CN109439570A - 一株解磷假单胞菌及其应用 - Google Patents

一株解磷假单胞菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109439570A
CN109439570A CN201811269777.2A CN201811269777A CN109439570A CN 109439570 A CN109439570 A CN 109439570A CN 201811269777 A CN201811269777 A CN 201811269777A CN 109439570 A CN109439570 A CN 109439570A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pseudomonad
ksx1
weight
plant
phosphorus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201811269777.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109439570B (zh
Inventor
刘强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sichuan Dayu Zhonghe Agricultural Technology Development Co ltd
Original Assignee
Sichuan Dayu Zhonghe Agricultural Technology Development Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sichuan Dayu Zhonghe Agricultural Technology Development Co ltd filed Critical Sichuan Dayu Zhonghe Agricultural Technology Development Co ltd
Priority to CN201811269777.2A priority Critical patent/CN109439570B/zh
Publication of CN109439570A publication Critical patent/CN109439570A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109439570B publication Critical patent/CN109439570B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/38—Pseudomonas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05D—INORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C; FERTILISERS PRODUCING CARBON DIOXIDE
    • C05D1/00—Fertilisers containing potassium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05G—MIXTURES OF FERTILISERS COVERED INDIVIDUALLY BY DIFFERENT SUBCLASSES OF CLASS C05; MIXTURES OF ONE OR MORE FERTILISERS WITH MATERIALS NOT HAVING A SPECIFIC FERTILISING ACTIVITY, e.g. PESTICIDES, SOIL-CONDITIONERS, WETTING AGENTS; FERTILISERS CHARACTERISED BY THEIR FORM
    • C05G3/00—Mixtures of one or more fertilisers with additives not having a specially fertilising activity

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株解磷假单胞菌及其应用。采取的技术方案为：提供了一株解磷假单胞菌，在CGMCC的保藏号为CGMCC No.15915。本发明提供的一株解磷假单胞菌，具备高效分泌IAA能力，可促进作物生长，增加植株生物量；同时还能以难溶性磷酸盐为磷源进行生长，并释放可溶性磷；此外，该菌还可促进种子萌发，提高幼苗的根长、茎长、干重和鲜重，可用于制备微生物肥料。

Description

一株解磷假单胞菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株解磷假单胞菌及其应用。
背景技术
吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)因其参与植物体内细胞生长和分裂、组织器官的分化、以及同化物的运输等生理生化过程的调节与控制，在农业领域有广泛应用。此外，吲哚乙酸还可直接或间接的提高植株抗逆性，从而开始被应用于生态修复，但IAA在自然环境中不稳定，容易降解，并且人工合成价格昂贵，因此外源添加IAA在实际应用中存在一定局限。多个研究表明，土壤中一类促进植物生长的微生物称为根际促生菌(plantgrowth promoting rhizobacteria，PGPR)，就可以分泌IAA，这可作为IAA添加的有效替代。
近年来严峻的土壤环境对植物生长条件造成了多种胁迫，目前采取的主要措施是培育抗逆性较强的作物品种、改进栽培方式和农艺管理等。然而，这些措施却普遍存在投入大、周期长、见效慢等缺点。研究表明接种具有1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC)脱氨酶活性的植物根际促生菌可通过改善幼苗移栽返青、缓解逆境胁迫、促进植物生长从而提高作物的产量，特别是作用于本身就对逆境胁迫存在一定耐受性的植物上时，效果更加明显。
