CN113846028A - 一种产酸菌nq-p4及其应用与产酸菌nq-p4的培养、鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种产酸菌NQ‑P4，该菌株命名为：假单胞菌(Pseudomonas sp.)NQ‑P4，已于2021年01月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：17156。可在产酸中进行应用，且于温度为28℃、pH为6.5、转速为140rpm条件下利用发酵培养基进行恒温震荡培养产酸效率最高。本发明的产酸菌，能够为生物产酸提供菌种资源。
Description
技术领域
本发明属于环境微生物技术领域，涉及一种产酸菌NQ-P4及其应用，还涉及该产酸菌NQ-P4的培养、鉴定方法。
背景技术
采矿业是继农业发展后产生的最重要的工业，尾矿是矿产开发中经选矿处理后的主要废弃物，尾矿随意处理导致周边区域重金属污染土壤问题日益严重，如何减少和消除矿山开采的重金属污染问题已引起人们的高度关注。
传统修复重金属污染土壤的方式主要专注于物理或化学方法，例如机械搬运法、化学法等，运用这些方法虽然能快速去除土壤中的重金属，但费用过高，运作困难，易造成二次污染，在实际工程中应用受到限制。而有些微生物主要存在于重金属污染严重的地方，有研究表明这些微生物不仅具有耐高浓度重金属毒性的能力，还具有分泌柠檬酸、草酸、苹果酸等小分子有机酸的能力，有机酸络合并溶解土壤中的重金属，从而降低土壤重金属的毒性，这类具有产酸能力耐受菌株的存在为受重金属污染场地的微生物修复措施提供了一种新方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种产酸菌NQ-P4及其应用与产酸菌 NQ-P4的培养、鉴定方法，为生物产酸并改良尾矿随意处理导致周边区域重金属污染土壤问题提供了菌种资源。
本发明所采用的技术方案是，一种产酸菌NQ-P4，该菌株命名为：假单胞菌(Pseudomonas sp.)NQ-P4，已于2021年01月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC NO：21592。
产酸菌NQ-P4的培养方法，具体为：
步骤1、菌株的分离培养
采集受重金属污染严重的土壤作为样品；
制备分离培养基：将酵母提取物5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0 g，琼脂20.0g，蒸馏水1L，混合后于121℃灭菌20分钟，接着倒平板待其凝固，制成无菌的分离培养基备用；
将采集的土壤样品与无菌水混合制备土壤悬液，土壤悬液经梯度稀释后涂布于分离培养基表面，并编号，于30℃恒温培养箱中培养 1-2d；
步骤2、鉴别产酸菌株
制备产酸鉴别培养基：将1.6％溴甲酚紫加入LB固体培养基，在121℃高温灭菌20分钟，倒平板待其凝固后制成无菌的产酸鉴别培养基备用，其颜色为紫色；
将步骤1培养后的菌株取出，观察菌株形态，挑选出不同形态菌落，划线培养于产酸鉴别培养基；
培养1-2d后产酸鉴别培养基由紫色变为黄色则说明该菌株具有产酸能力，若无变化则说明该菌株不具有产酸能力，挑取具有产酸能力的菌株多次划线于产酸鉴别培养基中，获取纯化后的单一菌株；
步骤3、扩大培养
配置LB液体培养基：将酵母提取物5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1L，混合后于121℃高温灭菌20分钟，待用；
将步骤2得到的产酸菌株挑取少量接种于LB液体培养基，于恒温振荡培养箱中以140rpm，保持28℃培养24h，得到大量产酸菌株。
产酸菌NQ-P4在产酸中的应用，利用发酵培养基培养产酸菌 NQ-P4进行产酸，发酵培养基采用葡萄糖20.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉0.5g，L-半胱氨酸0.5g，NaCI 5.0g，KH2PO40.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，MgSO4·7H2O 0.5g，蒸馏水1L，调整pH为6.5，于121℃高温灭菌20分钟；将产酸菌NQ-P4菌液以2％的添加比例加入发酵培养基，将准备好的发酵培养基于温度为28℃、转速为140rpm条件进行恒温震荡培养。
在发酵培养基中添加Zn2+浓度≤250mg/L时，产酸菌NQ-P4正常产酸。
在发酵培养基中添加Pb2+浓度≤2000mg/L时，产酸菌NQ-P4正常产酸。
产酸菌NQ-P4的鉴定方法，包括：利用16S rRNA基因序列对菌种鉴定和发酵培养基内发酵液中有机酸含量的测定。
利用16S rRNA基因序列对菌种鉴定具体为：
目标菌株16S rRNA基因序列的PCR扩增：通过细菌通用引物，包括上游引物Eubac27F：5-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3和下游引物Eubac 1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，在聚合酶的作用下，经预变性、变性、退火、延伸、35个循环、修复延伸、获得目标菌株的16S rRNA基因序列。
