CN111154668B - 一株裂解亚氯酸假单胞菌及其应用 - Google Patents

一株裂解亚氯酸假单胞菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株裂解亚氯酸假单胞菌及其应用。该菌株已于2018年08月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为CGMCCNo.18364。在盆栽条件下，用本发明假单胞菌的发酵液在小麦定苗后灌根处理，在土壤中能产生蛋白酶、生长素，能够降解土壤中难溶性磷和钾，从而增强土壤盐碱环境下小麦的根系活力促进小麦的植株的生长，株高、地上部分生物量、根系部分的生物量、根系发育以及叶绿素含量，能够改善小麦幼苗生长状况，对土壤盐碱环境下生长的小麦有良好的促生效果，有力地证明了在盐碱地生产种植中对小麦非常明显的促生效果。

Description

一株裂解亚氯酸假单胞菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株裂解亚氯酸假单胞菌及其应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
盐碱土壤是含盐量浓度较高，不利于植物生长的土壤，分布于全球范围内，随着人口的剧增以及不合理的开垦，土壤表皮原本结构被破坏，造成土地荒漠化和盐碱化加重，这些盐碱化土壤影响着农作物产量，限制了我国农村经济产业的可持续发展。
随着人口数量的增加，可使用的耕地面积减少，目前国家高度重视盐碱地的开发与利用。研究表明，通过将PGPR与耐盐碱植物相结合的方法治理盐碱地初见成效，该方法起效快、可持续、成本低、无污染、极具潜力。通过微生物菌剂的使用可缓解土壤pH值、含盐量等对植物的不利影响，促进根系发育，使植物茁壮成长。
已有一些研究表明，根际促生菌能有效提高植物抗盐性、抗碱性、促进植物生长，在盐碱等逆境胁迫下，PGPR还能表现出一定的降盐、降碱的特性，促进盐碱胁迫下的植物生长主要表现在，种子发芽率和存活率提高、生物量增加、根系发达、抗逆性增强使土壤中Na+和Cl-浓度降低而其它营养离子浓度升高。
然而，尽管关于促生菌的报道已有很多，但迄今为止关于耐盐碱并同时具有多种促生功能的假单胞菌尚未有报道。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一株裂解亚氯酸假单胞菌及其应用，本发明菌株促生机制是除了产蛋白酶之外还可以溶磷解钾、产生生长素；菌株能够改善小麦在盐碱环境下的生长状况，增强小麦对盐碱环境的适应性，为小麦促生提供了新的微生物资源。
为实现上述发明目的，本发明公开以下技术方案：
本发明的目的之一，是提供一株裂解亚氯酸假单胞菌(Pseudomonaschloritidismutans)6L11，该菌株已于2019年08月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为CGMCCNo.18364。
本发明的目的之二，是提供一种微生物菌剂，其含有所述裂解亚氯酸假单胞菌(Pseudomonas chloritidismutans)6L11和/或含裂解亚氯酸假单胞菌(Pseudomonaschloritidismutans)6L11的培养物。
本发明的目的之三，是提供一种微生物菌肥，其含有所述裂解亚氯酸假单胞菌(Pseudomonas chloritidismutans)6L11和/或含裂解亚氯酸假单胞菌(Pseudomonaschloritidismutans)6L11的培养物。
本发明的目的之四，是提供上述裂解亚氯酸假单胞菌(Pseudomonaschloritidismutans)6L11、微生物菌剂和/或微生物菌肥在促进小麦生长中的应用。
与现有技术相比，本发明取得了以下有益效果：
(1)本发明的菌株具有产蛋白酶的作用，发酵液蛋白酶活性能够高达123.144μg/mL，所产生蛋白酶可以降解土壤中的蛋白质来增加土壤中的氨基酸含量，氨基酸肥料对植物生长有着促进作用。
(2)本发明的裂解亚氯酸假单胞菌能够耐盐碱且具有产蛋白酶等多种促生功能，能够明显促进土壤盐碱环境下小麦生长。
(3)本发明筛选的裂解亚氯酸假单胞菌在盆栽条件下对小麦的促生效果的研究，所采用的试验方法更贴近实际应用状态，通过直接以盐碱土壤种植小麦为试验样品，接近于小麦的农业种植方式，有力地证明了在盐碱地生产种植中对小麦显著的促生效果。
(4)检测了采用本发明裂解亚氯酸假单胞菌制备的发酵液的盆栽小麦株高、地上部分生物量、根系部分的生物量、根系发育以及叶绿素含量，证明了本菌株能够显著改善小麦在盐碱环境下的生长状况，增强小麦对盐碱环境的适应性，为小麦促生提供了新的微生物资源，丰富了植物促生功能的菌种资源。
(5)本发明筛选的裂解亚氯酸假单胞菌比真菌生长速度快并且高度耐盐碱，在盐碱土壤中能够更容易更好的发挥作用，能够在盐碱土改良中扮演重要角色。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明培养的裂解亚氯酸假单胞菌的镜检效果图。
图2为本发明培养的裂解亚氯酸假单胞菌的菌落效果图。
图3为本发明裂解亚氯酸假单胞菌和对照组菌株(CK)盆栽实验根系效果图。
图4为本发明培养的裂解亚氯酸假单胞菌的产蛋白酶效果图。
图5为本发明培养的裂解亚氯酸假单胞菌的降解有机磷效果图。