磷是提高作物品质和增加农业产量不可或缺的必须营养元素之一。然而，土壤全磷的95％以上属于非活性磷，被固定在土壤固相中难以被植物吸收利用。研究指出根际促生菌通过分泌小分子有机酸或大分子螯合物等方式，将土壤难溶态磷或不溶态磷转化为水溶性磷，提高土壤有效磷含量，是解决土壤磷素缺乏的重要途径之一。
菌种是特定发酵产物、土壤改良、生态修复、污染防治、微生物肥料生产应用以及微生物-植物促生、改良或抗性系统的基础。当前在此方面的研究层出不穷，但高效菌种选育的瓶颈仍没得到解决，相关领域迫切需要得到功能高效、抗性十足、能力超强的菌种。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一株解磷假单胞菌及其应用，选育出具有功能高效、抗性十足、能力超强的菌种。
本发明的目的是提供一株解磷假单胞菌及其应用。
本发明所提供的一株解磷假单胞菌应理解为一株具有解磷能力的假单胞菌。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供了一株假单胞菌，所述假单胞菌为假单胞菌KSX1-1，Pseudomonassp.，于2018年06月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.15915。
本发明提供了一株假单胞菌，其16SrDNA测序结果如SEQ ID NO：1所示。
本发明还公开了所述的假单胞菌在促进植物生长中的应用。
优选的，所述应用的具体条件为：pH值为5.0～10.0，温度为4～37℃。
本发明了还提供了一种微生物肥料，所述微生物肥料由5重量份的上述的假单胞菌KSX1-1的发酵液、5重量份的豆粕、5～10重量份的生物炭、20重量份的粪便自然堆肥以及0.35～0.4重量份的微量元素进行混合均匀后制得。
优选的，所述微量元素按质量百分数计，包括以下组分：碘化钾2.16％、硼酸16.22％、硫酸锰58.33％、硫酸锌22.50％、钼酸钠0.65％、硫酸铜0.07％、氯化钴0.07％。
优选的，所述假单胞菌KSX1-1发酵液由从假单胞菌KSX1-1保藏斜面刮取一接种环菌体接种到50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于26～30℃，摇培22～26h制得一级种子液，再将一级种子液逐级扩大培养直至所需发酵液体积的20％，并全部接入到牛肉膏蛋白胨液体培养基中发酵20～24h制备。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供的假单胞菌KSX1-1具备高效分泌IAA的能力，能够促进植物生长，增加植株生物量；且分泌ACC脱氨酶，提高植株逆境抗性；同时还具有分泌细胞分裂素、赤霉素和有机酸的能力，可以不同程度的促进植物生长，增加植株生物量。
2、本发明提供的假单胞菌KSX1-1还能以难溶性磷酸盐为磷源进行生长，并释放可溶性磷，增加土壤有效磷含量；此外，该菌还可促进种子萌发，提高幼苗的根长、茎长、干重和鲜重，可用于制备微生物肥料。
附图说明
图1为假单胞菌KSX1-1在牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落图；
图2为假单胞菌KSX1-1的革兰氏染色图；
图3为假单胞菌KSX1-1在牛肉膏蛋白胨培养基中的生长曲线；
图4为假单胞菌KSX1-1的扫描电镜图；
图5为假单胞菌KSX1-1 16SrDNA测序进化树示意图；
图6为假单胞菌KSX1-1难溶性磷酸盐平皿生长图；
图7为假单胞菌KSX1-1在粗砂土培养基中有效磷含量及对应pH值折线图；
图8为假单胞菌KSX1-1稀释浸种母液处理小白菜种子萌发情况图；
图9为假单胞菌KSX1-1稀释浸种母液处理小白菜种子幼苗鲜重、干重柱状图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
若未特别指明，实施举例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1目标菌株的筛选
(1)培养基的准备
牛肉膏蛋白胨固体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH＝7.0，121℃灭菌20min。
牛肉膏蛋白胨液体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH＝7.0，121℃灭菌20min。
CCM培养基：NH4NO3 1g；MgSO4·7H2O 0.2g；KH2PO4 0.2g；甘露醇5.0g；K2HPO4 0.8g；CaCl2·2H2O 0.06g；蔗糖5.0g；NaMoO4·2H2O 2.5mg；酵母粉0.1g；乳酸0.5mL；NaCl 0.1g；1.64％乙二胺四乙酸钠铁(Na·Fe·EDTA)4mL；总体积1000mL(蒸馏水补足)；pH＝7.0。注：灭菌时将MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O和Na·Fe·EDTA分开灭菌，否则会产生沉淀。
Salkowski试剂：准确称取FeCl3 4.5g，溶于10.8M H2SO4中，冷却后定容至1L。其测定范围为5～200mg/L，一般超过100mg/L需要用去离子水稀释。
(2)菌株的筛选
选取在侵蚀作用强烈发生养分贫瘠的初育土地区原生植被(这里的侵蚀作用强烈发生的主要外营力为风蚀作用，表土层无保留，母质层保留完整；养分贫瘠是有机质含量<6g/kg，速效氮含量<30mg/kg，有效磷含量<3mg/kg，速效钾含量<30mg/kg；初育土是土壤发育程度微弱，土壤剖面层次分异不明显，母质特征显著，剖面类型多为A-C或A-R型，这里的A为表土层，C为母质层，R为基岩)，小心去掉根周土壤保留根际土，装袋低温保藏带回实验室，于超净工作台用灭菌毛刷辅以无菌水剥离洗涤。
洗涤完成后转移到500mL三角瓶中，置于摇床中，于30℃，180r/min震荡20min，静置10min，得到土壤悬浊液，取0.2mL土壤悬浊液于血球计数板用显微镜观察并推算悬浊液中菌体大概数量，采用灭菌水稀释到100CFU/mL后吸取0.5mL均匀涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基中。将培养皿倒置，30℃恒温培养1～2天，蘸取不同类型的典型单菌落，经平板划线纯化3次以上后，4℃保存于对应的斜面培养基中待用。