发酵培养基内发酵液中有机酸含量的测定具体为：
首先进行0.1mol/L NaOH标准溶液、1％酚酞指示剂的配置。然后准确吸取10.0mL样品发酵液，转移到100mL容量瓶中，加蒸馏水至100mL刻度并摇匀。用滤纸过滤，准确吸取滤液20mL放入100 mL三角瓶中，加入1％酚酞2滴，用0.1mol/L NaOH标准溶液滴定至初显粉色在0.5分钟内不褪色为终点，记下氢氧化钠用量，重复取三次取平均值。并测定空白组消耗NaOH的含量。
本发明的有益效果是：
产酸菌NQ-P4的耐重金属效果：将产酸菌NQ-P4在不同浓度的 Pb2+、和Zn2+培养基中培养2d后测定培养基中的OD600值，考察产酸菌NQ-P4对重金属的耐受性。随着重金属离子浓度的增加，产酸菌NQ-P4受到不同程度的抑制，在Pb2+浓度不高于2000mg/L时，对产酸菌NQ-P4的抑制效果较弱，OD600值在1.5左右；在Zn2+浓度不高于250mg/L时，对产酸菌NQ-P4的抑制效果很弱，但随着Zn2+浓度的增加，对产酸菌NQ-P4的抑制效果增强，高浓度的Zn2+在前48h产酸菌NQ-P4几乎不生长，随着培养时间的延长菌株开始生长。说明产酸菌NQ-P4耐重金属效果Pb2+＞Zn2+。在不同重金属浓度下产酸菌NQ-P4仍具有产酸能力。本发明的产酸菌NQ-P4的筛选与鉴定方法，能够为生物产酸提供菌种资源。
附图说明
图1是本发明的产酸菌图；
图2是本发明产酸菌基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树；
图3是本发明产酸菌的生长曲线以及不同发酵时期培养基中pH 变化图；
图4是本发明中不同浓度重金属Zn对产酸菌生长的影响；
图5是本发明中不同浓度重金属Zn对产酸菌pH的影响；
图6是本发明中不同浓度重金属Pb对产酸菌生长的影响；
图7是本发明中不同浓度重金属Pb对产酸菌pH的影响；
图8是本发明中不同温度对产酸菌NQ-P4发酵液pH的影响图；
图9是本发明中不同温度对产酸菌NQ-P4发酵液消耗NaOH量的影响图；
图10不同初始pH对产酸菌NQ-P4发酵液pH的影响图；
图11不同初始pH对产酸菌NQ-P4发酵液消耗NaOH量的影响图；
图12不同转速对产酸菌NQ-P4发酵液pH的影响图；
图13不同转速对产酸菌NQ-P4发酵液消耗NaOH量的影响图。
保藏信息：产酸菌已于2021年01月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC NO：21592。命名为：假单胞菌(Pseudomonas sp.)NQ-P4。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
一种产酸菌NQ-P4，该菌株命名为：假单胞菌(Pseudomonas sp.) NQ-P4，已于2021年01月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC NO：21592。
产酸菌NQ-P4的培养方法，具体为：
步骤1、菌株的分离培养
采集陕西省宁强县矿区附近受重金属污染严重的土壤作为样品；目的是从中分离具有产酸能力的微生物。
制备分离培养基：将酵母提取物5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0 g，琼脂20.0g，蒸馏水1L，混合后，于121℃灭菌20分钟，接着倒平板待其凝固，制成无菌分离培养基备用；
将采集的土壤样品与无菌水混合制备土壤悬液，具体的：将采集的土壤样品与无菌水混合制备土壤悬液，土壤悬液经梯度稀释后涂布于培养基表面，并编号，于30℃恒温培养箱中培养1-2d。吸取不同梯度的土壤悬液需换用不同的吸管。该部分采用常规操作。
步骤2、鉴别产酸菌株
制备产酸鉴别培养基：将1.6％溴甲酚紫加入LB固体培养基，在121℃高温灭菌20分钟，倒平板待其凝固后制成无菌的产酸鉴别培养基备用，其颜色为紫色；
将步骤1培养后的菌株取出，观察菌株形态，挑选出不同形态菌落划线培养于产酸鉴别培养基；
培养1-2d后产酸鉴别培养基由紫色变为黄色则说明该菌株具有产酸能力，若无变化则说明该菌株不具有产酸能力，挑取具有产酸能力的菌株多次划线于产酸鉴别培养基中，获取纯化后的单一菌株；获得单一产酸菌株之后保藏于4℃冰箱中，待后续实验使用。
步骤3、扩大培养
配置LB液体培养基：将酵母提取物5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1L，混合后于121℃高温灭菌20分钟，待用；
将步骤2得到的产酸菌株挑取少量接种于LB液体培养基，于恒温振荡培养箱中以140rpm，保持28℃培养24h，得到大量产酸菌株。
菌株形态观察和生理生化
菌落表面呈圆形，直径为2mm，表面光滑呈淡黄色，中间隆起，边缘整齐。