图6为本发明培养的裂解亚氯酸假单胞菌的降解钾效果图。
图7为本发明裂解亚氯酸假单胞菌和对照组菌株产IAA的效果图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明的一个具体实施方式中，提供一株裂解亚氯酸假单胞菌(Pseudomonaschloritidismutans)6L11，该菌株已于2019年08月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为CGMCCNo.18364。
在本发明中，通过测定该菌株6L11的16S rDNA基因序列(见SEQ ID NO.1)并通过形态特征及生理生化指标测定，最终确定该菌株属于裂解亚氯酸假单胞菌(Pseudomonaschloritidismutans)。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述裂解亚氯酸假单胞菌(Pseudomonaschloritidismutans)6L11的培养方法，具体为：将裂解亚氯酸假单胞菌(Pseudomonaschloritidismutans)6L11置于LB液体培养基中培养，培养条件为37℃下有氧培养24h，如摇床振(37℃，150rpm)荡培养。培养后菌落呈圆形，表面圆形凸起，光滑，湿润，淡黄色，边缘规则；菌体呈杆状，革兰氏阴性，无芽孢。
所述裂解亚氯酸假单胞菌(Pseudomonas chloritidismutans)6L11的生理生化特征为：接触酶阳性，V-P实验阴性，D-葡萄糖阳性，L-阿拉伯糖阳性，D-甘露醇阳性，水解淀粉酶阳性，柠檬酸盐利用阳性。
其中，所述LB培养基配方为(质量百分比)：酵母粉，0.5％；蛋白胨，1％；氯化钠，1％；蒸馏水；琼脂，1.6％；pH7.0；所述蒸馏水在121℃灭菌20min。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种微生物菌剂，其含有裂解亚氯酸假单胞菌(Pseudomonas chloritidismutans)6L11和/或含裂解亚氯酸假单胞菌(Pseudomonaschloritidismutans)6L11的培养物。
本发明的又一具体实施方式中，所述微生物菌剂的剂型为可湿性粉剂、水分散粒剂、水悬浮剂或可分散油悬浮剂。
本发明的又一具体实施方式中，所述微生物菌剂中还包括促植物生长调节剂中可接受的辅料。
本发明的又一具体实施方式中，所述辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。本发明对所述农药学上可接受的辅料的来源等没有特殊限制，一般采用市售产品即可。
其中，所述分散剂为阴离子型分散剂和/或非离子型分散剂，可选自木质素磺酸钠、萘磺酸钠甲醛缩合物、亚甲基双萘磺酸钠、甲醛缩合物硫酸盐、聚羧酸盐、烷基酚聚氧乙烯基磷酸酯和脂肪酸聚氧乙烯酯中的一种或多种。
所述湿润剂可选自十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、皂角粉、无患子粉、茶枯粉和拉开粉BX中的一种或多种。
所述崩解剂可选自膨润土、硫酸铵、氯化铝、尿素、氯化镁和葡萄糖中的一种或多种。
所述粘结剂可选自淀粉、硅藻土、环糊精、松香、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素和羧甲基纤维素盐中的一种或多种。
所述消泡剂可选自C8～C20脂肪醇类化合物、C10～C20饱和脂肪酸类化合物、环氧大豆油、乙醇、硅酮类化合物和有机硅油中的一种或多种。
所述抗冻剂可选自山梨醇、乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、丙三醇、尿素和氯化钠中的一种或多种。
所述增稠剂可选自明胶、黄原胶、聚乙二醇和聚乙烯醇中的一种或多种。
所述填料可选自轻质碳酸钙、硅藻土、膨润土、凹凸棒土和白炭黑中的一种或多种。
所述溶剂可选自水(优选为去离子水)或油酸甲酯。
本发明的又一具体实施方式，提供一种微生物菌肥，其含有裂解亚氯酸假单胞菌(Pseudomonas chloritidismutans)6L11和/或含裂解亚氯酸假单胞菌(Pseudomonaschloritidismutans)6L11的培养物。
本发明的又一具体实施方式，提供一种微生物菌肥，其含有所述微生物菌剂。
本发明的又一具体实施方式中，所述微生物菌肥还含有有机质、全钾、全氮，用于提供小麦生长的养分。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述裂解亚氯酸假单胞菌(Pseudomonaschloritidismutans)6L11、微生物菌剂和/或微生物菌肥在促进小麦生长中的应用。
优选地，所述应用为：制备裂解亚氯酸假单胞菌(Pseudomonaschloritidismutans)6L11的发酵液，在小麦定苗后用稀释的发酵液进行灌根处理。
可选地，所述发酵液的制备方法为：将斜面保存的菌种转接到液体培养基中，放在恒温摇床中培养12-14h，温度：37℃，转速：180-200rpm；将活化好的菌液按1％接种量接入到100-200mL培养基中，放入摇床培养24h，温度：37℃，转速：180-200rpm，制成发酵液。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。
