试验方法及试验结果如下。

培养箱环境为光照14小时，黑暗10小时，光照度16000Lux，温度为28℃，湿度为75％。种植管理方案为：实验组采用实施例2中复合微生物菌剂浸种，以稀释25倍的菌剂28℃下浸泡玉米种子1h，经催芽后种入培养钵中，每两周用稀释100倍的复合微生物菌剂浇灌一次，同时对叶面进行喷施。对照组采用类似的管理模式，但将复合微生物菌剂用蒸馏水替代。

种植1月，肉眼可观察到实验组茎组织相对对照组更粗，须根更旺盛，气生根更发达，叶片更厚，蜡质层更厚。取种植1月的玉米进行茎部组织切片，实验组和对照组玉米茎组织切片分别如图11和图12所示，可观察到相对于对照组，实验组茎韧皮部组织增厚，木质部发达，通气性增加；表明本发明复合微生物菌剂能够有效促进作物生长。

3、复合微生物菌剂对植物可溶性糖含量的影响

(1)建立吸光度-糖含量的标准曲线

取20mL刻度试管6支，依次编号为1～6，分别向上述6支试管中加入0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL的100μg/mL蔗糖溶液，并用水补至2mL，各管中糖含量分别为0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL，然后按顺序向试管中加入0.5mL蒽酮乙酸乙酯试剂和5mL浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管均准确保温1min，取出后自然冷却至室温，以空白作对照，在630nm波长下测其吸光度，以吸光度为纵坐标，以糖含量为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程。

(2)玉米可溶性糖的提取及检测

将“2、复合微生物菌剂对植物组织发育的影响”部分种植1月的实验组和对照组玉米，均取其地上部分进行干燥、粉粹，称取已粉碎样品0.10～0.30g放入20mL刻度试管中，加入5～10mL蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min，提取2次，提取液过滤入25mL容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度，分别制得实验组和对照组待检样品液。

吸取0.5mL样品液于20mL刻度试管中，加蒸馏水1.5mL，同制作标准曲线的步骤，按顺序分别加入蒽酮乙酸乙酯试剂、浓硫酸溶液，显色并测定吸光度。由标准线性方程求出实验组和对照组玉米中可溶性糖含量。

试验结果如表4所示，相对于对照组，实验组玉米中可溶性糖含量提高了1.78倍，表明本发明复合微生物菌剂能够提高作物可溶性糖含量，促进作物生长。

表4实验组和对照组玉米可溶性糖含量

实验组别	玉米中可溶性糖含量(mg/g)
		实验组	11.9
对照组	6.7

4、复合微生物菌剂对植物蛋白含量的影响

以稀释50倍的复合微生物菌剂浸泡处理20min的大豆籽粒为实验组，以用水同样处理的大豆籽粒为对照组；大豆籽粒的取样地点为广东省清远市清城区；生长环境为植物培养箱。用便携式大豆蛋白测定仪(FOSS Infratec 1241)测量籽粒蛋白含量。

实验组和对照组的大豆籽蛋白含量如表5所示，可以看出，经本发明复合微生物菌剂浸泡处理后的大豆籽中蛋白含量高于对照组，表明，本发明复合微生物菌剂具有增加大豆籽蛋白的作用。

表5实验组和对照组的大豆籽蛋白含量

实验组别	大豆籽蛋白含量(％)
		实验组	47.1
对照组	43.7

5、复合微生物菌剂对花生生长的影响

以鲁寿花生为实验材料，实验组用复合微生物菌剂浸泡处理，处理方法为播种前用复合微生物菌剂的10倍稀释液浸种1小时；对照组用清水做相应的处理。每组10个样本重复，播入9cm(深度)*5cm(半径)培养钵中，不施底肥，放置气候箱中培养。另有每组20个样本重复，播入42cm(深度)*21cm(半径)培养钵中，不施底肥，放置室外于自然环境中培养。

其中，气候箱中实验组和对照组鲁寿花生生长14天植株如图13所示，图中左侧三株花生为对照组，右侧三株为实验组，可以看出，在气候箱环境中，经复合微生物菌剂处理过的花生样本茎较粗，根系发达，叶片更厚。

在自然环境中培养14天的实验组鲁寿花生和对照组鲁寿花生分别如图14和图15所示，可以看出，在室外自然环境中，经复合微生物菌剂处理过的花生生长速度高于对照组。

综上结果表明，复合微生物菌剂处理有助于增强作物的抗性、提高作物对自然环境的适应能力，进而促进作物的快速生长。

实施例4

本实施例用于探究实施例2制得的复合微生物菌剂对土壤改良的影响，具体通过复合微生物菌剂对土壤pH改良、土壤含氮量这两个方面进行探讨。

1、复合微生物菌剂对土壤pH的调控作用

取广东清远红土、长白山腐殖土、鱼塘塘底土作为试验用土，每种土壤取样10kg，加入混合菌群100mL，混合搅匀，放入恒温恒湿培养箱中培养，分别在培养1d、7d、28d取样检测。