如图2所示，产酸菌NQ-P4基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树，系统进化分析：将测序结果与GenBank上已登录的基因序列进行比对，发现与假单胞菌属(Pseudomonassp.)同源性最高，为 99.39％。利用MEGA 5软件进行多序列比对分析，Neighbor-joining法构建系统发育树。综合生理生化特征和分子生物学特性，确定产酸菌NQ-P4为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。
如图3可知，产酸菌NQ-P4在LB液体培养基中生长延滞期较短，对数生长期为2-12h，在培养到24h后处于生长的平稳期。生长40h 以后菌株的生物量达到2.1mg·mL-1。产酸菌NQ-P4在培养0-24h时， pH变化幅度为5.7降低至4.06，24h后发酵液pH逐渐上升。
产酸菌NQ-P4在产酸中的应用，利用发酵培养基培养产酸菌 NQ-P4进行产酸，发酵培养基采用葡萄糖20.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉0.5g，L-半胱氨酸0.5g，NaCI 5.0g，KH2PO40.5g，FeSO4·7H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.5g，蒸馏水1L，调整pH为6.5，于121℃高温灭菌20分钟；将产酸菌NQ-P4菌液以2％的添加比例加入发酵培养基，将准备好的发酵培养基于温度为28℃、转速为140rpm条件进行恒温震荡培养。
产酸菌NQ-P4的鉴定方法，包括：利用16S rRNA基因序列对菌种鉴定和发酵培养基内发酵液中有机酸含量的测定。
利用16S rRNA基因序列对菌种鉴定具体为：
目标菌株16S rRNA基因序列的PCR扩增：通过细菌通用引物，包括上游引物Eubac27F：5-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3和下游引物Eubac 1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，在聚合酶的作用下，经预变性、变性、退火、延伸、35个循环、修复延伸、获得目标菌株的16S rRNA基因序列。
发酵培养基内发酵液中有机酸含量的测定具体为：
首先进行0.1mol/L NaOH标准溶液、1％酚酞指示剂的配置。然后准确吸取10.0mL样品发酵液，转移到100mL容量瓶中，加蒸馏水至100mL刻度并摇匀。用滤纸过滤，准确吸取滤液20mL放入100mL 三角瓶中，加入1％酚酞2滴，用0.1mol/L NaOH标准溶液滴定至初显粉色在0.5分钟内不褪色为终点，记下氢氧化钠用量，重复取三次取平均值。并测定空白组消耗NaOH的含量。
产酸菌NQ-P4对重金属Zn、和Pb的耐受性
发酵培养基中添加的Zn2+浓度不高于250mg/L，或Pb2+浓度不高于2000mg/L时，对产酸菌NQ-P4的产酸效果基本无影响。
将产酸产酸菌NQ-P4在不同浓度的Zn2+培养基中培养2d后，测定培养基中的OD600值，随着重金属Zn2+浓度的增加，在Zn2+浓度为 250mg/L时对产酸菌NQ-P4抑制效果很弱，但随着Zn2+浓度的增加，对产酸菌NQ-P4的抑制效果增强，高浓度500-1000mg/L的Zn2+在前48h菌株几乎不生长，随着培养时间的延长菌株开始生长。
产酸菌NQ-P4在未添加重金属的发酵培养基中初始pH值为5.7，然后pH逐渐下降，24h后上升。当Zn2+浓度为250mg/L时，产酸菌 NQ-P4的0-24h产酸效果较未添加重金属培养基变化差别不大。当重金属浓度大于250mg/L时，48h后才开始产酸。
将产酸产酸菌NQ-P4在不同浓度的Pb2+培养基中培养2d后，测定培养基中的OD600值，随着重金属Pb2+浓度的增加，当Pb2+浓度达到2000mg/L时，产酸菌NQ-P4OD600值在1.5左右，抑制效果较弱。
产酸菌NQ-P4在未添加重金属的发酵培养基中初始pH值为5.7，然后pH逐渐下降，12h后上升。当Pb2+浓度为500-1500mg/L时，产酸菌NQ-P4 0-12h时，产酸效果较未添加重金属培养基变化差别不大。当重金属浓度大于2000mg/L时，产酸效果较差。
说明产酸菌NQ-P4耐重金属效果Pb2+＞Zn2+。耐不同重金属时产酸菌NQ-P4仍具有产酸能力。
采用单因素实验法分析不同温度、初始发酵液pH及转速对菌株发酵产酸的影响情况。
发酵培养基采用葡萄糖20.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉0.5g，L- 半胱氨酸0.5g，NaCI5.0g，KH2PO4 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g， MgSO4·7H2O 0.5g，蒸馏水1L，pH调至6.5，于121℃灭菌20分钟；菌液接菌量2％，在恒温振荡培养箱中以140rpm，保持28℃培养24h；
1.温度