实施例1：菌株鉴定
本发明通过对筛选获得的一株具有耐盐碱同时具有促小麦生长的菌株，经16SrDNA以及生理生化指标鉴定，确定该菌株为裂解亚氯酸假单胞菌(Pseudomonaschloritidismutans)。其中，如图2所示，所述裂解亚氯酸假单胞菌(Pseudomonaschloritidismutans)6L11的菌落及菌体特征为：在LB培养基上培养24h后菌落呈圆形，表面圆形凸起，光滑，湿润，淡黄色，边缘规则；菌体呈杆状，革兰氏阴性，无芽孢。该菌株的生理生化特征为：接触酶阳性，V-P实验阴性，D-葡萄糖阳性，L-阿拉伯糖阳性，D-甘露醇阳性，水解淀粉酶阳性，柠檬酸盐利用阳性；该菌落的镜检效果图如图1所示。
所述裂解亚氯酸假单胞菌(Pseudomonas chloritidismutans)6L11的16S rDNA序列如下：
CTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGAAGAGAGCTTGCTCTCTGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGATAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCATTAACCTAATACGTTAGTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGAATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTATGGCAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGGCTAATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGATCCTTGAGATCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAGCTCTGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTAAGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGGGGACGGTACCA(SEQ ID No.1)。
实施例2：裂解亚氯酸假单胞菌(Pseudomonas chloritidismutans)6L11温室促生试验
将小麦幼苗移栽至灭菌后的基质(盐碱土壤直接取自滨州市无棣县，土壤pH大于8.6，呈碱性)中，在小麦定苗后取1ml发酵液用水稀释至20ml稀释，然后以盆栽中每株小麦1ml稀释后发酵液的用量进行灌根处理。对照组取1mlLB液体培养基用水稀释至20ml，然后对小麦进行灌根处理。对照组CK。
在培养20d和40d后测量对小麦的促生效果，检测了盆栽小麦株高、地上部分生物量、根系部分的生物量、根系发育以及叶绿素含量，结果如表1-3以及图3所示。从表中可以看出：6L11能够显著促进小麦植株的生长，例如，20d和40d的小麦植株根系干重分别增长：36.36和100％；根系鲜重分别增长：13.54％和280％；地上部分株高分别增加15.50％和14.76％。可以看出，在盆栽条件下，用本发明裂解亚氯酸假单胞菌(Pseudomonaschloritidismutans)6L11的发酵液在盐碱土壤条件下对小麦生长初期灌根处理后，能够对小麦产生很好的促生效果，小麦株高、根系干湿重较对照组均有很大的增加，达到了显著或极显著差异。
可以看出，在盆栽条件下，用本发明的耐盐碱且具有产蛋白酶等多种促生功能的假单胞菌的发
酵液在小麦定苗后灌根处理，在土壤中能产生蛋白酶、生长素并且能够降解土壤中难溶性磷和钾。能够增强土壤盐碱环境下小麦的根系活力促进小麦的植株的生长，株高、地上部分生物量、根系部分的生物量、根系发育以及叶绿素含量，能够改善小麦幼苗的生长状况，对土壤盐碱环境下生长的小麦有一定的促生效果。
表1施菌20d促生效果
Figure BDA0002204616170000111
表2施菌40d促生效果
Figure BDA0002204616170000112
表3小麦叶片叶绿素含量检测结果
Figure BDA0002204616170000113
实施例3：菌株6L11产蛋白酶、解磷、解钾以及产IAA的测试
检测裂解亚氯酸假单胞菌(Pseudomonas chloritidismutans)6L11产蛋白酶、解磷、解钾能力、产IAA以及菌株耐盐、碱能力，结果如表4-9以及图4-7所示。
表4产蛋白酶检测结果
Figure BDA0002204616170000121
表5解磷能力检测结果
Figure BDA0002204616170000122
表6菌株产IAA含量
Figure BDA0002204616170000123
表7菌株耐盐能力检测结果
Figure BDA0002204616170000124
表8菌株耐碱能力检测结果
Figure BDA0002204616170000125
表9菌株耐盐碱能力检测结果
Figure BDA0002204616170000126
注：表8-10中，所述“+++”表示生长旺盛；“++”表示生长较好；“+”表示生长；“-”表示不生长