IAA分泌定量测定
第一步初筛：将上述分离纯化得到的菌株分别从保存斜面上刮取一环接种于含有L‐色氨酸(100mg/L)的牛肉膏蛋白胨液体培养基，于28℃，180r/min摇床培养1d，得到菌悬液。取50μL菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加50μL Salkowski试剂。将加入50μL 50mg/L吲哚乙酸的比色液作为阳性对照。白色陶瓷板于室温避光放置30min后观察，颜色变红则表示能够分泌吲哚乙酸。
第二步复筛：配制含100mg/L色氨酸的CCM培养基，分装于150mL锥形瓶中，每瓶50mL，于121℃条件下灭菌20min备用。在锥形瓶中接种由初筛结果为阳性的菌株制备的菌液(取一接种环菌体接种到5mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中摇培16h，菌液浓度为108CFU/mL)2mL，重复3次，以不接种为对照。将对照和接种后的培养液于28℃，180rpm/min摇床上培养3d。
将上述培养完成后的培养液于4℃，12000r/min离心5min，取上清液5mL加入等量Salkowski试剂，在黑暗环境下，静置30min后摇匀，迅速吸取200μL各待测液于96孔板，用酶标仪测定样品在波长530nm下的吸光值，并在标准曲线上查出待测液的IAA浓度(mg/L)。试验结果表明假单胞菌KSX1-1分泌IAA能力最强达70.36±5.49mg/L，培养液的转化率为70.36％。
标准曲线的制作采用纯的3-IAA(3-吲哚乙酸)。配置浓度为10，20，40，60，80，100，120ppm的IAA梯度标准溶液，并按体积比1:1与Salkowski试剂混合，室温避光放置30min，分别测定各浓度标准液在波长为530nm处的吸光值，以蒸馏水与Salkowski试剂的体积比为1:1混合溶液为空白对照。最后以IAA浓度为横坐标，OD530值为纵坐标作图，即得到IAA标准曲线。
(3)菌株性状特征
形态特征为：菌株为杆状，(0.3～0.8)μm×(1.0～1.1)μm，革兰氏染色为阴性，单极生鞭毛，无芽孢。
菌落特征为：在牛肉膏蛋白胨平板上培养48h后，菌落呈乳白色，菌落为近圆形，表面凸起，光滑，不粘稠，易挑取；其生长pH值范围为5.0～10.0，最适生长pH值为7，生长温度范围为4～37℃，最适生长温度为28℃。
实施例2假单胞菌KSX1-1的鉴定
将实施例1中筛选得到的IAA分泌能力最强的假单胞菌KSX1-1保藏至牛肉膏蛋白胨固体培养基的斜面上，并进行一系列生理生化鉴定，其菌株的菌落形态见图1所示、革兰氏染色见图2所示、生长曲线见图3所示、扫描电镜见图4所示，并进行DNA提取，16SrDNA的扩增和测序。
利用引物27F和1492R进行扩增16SrDNA，引物序列如下：
27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3
1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3
PCR扩增条件为94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃90s，30个循环；72℃10min。
对PCR扩增产物进行测序，测序结果(详见SEQ ID NO：1)制作进化树，如图5所示，将其命名为假单胞菌KSX1-1，并于2018年06月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种名称：假单胞菌KSX1-1(Pseudomonas sp.)，保藏号为CGMCC NO.15915。
实施例3假单胞菌KSX1-1的ACC脱氨酶活性分析
(1)培养基的准备
DF培养基：MnSO4·7H2O 0.2g，KH2PO4 4.0g，Na2HPO4 6.0g，柠檬酸2.0g，葡萄糖2.0g，葡萄糖酸钠2.0g，(NH4)2SO4 2.0g，组分一与组分二溶液各取0.1mL，H2O 1000mL，pH＝7.2。(组分一的制备：将CuSO4·5H2O 78.22mg，MoO3 10mg，H3BO3 10mg，ZnSO4·7H2O124.6mg，MnSO4·H2O 11.9mg，溶解于100mL无菌蒸馏水中。组分二的制备：将FeSO4·7H2O100mg，溶于10mL已灭菌的蒸馏水中，充分振荡。注：组份一和组份二，均置于-4℃保存备用。)
ADF培养基：把ACC溶于超纯水，用细菌过滤器过滤灭菌，加入到不含有(NH4)2SO4且预先灭菌的DF培养基中，pH＝7.2。ACC添加的终浓度为3.0mmol/L。
(2)ACC脱氨酶活性测定
a、将实施例1中筛选得到的IAA分泌能力最强的假单胞菌KSX1-1保藏至牛肉膏蛋白胨固体培养基的斜面上，从假单胞菌KSX1-1保藏斜面上刮取一接种环菌体接入5mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于28℃，180r/min振荡培养24h，吸取上述培养菌液2mL接种到50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于28℃，180r/min培养24～48h，于4℃，12000r/min离心10min收集菌体。
b、将菌体用不含(NH4)2SO4的DF培养基洗涤、离心3次(12000r/min，5min,每管加5mL DF)，将菌体重悬于5mL ADF培养基中，28℃，180r/min摇床培养24h后离心收集菌体。
c、将菌体用0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(即0.1mol/L的Tris溶液通过HCl调节pH＝7.6)于4℃，12000r/min离心5min、洗涤2次。取菌体重悬于1mL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液中(pH＝7.6),于4℃，12000r/min离心5min收集菌体，重悬于600μL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH＝8.5)中，添加30μL甲苯迅速振荡30s以破碎细胞，得到粗酶液，取100μL粗酶液4℃储存用于测定蛋白浓度。