温度设置梯度为25℃、28℃、30℃、32℃和35℃，分别测定不同温度下发酵液中pH的变化与发酵液NaOH的消耗量，来确定最佳产酸的温度条件。
如图8-9所示，当培养温度为28℃时，发酵液pH下降能力最大，且消耗NaOH量最多，所以当培养温度达到28℃的时候产酸菌NQ-P4 产酸能力最强。
2.pH
初始发酵液pH设置梯度为5、5.5、6、6.5和7，分别测定不同初始发酵液pH下发酵液中pH的变化与发酵液NaOH的消耗量，来确定最佳产酸的初始发酵液pH条件。
如图10-11所示，当培养初始发酵液pH为6.5时，发酵液pH下降能力最大，且消耗NaOH量最多，所以当培养初始发酵液pH达到 6.5的时候产酸菌NQ-P4产酸能力最强。
3.转速
转速设置梯度为100rpm、120rpm、140rpm、160rpm和180rpm，分别测定不同转速下发酵液中pH的变化与发酵液NaOH的消耗量，来确定最佳产酸的转速条件。
如图12-13所示，当培养转速为140rpm时，发酵液pH下降能力最大，且消耗NaOH量最多，所以当培养初始发酵液转速达到140rpm 的时候产酸菌NQ-P4产酸能力最强。
序列表
<110> 兰州城市学院
<120> 一种产酸菌NQ-P4及其应用与产酸菌NQ-P4的培养、鉴定方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1464
<212> DNA/RNA
<213> 假单胞菌(Pseudomonas sp.)
<400> 1
cagattgaac gctggcggca ggcctaacac atgcaagtcg agcggatgac gggagcttgc 60
tccttgattc agcggcggac gggtgagtaa tgcctaggaa tctgcctggt agtgggggac 120
aacgtttcga aaggaacgct aataccgcat acgtcctacg ggagaaagca ggggaccttc 180
gggccttgcg ctatcagatg agcctaggtc ggattagcta gttggtgggg taatggctca 240
ccaaggcgac gatccgtaac tggtctgaga ggatgatcag tcacactgga actgagacac 300
ggtccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgg acaatgggcg aaagcctgat 360
ccagccatgc cgcgtgtgtg aagaaggtct tcggattgta aagcacttta agttgggagg 420
aagggcagta agttaatacc ttgctgtttt gacgttaccg acagaataag caccggctaa 480
ctctgtgcca gcagccgcgg taatacagag ggtgcaagcg ttaatcggaa ttactgggcg 540
taaagcgcgc gtaggtggtt cgttaagttg gatgtgaaag ccccgggctc aacctgggaa 600
ctgcatccaa aactggcgag ctagagtacg gtagagggtg gtggaatttc ctgtgtagcg 660
gtgaaatgcg tagatatagg aaggaacacc agtggcgaag gcgaccacct ggactgatac 720
tgacactgag gtgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc 780
cgtaaacgat gtcaactagc cgttggaatc cttgagattt tagtggcgca gctaacgcat 840
taagttgacc gcctggggag tacggccgca aggttaaaac tcaaatgaat tgacgggggc 900
ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggcc 960
ttgacatgca gagaactttc cagagatgga ttggtgcctt cgggaactct gacacaggtg 1020
ctgcatggct gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgt aacgagcgca 1080
acccttgtcc ttagttacca gcacgtaatg gtgggcactc taaggagact gccggtgaca 1140
aaccggagga aggtggggat gacgtcaagt catcatggcc cttacggcct gggctacaca 1200
cgtgctacaa tggtcggtac agagggttgc caagccgcga ggtggagcta atctcacaaa 1260
accgatcgta gtccggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagtcgga atcgctagta 1320