综上，可以看出，在盆栽条件下，用本发明的假单胞菌的发酵液在小麦定苗后灌根处理，在土壤中能产生蛋白酶、生长素并且能够降解土壤中难溶性磷和钾，从而增强土壤盐碱环境下小麦的根系活力促进小麦的植株的生长，株高、地上部分生物量、根系部分的生物量、根系发育以及叶绿素含量，能够改善小麦幼苗的生长状况，对土壤盐碱环境下生长的小麦有良好的促生效果，有力地证明了在盐碱地生产种植中对小麦非常明显的促生效果。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东农业大学
<120> 一种裂解亚氯酸假单胞菌及其应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1415
<212> DNA
<213> 裂解亚氯酸假单胞菌（Pseudomonas chloritidismutans）16S rDNA
<400> 1
ctaacacatg caagtcgagc ggatgaagag agcttgctct ctgattcagc ggcggacggg 60
tgagtaatgc ctaggaatct gcctgatagt gggggacaac gtttcgaaag gaacgctaat 120
accgcatacg tcctacggga gaaagcaggg gaccttcggg ccttgcgcta tcagatgagc 180
ctaggtcgga ttagctagtt ggtgaggtaa tggctcacca aggcgacgat ccgtaactgg 240
tctgagagga tgatcagtca cactggaact gagacacggt ccagactcct acgggaggca 300
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taagttgaat gtgaaagccc cgggctcaac ctgggaactg catccaaaac tggcaagcta 600
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gggttgccaa gccgcgaggt ggagctaatc ccataaaacc gatcgtagtc cggatcgcag 1260
tctgcaactc gactgcgtga agtcggaatc gctagtaatc gtgaatcaga atgtcacggt 1320
gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg gttgctccag 1380
aagtagctag tctaaccttc ggggggacgg tacca 1415

Claims (11)

1.一株裂解亚氯酸假单胞菌(Pseudomonas chloritidismutans)6L11，该菌株已于2019年08月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其生物保藏号为CGMCC No.18364。
2.权利要求1所述的裂解亚氯酸假单胞菌(Pseudomonas chloritidismutans)6L11的培养方法，其特征在于，将裂解亚氯酸假单胞菌(Pseudomonas chloritidismutans)6L11置于LB液体培养基中培养。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述培养条件为37℃有氧培养。
4.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于，采用摇床在37℃，150rpm条件下振荡培养。
5.一种微生物菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的裂解亚氯酸假单胞菌(Pseudomonas chloritidismutans)6L11和/或含权利要求1所述的裂解亚氯酸假单胞菌(Pseudomonas chloritidismutans)6L11的培养物。
6.如权利要求5所述的微生物菌剂，其特征在于，微生物菌剂的剂型为可湿性粉剂、水分散粒剂、水悬浮剂或可分散油悬浮剂。
7.一种微生物菌肥，其特征在于，含有权利要求1所述的裂解亚氯酸假单胞菌(Pseudomonas chloritidismutans)6L11和/或含权利要求1所述的裂解亚氯酸假单胞菌(Pseudomonas chloritidismutans)6L11的培养物。
8.一种微生物菌肥，其特征在于，含有权利要求5或6所述微生物菌剂。
9.如权利要求7或8所述的微生物菌肥，其特征在于，微生物菌肥还含有有机质、全钾、全氮。
10.权利要求1所述裂解亚氯酸假单胞菌(Pseudomonas chloritidismutans)6L11和/或权利要求5或6所述微生物菌剂和/或权利要求7-9任一项所述微生物菌肥在促进小麦生长中的应用。
11.权利要求10所述的应用，其特征在于，制备裂解亚氯酸假单胞菌(Pseudomonas chloritidismutans)6L11的发酵液，在小麦定苗后用稀释的发酵液进行灌根处理。
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