d、另取粗酶液200μL并加入20μL 0.5mol/L的ACC混匀，进行水浴(30℃,15min)，以不添加ACC的空白作对照。同时加入1mL 0.56mol/L HCl终止此反应，12000r/min离心5min。取上清液1mL加入800μL 0.56mol/L HCl和300μL 0.2％2,4-二硝基苯肼溶液，使其充分溶解，30℃恒温30min，再加入2mL 2mol/L NaOH混匀，于540nm测吸光度值，重复4次并设置对照组。
α-丁酮酸标准曲线的绘制：利用0.1mol/L Tris-HCl(即0.1mol/L的Tris溶液通过HCl调节pH＝8.5)缓冲液，配制100mmol/L的α-丁酮酸母液，将该浓度的母液稀释为10mmol/L的α-丁酮酸溶液。将稀释得到的10mmol/L的α-丁酮酸溶液用0.1mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH＝8.5)进一步稀释定容，配制成0、0.02439、0.04879、0.07317、0.09756、0.1220、0.1463μmol/mL的α-丁酮酸溶液(α-丁酮酸浓度范围在0.024～0.293μmol/mL之间与吸光度值存在线性增长)，于540nm测定吸光度值(ABS)，测定结果分别为0.07、0.203、0.329、0.454、0.581、0.717、0.833。以吸光度值(OD540)为纵坐标，以α-丁酮酸的浓度(mmol/L)为横坐标绘制标准曲线，得到线性回归得到方程为：y(ABS)＝5.226x+0.0729，R2＝0.9998。
ACC脱氨酶比活力计算：参照Bradford法，比色测定细胞提取液中总蛋白质含量，以牛血清白蛋白作为标准物，绘制牛血清白蛋白标准曲线。参考Saleh等的方法，以反应体系中每毫克菌体蛋白酶每小时催化ACC脱氨生成α-丁酮酸的μmol量表示ACC脱氨酶活力，其酶活力单位为α-丁酮酸μmol/(mg·h)，酶活性测定设置空白对照。测定结果为4次重复，详见下表1，其酶活性的平均值为2.39±0.58(α-丁酮酸μmol/(mg·h))。
表1假单胞菌KSX1-1ACC脱氨酶活性测定
KSX1-1 重复1 重复2 重复3 重复4 平均值
α-丁酮酸μmol/mL 0.1364 0.1565 0.2501 0.222 0.1913
蛋白含量mg/mL 0.0558 0.0618 0.0723 0.0823 0.068
酶活性μmol/(mg·h) 2.4464 2.5319 3.4611 2.6992 2.39±0.58
实施例4假单胞菌KSX1-1的溶磷测试
NBRIP溶磷液体培养基：葡萄糖10g，磷酸钙5g，硫酸铵0.1g，氯化钾0.2g，七水氯化镁0.25g，蒸馏水1000mL，pH＝6.8～7.0，115℃高压灭菌30min。
NBRIP溶磷固体培养基：葡萄糖10g，磷酸钙5g，硫酸铵0.1g，氯化钾0.2g，七水氯化镁0.25g，蒸馏水1000mL，琼脂18g，pH＝6.8～7.0，115℃高压灭菌30min。
第一步初筛：将实施例1中筛选得到的IAA分泌能力最强的假单胞菌KSX1-1保藏至牛肉膏蛋白胨固体培养基的斜面上，从假单胞菌KSX1-1保藏斜面上用接种环均匀刮取一环菌体画十字于NBRIP溶磷固体培养基，将画好的平板倒置放在28℃的培养箱中，每天观察生长情况，具体参见图6所示，结果表明：菌体能够在NBRIP溶磷固体培养基中良好生长并出现十字菌面，表明该菌体能够利用难溶性磷酸盐。
第二步复筛：将上述能够在NBRIP溶磷固体培养基上正常生长的菌体用接种环均匀刮取一环菌体接入装有8mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于28℃摇床培养24h，制得种子液，取种子液2mL接种到50mL NBRIP溶磷液体培养基中，于28℃，180r/min摇床培养7d，将2mL培养液于4℃，12000r/min离心10min，取上清液通过钼锑抗比色法测定有效磷含量，同一菌株重复3次，其菌株溶解磷酸钙的能力为25.85±4.15mg/L较对照处理高出25.32mg/L。
同时另取3mL种子液接种于80mL粗砂土(速效磷1.58±0.04mg/kg(0.5mol/L的NaHCO3浸提)，全磷含量13.47±1.65g/kg(HClO4-H2SO4消煮))等磷置换磷酸钙的NBRIP溶磷液体培养基，于28℃，180r/min摇床培养7d，期间每隔12h取样4mL，用于测定pH和可溶性磷含量，同一菌株重复3次，结果从图7中可以看出，最高可溶性磷含量出现在第10次，取样为6.98±1.91mg/L(水溶性磷)，对应pH为5.1。
实施例5假单胞菌KSX1-1的菌液对种子萌发及提高幼苗生物量的促进作用
将实施例1中筛选得到的IAA分泌能力最强的假单胞菌KSX1-1保藏至牛肉膏蛋白胨固体培养基的斜面上，从保藏斜面接种一接种环菌体于灭菌后的8mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的试管内，于28℃，180r/min摇床培养24h制备浸种母液(利用血球计数板大致计算出该浸种母液菌体浓度为5×108CFU/mL)，将母液用无菌水稀释至103、104、105CFU/mL的3个浓度得到梯度浸种液，分别吸取各梯度浸种液吸取5mL于铺有3层滤纸且均匀布置80枚小白菜种子的培养皿中，小心移动培养皿于光照培养箱内并设置光照16h，黑暗8h，交替周期处理，并保持25℃的温度和75％空气湿度，以无菌水作对照处理，每天观察发芽情况，并按称重法补充水分，3d后记录发芽率，5d后测定根长、茎长、鲜重和干重。
结果表明：不同菌体浓度的假单胞菌KSX1-1的浸种液对小白菜种子萌发过程中都有不同程度的促进作用，其中以菌体浓度104CFU/mL效果较优，该浓度下小白菜种子萌发率较无菌水对照提高7.53％，茎长大于2.0cm和1.5～2.0cm的幼苗数量分别增加27.81％和36.84％，茎长大于1.0～1.5cm、0.5～1.0cm以及0～0.5cm的幼苗数量分别降低82.61％、64.71％以及75％，参见图8所示。与无菌水对照处理相比，菌体浓度为104CFU/mL的浸种液处理的幼苗鲜重和干重均有显著提高，参见图9所示。可见，假单胞菌KSX1-1的浸种液处理小白菜种子后，不仅可以提高其发芽率，还能显著增加其幼苗的生物量。