atcgcgaatc agaatgtcgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1380
accatgggag tgggttgcac cagaagtagc tagtctaacc ttcgggagga cggttaccac 1440
ggtgtgattc atgactgggg tgaa 1464
Claims (9)
1.一种产酸菌NQ-P4，其特征在于，该菌株命名为：假单胞菌(Pseudomonas sp.)NQ-P4，已于2021年01月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：21592。
2.根据权利要求1所述的产酸菌NQ-P4的培养方法，其特征在于，具体为：
步骤1、菌株的分离培养
采集受重金属污染严重的土壤作为样品；
制备分离培养基：将酵母提取物5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1L，混合后，于121℃高温灭菌20分钟，接着倒平板待其凝固，制成无菌的分离培养基备用；
将采集的土壤样品与无菌水混合制备土壤悬液，土壤悬液经梯度稀释后涂布于培养基表面，并编号，于30℃恒温培养箱中培养1-2d；
步骤2、鉴别产酸菌株
制备产酸鉴别培养基：将1.6％溴甲酚紫加入LB固体培养基，在121℃高温灭菌20分钟，倒平板待其凝固后制成无菌的产酸鉴别培养基备用，其颜色为紫色；
将步骤1培养后的菌株取出，观察菌株形态，挑选出不同形态菌落划线培养于产酸鉴别培养基；
培养1-2d后产酸鉴别培养基由紫色变为黄色则说明该菌株具有产酸能力，若无变化则说明该菌株不具有产酸能力，挑取具有产酸能力的菌株多次划线于产酸鉴别培养基中，获取纯化后的单一菌株；
步骤3、扩大培养
配置LB液体培养基：将酵母提取物5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1L，混合后于121℃高温灭菌20分钟，待用；
将步骤2得到的产酸菌株挑取少量接种于LB液体培养基，于恒温振荡培养箱中以140rpm，保持28℃培养24h，得到大量产酸菌株。
3.根据权利要求1所述的产酸菌NQ-P4在产酸中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，利用发酵培养基培养产酸菌NQ-P4进行产酸，所述发酵培养基采用葡萄糖20.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉0.5g，L-半胱氨酸0.5g，NaCI5.0g，KH2PO4 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，MgSO4·7H2O 0.5g，蒸馏水1L，调节pH为6.5，于121℃高温灭菌20分钟；将产酸菌NQ-P4菌液以2％的添加比例加入发酵培养基，将准备好的发酵培养基于28℃、140rpm的转速下在恒温振荡培养箱中进行培养。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在发酵培养基中添加Zn2+浓度≤250mg/L时，产酸菌NQ-P4正常产酸。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在发酵培养基中添加Pb2+浓度≤2000mg/L时，产酸菌NQ-P4正常产酸。
7.根据权利要求1所述的产酸菌NQ-P4的鉴定方法，其特征在于，包括：利用16S rRNA基因序列对菌种鉴定和发酵培养基内发酵液中有机酸含量的测定。
8.根据权利要求7所述的产酸菌NQ-P4的鉴定方法，其特征在于，利用16S rRNA基因序列对菌种鉴定具体为：
目标菌株16S rRNA基因序列的PCR扩增：通过细菌通用引物，包括上游引物Eubac 27F:5-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3和下游引物Eubac 1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，在聚合酶的作用下，经预变性、变性、退火、延伸、35个循环、修复延伸、获得目标菌株的16S rRNA基因序列。
9.根据权利要求7所述的产酸菌的鉴定方法，其特征在于，发酵培养基内发酵液中有机酸含量的测定具体为：
首先进行0.1mol/L NaOH标准溶液、1％酚酞指示剂的配置，然后准确吸取10.0mL样品发酵液，转移到100mL容量瓶中，加蒸馏水至100mL刻度并摇匀；用滤纸过滤，准确吸取滤液20mL放入100mL三角瓶中，加入1％酚酞2滴，用0.1mol/L NaOH标准溶液滴定至初显粉色在0.5分钟内不褪色为终点，记下氢氧化钠用量，重复取三次取平均值；并测定空白组消耗NaOH的含量。
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