取样检测具体方法为：分别取样100g培养箱培养的试验用土入烧杯中，加蒸馏水定容至1L，用旋涡搅拌器混匀后静置10min；取上清100mL倒入三角瓶中，利用pH测定仪测定pH，重复操作过程三次取均值。

测定结果如表6所示，可以看出，对于呈碱性的鱼塘塘底土经本发明复合微生物菌剂处理后，其pH呈下降趋势，逐步趋于中性，而呈酸性的广东清远红土和长白山腐殖土经本发明复合微生物菌剂处理后，其pH呈上升趋势，并逐步趋于中性，综上表明，本发明复合微生物菌剂能够改善土壤pH，对土壤pH具有改善和缓冲作用。

表6复合微生物菌剂处理后土样pH值的变化值

试验土样	1天	7天	28天
				鱼塘塘底土	9.12	8.98	8.01
广东清远红土	4.88	5.11	5.92
				长白山腐殖土	5.23	5.37	6.01

2、复合微生物菌剂对土壤含氮量的影响

取广东清远红土、长白山腐殖土、鱼塘塘底土作为试验用土，每种取样10kg，加入混合菌群100mL，混合搅匀，放入恒温恒湿培养箱中培养，分别在培养1d、7d、28d取样检测。

取样检测具体方法为：分别取样100g培养箱培养的试验用土入烧杯中，加蒸馏水定容至1L，用旋涡搅拌器混匀后静置10min；取上清100mL倒入三角瓶中，用凯氏定氮仪测定含氮量，重复操作过程三次取均值。

试验结果如表7所示，可以看出，复合微生物菌剂对鱼塘塘底土中氮含量的改善效果并不明显，但对于广东清远红土和长白山腐殖土，随着复合微生物菌剂处理时间的延长，土壤中氮含量逐步提升，表明本发明复合微生物菌剂对土壤具有一定的增肥效果，推测可能是由于复合微生物菌剂中的微生物将土壤中的有机物分解所致。

表7复合微生物菌剂处理后土样氮含量的变化值

试验土样	1天	7天	28天
				鱼塘塘底土	＜0.1％	＜0.1％	＜0.1％
广东清远红土	＜0.1％	0.12％	0.27％
				长白山腐殖土	0.8％	0.91％	1.26％

实施例5

本实施例与实施例1的区别在于，本实施例微生物菌剂还包括根际放线菌。

本实施例微生物菌剂的具体组成如下：

以菌种发酵液的重量百分数计，本实施例微生物菌剂包括固氮菌5wt％～65wt％、促生根瘤菌5wt％～55wt％、嗜氢菌10wt％～40wt％、兼性菌10wt％～30wt％和根际放线菌10wt％～60wt％。

其中，上述复合微生物菌剂优选由固氮菌10wt％、促生根瘤菌10wt％、嗜氢菌20wt％、兼性菌20wt％和根际放线菌40wt％组成。

根际放线菌包括包括链霉菌属(Streptomyces sp)、小单孢菌属(Micromonosporasp)和诺卡氏菌属(Nocardia sp)中的至少一种。

实施例6

本实施例与实施例1的区别在于，本实施例微生物菌剂还包括真菌。

本实施例微生物菌剂的具体组成如下：

以菌种发酵液的重量百分数计，本实施例微生物菌剂包括固氮菌10wt％～60wt％、促生根瘤菌10wt％～50wt％、嗜氢菌10wt％～60wt％、兼性菌5wt％～55wt％和真菌10wt％～60wt％。

其中，上述复合微生物菌剂优选由固氮菌15wt％、促生根瘤菌15wt％、嗜氢菌20wt％、兼性菌10wt％和真菌40wt％组成。

其中，固氮菌为嗜水红树小杆菌(Mangrovibacterium marinum)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、好斗趋磁螺菌(Magnetospirillum bellicus)、圆柱类鱼腥藻(Anabaena cylindrica)、巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)、蜜糖草固氮螺菌(Azospirillum melinis)、伊拉克固氮螺菌(Azospirillum irakense)、鲁戈苏固氮螺菌(Azospirillum rugosum)、稻固氮螺菌(Azospira oryzae)、脂铁螺旋菌(Azospirillum lipoferum)、棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、浸麻芽孢杆菌(Bacillus macerans)中的至少一种。

真菌包括黏帚霉属(Gliocladium sp)、青霉属(Penicillium sp)、曲霉属(Aspergillus sp)、腐霉属(Pythium sp)和木霉属(Trichoderma sp)中的至少一种。

实施例7

本实施例与实施例1的区别在于，本实施例微生物菌剂还包括革兰氏阳性菌。

本实施例微生物菌剂的具体组成如下：

以菌种发酵液的重量百分数计，本实施例微生物菌剂包括固氮菌5wt％～65wt％、促生根瘤菌5wt％～55wt％、嗜氢菌5wt％～60wt％、兼性菌5wt％～60wt％和革兰氏阳性菌20wt％～60wt％。