实施例6假单胞菌KSX1-1菌液在对幼苗促生长过程中的活性成分
浸种液选自实施例5中菌体浓度为104CFU/mL的浸种液。
细胞分裂素产生情况的生物测定
在小白菜生长初期，截取小白菜的第一片真叶放入去离子水中，待用。在试管中加入2mL去离子水和2mL浸种液，并用去离子水作为对照，将小白菜叶子取出切碎，装入试管中，每管十片，25℃暗室中放置三天后，目测叶片保绿情况。绿叶级别划分为：深绿、浅绿、黄绿、黄和黄白。结果显示：经浸种液处理后的真叶都处于浅绿以及上的情况，而对照组的真叶处于黄绿的阶段，经浸种液处理后的真叶的颜色明显比未经浸种液处理的真叶颜色深，可认为浸种液中的菌株产生了延缓植株离体叶片中叶绿素分解作用的细胞分裂素类物质。
赤霉素产生情况的生物测定
取一次性透明塑料杯，每2只重复，每只杯中分别加入1mL浸种液和9mL去离子水，同时用自来水作对照，在每只杯中放入5株小白菜幼苗，并用培养皿盖住杯子，放置27℃在散射光下培养，培养期间补充蒸发掉的水分，当苗高和杯高相近时取出培养皿，10天后至对照的第三片叶子开始长出时测量各株幼苗第二叶叶鞘长度，用统计学方法进行显著性检验。结果显示：采用浸种液培养的小白菜幼苗的叶长比未用浸种液培养的西小白菜幼苗的叶长显著的提高，增长率为22.5％，存在明显的促进作用，可认为是浸种液中的菌株产生了赤霉素类物质，促进了小白菜幼苗叶片的伸长。
有机酸产生情况的生物测定
将假单胞菌KSX1-1的浸种母液接种到NBRIP溶磷培养基中培养24h后，培养液6000r/min离心15min，上清液用0.22μm滤膜真空抽滤，通过转酯作用对样品进行甲酯化反应，每个样品取5mL滤液和9mL甲醇-硫酸(甲醇、硫酸的体积比＝10:7)混合，60℃培养12h，待培养液冷却后离心分离，将5mL甲醇加入到离心后的上清液中，上清液合并转移到60mL分液漏斗中，再加入1mL饱和氯化钠、20mL蒸馏水和5mL二氯甲烷进行洗涤，剧烈振荡60s后静置分层。将脱水后的二氯甲烷相在40℃水浴条件下利用氮气吹干，然后准确加入1mL二氯甲烷。以未接种的培养基作对照，样品进行GC-MS分析。
浸种母液在培养基中培养的过程中发现：菌株的溶磷量和细胞生长量有明显的关系，当菌株的生长量增加，其溶磷圈也逐渐变大，即溶磷量逐渐变大，最后菌株生长量达到最大时，溶磷量也趋于最大。而此时，培养基的pH值下降，可认为菌株释放的有机酸导致pH值下降可能与溶磷作用相关。通过甲基红实验表明：在加入指示剂后，菌株的在4h时开始变色，在6h后保持红色不变。因此，菌株的生长过程伴随明显的pH下降。所以，菌株产酸是溶磷的必要条件。
对样品中的有机化合物进行GC-MS分析，结果显示：在菌株的培养液中检测到6种有机化合物，这些化合物包含了不同种类的有机酸，其中乙酰丙酸的相对含量最高，为70.21％；然后是α-酮戊二酸的相对含量较高，达到21.46％；双-(甲氧羰基乙氧基亚胺乙烷)的相对含量为2.80％，2,4-己二烯二羧酸的相对含量为2.15％；其余有机酸的含量都相对较低，均低于2％，种类有2,2-二甲氧基丙酸和3-羟基癸酸。
实施例6微生物肥料的制备
将5重量份的假单胞菌KSX1-1发酵液、5重量份豆粕、5～10重量份的生物炭、20重量份的羊粪堆肥以及0.35～0.4重量份的微量元素进行混合均匀，置于阴凉处晾干、装袋，即制得微生物肥料。
假单胞菌KSX1-1发酵液的菌体浓度为109CFU/mL。
微量元素按质量百分数计，由碘化钾(2.16％)、硼酸(16.22％)、硫酸锰(58.33％)、硫酸锌(22.50％)、钼酸钠(0.65％)、硫酸铜(0.07％)、氯化钴(0.07％)组成。
假单胞菌KSX1-1发酵液：将实施例1中筛选得到的IAA分泌能力最强的假单胞菌KSX1-1保藏至牛肉膏蛋白胨固体培养基的斜面上，从假单胞菌KSX1-1保藏斜面刮取一接种环菌体接种到50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于28℃，摇培24h制得一级种子液，再将一级种子液按照20％(V/V)的接入量全部接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中发酵培养24h得到二级种子液，如此循环逐级扩大培养直至达到所需发酵液体积(发酵过程中液体体积会发生变化，但属于可接受误差范围内)的20％，并全部接入到牛肉膏蛋白胨液体培养基中发酵20～24h制备。
羊粪堆肥：将新鲜羊粪堆积成垛通过自然降解腐熟。
实施例7微生物肥料在小白菜生长发育中的应用
1、设置两种不同的处理实验：①微生物肥料处理组(微生物肥料280～320Kg/hm2，复合肥1200Kg/hm2)，②对照组(复合肥1200Kg/hm2)，每个处理组设三个重复，在播种前分别施加总施肥量的50％作基肥，用50％分两次追肥。
2、在小白菜种植后的30～40天即可采收，在每组随机选取20～50株测定平均产量，用2，6-二氯酚靛酚滴定法测定VC含量；用高锰酸钾滴定法测定还原糖含量；用粗纤维测定仪测定粗纤维含量，测定叶位为第3叶。
试验结果表明：添加含有假单胞菌KSX1-1发酵液的微生物肥料处理组，其小白菜的产量显著高于对照组，小白菜产量提高了30.12％，小白菜的VC的含量提高了50.24％(提高了品质)，小白菜的还原糖的含量增加了65.33％(提高了营养价值)，粗纤维含量降低了25.47％(增加了口感)。结果表明：添加含有假单胞菌KSX1-1发酵液的微生物肥料能够显著提高作物的品质、营养价值，并增加了作物的口感。
序列表
<110> 四川大宇中和农业科技发展有限公司
<120> 一株解磷假单胞菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1391
<212> DNA
<213> 假单胞菌KSX1-1(Pseudomonas sp.)
<400> 1
gtccccccga aggttagact agctacttct ggtgcaaccc actcccatgg tgtgacgggc 60
ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcgacattc tgattcgcga ttactagcga 120
ttccgacttc acgcagtcga gttgcagact gcgatccgga ctacgatcgg ttttgtggga 180
ttagctccac ctcgcggctt ggcaaccctc tgtaccgacc attgtagcac gtgtgtagcc 240
caggccgtaa gggccatgat gacttgacgt catccccacc ttcctccggt ttgtcaccgg 300
cagtctcctt agagtgccca ccattacgtg ctggtaacta aggacaaggg ttgcgctcgt 360
tacgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga cagccatgca gcacctgtct 420
caatgttccc gaaggcacca atccatctct ggaaagttca ttggatgtca aggcctggta 480
aggttcttcg cgttgcttcg aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc 540
aattcatttg agttttaacc ttgcggccgt actccccagg cggtcaactt aatgcgttag 600
ctgcgccact aagagctcaa ggctcccaac ggctagttga catcgtttac ggcgtggact 660
accagggtat ctaatcctgt ttgctcccca cgctttcgca cctcagtgtc agtatcagtc 720
caggtggtcg ccttcgccac tggtgttcct tcctatatct acgcatttca ccgctacaca 780
ggaaattcca ccaccctcta ccatactcta gctcgacagt tttgaatgca gttcccaggt 840
tgagcccggg gatttcacat ccaacttaac gaaccaccta cgcgcgcttt acgcccagta 900
attccgatta acgcttgcac cctctgtatt accgcggctg ctggcacaga gttagccggt 960
gcttattctg tcggtaacgt caaaacacta acgtattagg ttaatgccct tcctcccaac 1020
ttaaagtgct ttacaatccg aagaccttct tcacacacgc ggcatggctg gatcaggctt 1080
tcgcccattg tccaatattc cccactgctg cctcccgtag gagtctggac cgtgtctcag 1140
ttccagtgtg actgatcatc ctctcagacc agttacggat cgtcgccttg gtgagccatt 1200
acctcaccaa ctagctaatc cgacctaggc tcatctgata gcgcaaggcc cgaaggtccc 1260
ctgctttctc ccgtaggacg tatgcggtat tagcgtccgt ttccgagcgt tatcccccac 1320
taccaggcag attcctaggc tttactcacc cgtccgccgc tctcaagagg tgcaagcacc 1380
tctctaccgc t 1391

Claims (7)

1.一株假单胞菌，其特征在于：所述假单胞菌为假单胞菌KSX1-1，Pseudomonas sp.，于2018年06月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.15915。
2.一株假单胞菌，其特征在于：其16SrDNA测序结果如SEQ ID NO：1所示。
3.如权利要求1所述的假单胞菌在促进植物生长中的应用。
4.根据权利要求3所述的假单胞菌在促进植物生长中的应用，其特征在于：所述应用的具体条件为：pH值为5.0～10.0，温度为4～37℃。
5.一种微生物肥料，其特征在于：所述微生物肥料由5重量份的权利要求1所述假单胞菌KSX1-1的发酵液、5重量份的豆粕、5～10重量份的生物炭、20重量份的粪便自然堆肥以及0.35～0.4重量份的微量元素进行混合均匀后制得。
6.根据权利要求5所述的一种微生物肥料，其特征在于：所述微量元素按质量百分数计，包括以下组分：碘化钾2.16％、硼酸16.22％、硫酸锰58.33％、硫酸锌22.50％、钼酸钠0.65％、硫酸铜0.07％、氯化钴0.07％。
7.根据权利要求5所述的一种微生物肥料，其特征在于：所述假单胞菌KSX1-1发酵液由从假单胞菌KSX1-1保藏斜面刮取一接种环菌体接种到50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于26～30℃，摇培22～26h制得一级种子液，再将一级种子液逐级扩大培养直至所需发酵液体积的20％，并全部接入到牛肉膏蛋白胨液体培养基中发酵20～24h制备。
CN201811269777.2A 2018-10-29 2018-10-29 一株解磷假单胞菌及其应用 Active CN109439570B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811269777.2A CN109439570B (zh) 2018-10-29 2018-10-29 一株解磷假单胞菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811269777.2A CN109439570B (zh) 2018-10-29 2018-10-29 一株解磷假单胞菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109439570A true CN109439570A (zh) 2019-03-08
CN109439570B CN109439570B (zh) 2021-08-10