其中，上述复合微生物菌剂优选由固氮菌10wt％、促生根瘤菌10wt％、嗜氢菌20wt％、兼性菌20wt％和革兰氏阳性菌40wt％组成。

革兰氏阳性菌如市售的芽孢杆菌属等。

实施例8

本实施例与实施例1的区别在于，本实施例微生物菌剂呈固态，微生物菌剂中还包括无机肥。

本实施例微生物菌剂的具体组成如下：

以固态菌粉的重量百分数计，本实施例复合微生物菌剂包括固氮菌1％～45％、促生根瘤菌1％～45％、嗜氢菌1％～45％、兼性菌1％～45％和无机肥50％～90％。

其中，上述复合微生物菌剂优选由固氮菌5％、促生根瘤菌5％、嗜氢菌5％、兼性菌10％和无机肥75％组成。

无机肥包括但不限于无机氮肥、无机磷肥、无机钾肥、无机镁肥等，以及上述材料的混合。

实施例9

本实施例与实施例1的区别在于，本实施例微生物菌剂呈固态，微生物菌剂还包括有机肥。

本实施例微生物菌剂的具体组成为：

以固态菌粉的重量百分数计，本实施例复合微生物菌剂包括固氮菌1％～45％、促生根瘤菌1％～45％、嗜氢菌1％～45％、兼性菌1％～45％和有机肥50％～90％。

其中，上述复合微生物菌剂优选由固氮菌2％、促生根瘤菌2％、嗜氢菌2％、兼性菌4％和有机肥90％组成。

有机肥包括但不限于腐熟人畜粪尿、植物秸秆、草木灰、椰糠、木屑等，以及上述材料的混合。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种复合微生物菌剂，其特征在于，以菌种发酵液的重量分数计，所述微生物菌剂包括：固氮菌10wt％～60wt％、促生根瘤菌10wt％～50wt％、嗜氢菌15wt％～35wt％和兼性菌15wt％～65wt％；所述微生物菌剂中固氮菌、促生根瘤菌、嗜氢菌、兼性菌的含量均不低于1×10⁶CFU/mL。

2.根据权利要求1所述复合微生物菌剂，其特征在于，以菌种发酵液的重量分数计，所述微生物菌剂包括：固氮菌30wt％、促生根瘤菌10wt％、嗜氢菌35wt％和兼性菌25wt％；所述微生物菌剂中固氮菌、促生根瘤菌、嗜氢菌、兼性菌的含量均不低于1×10⁶CFU/mL。

3.根据权利要求1所述复合微生物菌剂，其特征在于，所述固氮菌为嗜水红树小杆菌(Mangrovibacterium marinum)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、好斗趋磁螺菌(Magnetospirillum bellicus)、圆柱类鱼腥藻(Anabaena cylindrica)、巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)、蜜糖草固氮螺菌(Azospirillum melinis)、伊拉克固氮螺菌(Azospirillum irakense)、鲁戈苏固氮螺菌(Azospirillum rugosum)、稻固氮螺菌(Azospira oryzae)、脂铁螺旋菌(Azospirillumlipoferum)、棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)、多粘芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa)、浸麻芽孢杆菌(Bacillus macerans)中的至少一种。

4.根据权利要求1所述复合微生物菌剂，其特征在于，所述促生根瘤菌为豆科根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)、氧化胺黄色杆菌(Xanthobacter aminoxidans)、动胶菌样申氏菌(Shinella zoogloeoides)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、假红农杆菌(Agrobacterium Pseudorhodobacter)中的至少一种。

5.根据权利要求1所述复合微生物菌剂，其特征在于，所述嗜氢菌为普通脱硫弧菌(Desulfovibrio vulgaris)、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)、非典型氢嗜孢菌(Hydrogenophaga atypica)、帕氏氢嗜孢菌(Hydrogenophaga palleronii)、黄色氢嗜孢菌(Hydrogenophaga flava)中的至少一种。

6.根据权利要求1所述复合微生物菌剂，其特征在于，所述兼性菌为门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)、籼假单胞菌(Pseudomonas indica)、瓦登斯假单胞菌(Pseudomonas wadenswilerensis)、里沃利黄杆菌(Flavobacterium rivuli)、稻黄杆菌(Flavobacterium oryzae)、伯卡利新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium pokkalii)、黄色短波单胞菌(Brevundimonas aurantiaca)中的至少一种。

7.根据权利要求1所述复合微生物菌剂，其特征在于，所述固氮菌为巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)，所述促生根瘤菌为动胶菌样申氏菌(Shinellazoogloeoides)，所述嗜氢菌为非典型氢嗜孢菌(Hydrogenophaga atypica)，所述兼性菌为稻黄杆菌(Flavobacterium oryzae)。

8.根据权利要求1所述复合微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂还包括放线菌或真菌或革兰氏阳性菌或有机肥或无机肥。

9.根据权利要求8所述复合微生物菌剂，其特征在于，所述根际放线菌为链霉菌属(Streptomyces sp)或小单孢菌属(Micromonospora sp)或诺卡氏菌属(Nocardia sp)；所述真菌为黏帚霉属(Gliocladium sp)或青霉属(Penicillium sp)或曲霉属(Aspergillussp)或腐霉属(Pythium sp)或木霉属(Trichoderma sp)。

10.权利要求1～9任一所述复合微生物菌剂在土壤改良中的应用。