Family

ID=65549213

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811269777.2A Active CN109439570B (zh) 2018-10-29 2018-10-29 一株解磷假单胞菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109439570B (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110655429A (zh) * 2019-11-08 2020-01-07 四川龙蟒福生科技有限责任公司 一种水溶性有机碳肥及其制备方法
CN110669696A (zh) * 2019-07-25 2020-01-10 上海交通大学 一种解磷菌及其提取方法
CN110699303A (zh) * 2019-11-19 2020-01-17 河南工业大学 一株高效解磷假单胞菌及其微生物菌剂和应用
CN111154668A (zh) * 2019-09-17 2020-05-15 山东农业大学 一株裂解亚氯酸假单胞菌及其应用
CN112322535A (zh) * 2020-11-09 2021-02-05 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 一种解磷假单胞菌及其应用
CN113846028A (zh) * 2021-07-12 2021-12-28 兰州城市学院 一种产酸菌nq-p4及其应用与产酸菌nq-p4的培养、鉴定方法
CN114426937A (zh) * 2021-12-31 2022-05-03 华南农业大学 一株具有解磷功能的根瘤内生菌s43及其应用
CN115261272A (zh) * 2022-08-03 2022-11-01 华中农业大学 解磷假单胞菌psb-26及其筛选方法和在小白菜上的应用

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW200946477A (en) * 2008-05-15 2009-11-16 Chiu-Chung Young Novel species of Azospirillum rugosum and use thereof as biofertilizer
US20110119789A1 (en) * 1999-11-17 2011-05-19 Mendel Biotechnology, Inc. Transcription factors for increasing yield
CN102250808A (zh) * 2011-07-15 2011-11-23 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 一株产acc脱氨酶的小麦内生固氮菌及其用途
CN104371946A (zh) * 2014-05-30 2015-02-25 西北大学 一种具有解磷能力的弗村假单胞菌及其应用
EP2962568A1 (en) * 2014-07-01 2016-01-06 Basf Se Mixtures comprising a bacillus amyliquefaciens ssp. plantarum strain and a pesticide
CN106119148A (zh) * 2016-06-07 2016-11-16 江苏联海生物科技有限公司 一株假单胞菌及其应用
CN106867944A (zh) * 2017-03-27 2017-06-20 深圳文科园林股份有限公司 一种铜尾矿上植物根际促生菌的分离及其性能评价的方法
WO2017198455A2 (en) * 2016-05-17 2017-11-23 Bayer Cropscience Nv Method for increasing yield in beta spp. plants
CN108546658A (zh) * 2018-04-10 2018-09-18 暨南大学 一株溶磷菌及其与dehp降解菌复配菌剂和应用

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110119789A1 (en) * 1999-11-17 2011-05-19 Mendel Biotechnology, Inc. Transcription factors for increasing yield
TW200946477A (en) * 2008-05-15 2009-11-16 Chiu-Chung Young Novel species of Azospirillum rugosum and use thereof as biofertilizer
CN102250808A (zh) * 2011-07-15 2011-11-23 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 一株产acc脱氨酶的小麦内生固氮菌及其用途
CN104371946A (zh) * 2014-05-30 2015-02-25 西北大学 一种具有解磷能力的弗村假单胞菌及其应用
EP2962568A1 (en) * 2014-07-01 2016-01-06 Basf Se Mixtures comprising a bacillus amyliquefaciens ssp. plantarum strain and a pesticide
WO2017198455A2 (en) * 2016-05-17 2017-11-23 Bayer Cropscience Nv Method for increasing yield in beta spp. plants
CN106119148A (zh) * 2016-06-07 2016-11-16 江苏联海生物科技有限公司 一株假单胞菌及其应用
CN106867944A (zh) * 2017-03-27 2017-06-20 深圳文科园林股份有限公司 一种铜尾矿上植物根际促生菌的分离及其性能评价的方法
CN108546658A (zh) * 2018-04-10 2018-09-18 暨南大学 一株溶磷菌及其与dehp降解菌复配菌剂和应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BAO CHEN等: "The effects of the endophytic bacterium pseudomonas fluorescens samon5 and IAA on the plant growth and cadmium uptake of sedum alfredii hance", 《FRONT MICROBIOL》 *
D BARNWAL等: "ACC deaminase-containing plant growth-promoting rhizobacteria protect papaver somniferum from downy mildew", 《J APPL MICROBIOL》 *
滕松山等: "具ACC脱氨酶活性的碱蓬内生细菌的分离、鉴定及其生物学特性 ", 《微生物学报》 *
谭渝云等: "固定化假单胞菌CTP-01细胞分解对硫磷的研究 ", 《水生生物学报》 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110669696A (zh) * 2019-07-25 2020-01-10 上海交通大学 一种解磷菌及其提取方法
CN111154668A (zh) * 2019-09-17 2020-05-15 山东农业大学 一株裂解亚氯酸假单胞菌及其应用
CN111154668B (zh) * 2019-09-17 2021-06-04 山东农业大学 一株裂解亚氯酸假单胞菌及其应用
CN110655429A (zh) * 2019-11-08 2020-01-07 四川龙蟒福生科技有限责任公司 一种水溶性有机碳肥及其制备方法
CN110699303A (zh) * 2019-11-19 2020-01-17 河南工业大学 一株高效解磷假单胞菌及其微生物菌剂和应用
CN112322535A (zh) * 2020-11-09 2021-02-05 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 一种解磷假单胞菌及其应用
CN112322535B (zh) * 2020-11-09 2021-07-27 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) 一种解磷假单胞菌及其应用
CN113846028A (zh) * 2021-07-12 2021-12-28 兰州城市学院 一种产酸菌nq-p4及其应用与产酸菌nq-p4的培养、鉴定方法
CN113846028B (zh) * 2021-07-12 2023-12-05 兰州城市学院 一种产酸菌nq-p4及其应用与产酸菌nq-p4的培养、鉴定方法
CN114426937A (zh) * 2021-12-31 2022-05-03 华南农业大学 一株具有解磷功能的根瘤内生菌s43及其应用
CN115261272A (zh) * 2022-08-03 2022-11-01 华中农业大学 解磷假单胞菌psb-26及其筛选方法和在小白菜上的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN109439570B (zh) 2021-08-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109439570A (zh) 一株解磷假单胞菌及其应用
CN109852565B (zh) 一种盐碱地复合改良剂及其施用方法
CN109810924B (zh) 一种重度盐碱地改良方法
US20070068072A1 (en) Polymeric compositions containing rhizobium and/or plant growth-promoting rhizobacteria inoculant, use thereof and seeds treated with the compositions
CN108624528B (zh) 一种对豆科植物具有促生增产作用的复合菌剂及其应用
CN111690578B (zh) 一株耐盐碱暹罗芽孢杆菌及其活菌制剂的生产方法与应用
CN106754463A (zh) 一株具解磷能力伯克霍尔德菌属细菌njau‑b8及其研制的微生物肥料
CN108893421B (zh) 一种纺锤形赖氨酸芽孢杆菌及其在矿区复垦生态重建中的应用
CN112358974A (zh) 一株植物内生真菌黑附球菌fzt214及其应用
CN113684146B (zh) 一种超高温腐熟菌剂及其制备方法和应用
CN107904191A (zh) 根瘤菌v2‑2 及其应用
CN102391972B (zh) 一株樱桃根际促生假单胞菌及其应用
CN107467075B (zh) 一种短小芽孢杆菌作为水稻生长促进剂的用途
CN102598977B (zh) 一种堆肥发酵液提高黑麦草抗Cr和Cd能力的方法
CN110229757B (zh) 一株有效促进作物生长的桔绿木霉js84及其研制的生物有机肥
CN101619293B (zh) 一种酒红土褐链霉菌、筛选方法及应用
CN113897316B (zh) 地衣芽孢杆菌BLc06及其制备的功能型瓜果育苗生物基质和应用
CN115651846A (zh) 一种木霉菌剂、生物有机肥及其制备方法及应用
CN109207410B (zh) 一株解钾假单胞菌及其应用
CN115725419A (zh) 一株解磷蓝莓内生木霉菌及其应用
CN113913344A (zh) 一种有机物料腐熟剂及其制备方法
CN111411046A (zh) 一种深色有隔内生真菌菌剂与应用
CN108342337A (zh) 一种哈夫尼菌yybio-001及其制备方法、应用和菌剂
CN117586931B (zh) 一种木糖氧化无色杆菌ivf-wk240及其用途
CN115029282B (zh) 一种具有农残降解功能的芽孢杆菌及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant