CN113502241B - 一种玫瑰菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种玫瑰菌及其应用。本发明从广东深圳大鹏湾海域近海海底表层10cm处底泥中分离得到一株硝酸盐还原菌，命名为玫瑰菌SN13‑21。玫瑰菌SN13‑21具有较高的生产PHA的能力，在以丙酮酸盐为碳源的液体培养基中发酵培养4天后，其累积PHA占细胞干重比值达到19.9％，在高效产生PHA的领域具有重要意义。

Description

一种玫瑰菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种玫瑰菌及其应用。
背景技术
传统的石油基塑料产品由于其高分子量和复杂的结构而具有不可生物降解的特性，能够在水体、土壤中保留很长时间，给生态环境造成了巨大威胁。生物基聚合物具有良好的生物可降解性、生物相容性以及塑料的热加工性能，适用于广泛的工业应用。因此采用生物基聚合物代替石油基聚合物是一种有效的解决方案，能够显著地减轻塑料使用给生态环境带来的危害。
聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHA)是一种典型的生物基聚合物，能够被细菌产生，并作为细胞内的能量和碳源储存物。研究表明许多海洋细菌都能产生PHA，并且对PHA的构成和微结构已经开展了许多研究，极大地增强了PHA的性能，并促进了其在医学、农业和日用品等领域的应用。能高效产生PHA的海洋细菌对于研究开发海洋生物资源、开发海洋碳汇具有很大的意义。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种玫瑰菌及其应用。
第一方面，本发明提供一种玫瑰菌(Roseibium aggregatum)SN13-21。本发明在从广东深圳大鹏湾海域近海海底表层10cm处底泥中分离得到一株硝酸盐还原菌，命名为玫瑰菌SN13-21，并对其进行了生物保藏，保藏信息如下：
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.22300，保藏日期：2021年5月10号，分类命名：聚团玫瑰菌Roseibiumaggregatum，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。
进一步地，所述玫瑰菌(Roseibium aggregatum)SN13-21的16srDNA的序列如SEQID NO.1所示。
本发明对其进行了形态学观察、生理生化鉴定和16S rDNA序列(16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示)，均和玫瑰菌的一致。
第二方面，本发明提供一种菌剂，包括所述玫瑰菌(Roseibium aggregatum)SN13-21或其发酵液。
进一步地，所述菌剂中PHA占细胞干重比值大于19.9％。
第三方面，本发明提供一种生产PHA的方法，包括：
使用所述玫瑰菌(Roseibium aggregatum)SN13-21或所述菌剂进行发酵培养。
进一步地，所述发酵培养为：
在温度30～35℃的条件下，150～200r/min培养3～6天。
进一步地，所述发酵培养中使用的培养基为：营养肉汤培养基、以葡萄糖为单一碳源的无机盐培养基或以丙酮酸钠为单一碳源的无机盐培养基中的一种或多种。
更进一步，所述营养肉汤培养基包括：10g/L的蛋白胨，5g/L的牛肉膏，5g/L的NaCl，pH 7.0，121℃灭菌25min。
所述以葡萄糖为单一碳源的无机盐培养基包括：10g/L的葡萄糖，9g/L的Na2HPO4，1.5g/L的KH2PO4，1g/L的NH4Cl，0.2g/L的MgSO4，0.02g/L的CaCl2，0.0012g/L的枸椽酸铁铵，加入100μL的微量元素液(1g/L ZnSO4,0.3g/L MnCl2,3g/L H3BO3,2g/L CoCl2,0.1g/LCuCl2,0.2g/L NiCl2,0.3g/L NaMoO4)，pH 7.0，121℃灭菌25min。
M2：10g/L的丙酮酸钠，9g/L的Na2HPO4，1.5g/L的KH2PO4，1g/L的NH4Cl，0.2g/L的MgSO4，0.02g/L的CaCl2，0.0012g/L的枸椽酸铁铵，加入100μL的微量元素液(1g/L ZnSO4,0.3g/L MnCl2,3g/L H3BO3,2g/L CoCl2,0.1g/L CuCl2,0.2g/L NiCl2,0.3g/LNaMoO4)，pH7.0，121℃灭菌25min。
本发明具备如下有益效果：
本发明从广东深圳大鹏湾海域近海海底表层10cm处底泥中分离得到一株硝酸盐还原菌，经鉴定为玫瑰菌，进一步命名为玫瑰菌SN13-21。玫瑰菌SN13-21在利用以丙酮酸钠为单一碳源的无机盐培养基(M2)发酵培养时，具有较强的PHA生产能力，所产的PHB和PHV总累计量占细胞干重比值高，可达到19.9％以上，为生产替代合成塑料的天然高分子生物材料提供了重要的菌株资源和技术手段，具有良好的工业化应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的玫瑰菌SN13-21的制备流程图。
图2为本发明实施例1提供的聚合酶链式反应(PCR)扩增phaC合成酶基因，其DNA产物经琼脂糖凝胶电泳分离后的胶图。
图3为本发明实施例2提供的玫瑰菌SN13-21的在30℃培养1天的菌落图。
图4为本发明实施例2提供的玫瑰菌SN13-21的革兰氏染色图。
图5为本发明实施例2提供的玫瑰菌SN13-21的16S序列构建的系统发育树图。
图6为本发明实施例3提供的玫瑰菌SN13-21的产PHA测定结果图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例中所用的培养基：含油含盐富集培养基，用于菌株的分离，其组成为陈海水中添加1-10％(v/v)的混合植物油(金龙鱼:花生油:菜籽油＝1:1:1)和35-125‰的NaCl。花生油按照GB/T 1534-2017规定大于5％的组成为：棕榈酸(C16:0，8.0-14.0)、油酸(C18:1，35.0-69.0)和亚油酸(C18:2，13.0-43.0)。菜籽油按照GB/T 1536-2004规定大于5％的组成为：棕榈酸(C16:0，1.5-6.0)、油酸(C18:1，8.0-60.0)、亚油酸(C18:2，11.0-23.0)、亚麻酸(C18:2，5.0-13.0)、花生一烯酸(C20:1，3.0-15.0)和芥酸(C22:1，3.0-60.0)。
普通海水培养基(2216E)，用于菌株的纯化培养，其组成按照浓度包括5.0g/L的蛋白胨，1.0g/L的酵母膏，0.1g/L的柠檬酸铁，19.45g/L的NaCl，5.98g/L的MgCl2，3.24g/L的Na2SO4，1.8g/L的CaCl2，0.55g/L的KCl，0.16g/L的Na2CO3，0.08g/L的KBr，0.034g/L的SrCl2，0.022g/L的H3BO3，0.004g/L的Na2O·nSiO2，0.0024g/L的NaF，0.0016g/L的NaNO3，0.008g/L的Na2HPO4，pH为7.6±0.2，121℃下高压蒸汽灭菌25min。
产PHA液体培养基包括营养肉汤培养基(NB)、以葡萄糖为单一碳源的无机盐培养基(M1)和以丙酮酸钠为单一碳源的无机盐培养基(M2)，组分如下：
NB：10g/L的蛋白胨，5g/L的牛肉膏，5g/L的NaCl，pH 7.0，121℃灭菌25min。
M1：10g/L的葡萄糖，9g/L的Na2HPO4，1.5g/L的KH2PO4，1g/L的NH4Cl，0.2g/L的MgSO4，0.02g/L的CaCl2，0.0012g/L的枸椽酸铁铵，加入100μL的微量元素液(1g/L ZnSO4,0.3g/L MnCl2,3g/L H3BO3,2g/L CoCl2,0.1g/L CuCl2,0.2g/L NiCl2,0.3g/L NaMoO4)，pH7.0，121℃灭菌25min。
M2：10g/L的丙酮酸钠，9g/L的Na2HPO4，1.5g/L的KH2PO4，1g/L的NH4Cl，0.2g/L的MgSO4，0.02g/L的CaCl2，0.0012g/L的枸椽酸铁铵，加入100μL的微量元素液(1g/L ZnSO4,0.3g/L MnCl2,3g/L H3BO3,2g/L CoCl2,0.1g/L CuCl2,0.2g/L NiCl2,0.3g/LNaMoO4)，pH7.0，121℃灭菌25min。
实施例1玫瑰菌SN13-21的分离与筛选
本实施例提供了玫瑰菌SN13-21的制备流程，参考图1，具体步骤如下：
1、可培养菌株的分离
采集广东深圳大鹏湾海域近海海底表层10cm处底泥；将采集的底泥样品加入装有100mL已灭菌的含油含盐富集培养基的锥形瓶中，30℃、160r/min下恒温震荡培养77天，每7天以1％的接种量转接至含新鲜的培养基富集培养基中，同时提高含油量1％、盐度10‰，培养第7、42和77天取1mL土壤悬浮液；将所述底泥悬浮液梯度稀释，制成10-3至10-5浓度的土壤悬浮液；将所述稀释的底泥悬浮液加入至2216E培养基平板进行涂布处理，30℃恒温培养箱培养48h后得到菌落；挑取形态各异的单菌落进行划线纯化培养，低温保藏菌种。
2.产PHA菌株的筛选
采用菌落PCR方法对所述菌种的phaC基因进行鉴定。挑取单菌落加入含50μL无菌水的灭菌PCR管中，95℃、10min得到菌落PCR模板。phaC基因正向引物为PHACGNF(5’-CCYRGATCAACAA GTTCTAC-3’)，反向引物为PHACGNR(5’-TTCCAGAACAGMAGG TCGAAGG-3’)。
PCR反应体系为：2×PCR Master Mix 25μL；正向引物和反向引物各1μL；模板1μL；ddH2O补足50μL。
PCR反应条件为：在温度为94℃预变性6min；94℃变性45s，54℃退火30s；72℃延伸90s，31循环；72℃延伸10min，4℃保存。将得到的PCR产物进行120V、30min、1％的琼脂糖凝胶电泳，蓝光透色仪观察胶体，有条带的样品即为phaC基因阳性菌株，将其命名为SN13-21，其电泳图请参考图2。
实施例2玫瑰菌SN13-21的鉴定
本实施例对实施例1得到的玫瑰菌SN13-21进行鉴定，包括形态学观察、生理生化鉴定和16S rDNA序列分析，具体如下：
1、形态学鉴定
将实施例1提供的玫瑰菌SN13-21划线到2216E固体培养基上，然后将平板倒转，在温度30℃的条件下培养24h，观察并记录平板上菌落的生长情况。玫瑰菌SN13-21的菌落形态请参考图3。从图3能够看出菌株的菌落呈浅黄色、圆形、边缘不整齐，表面呈黏液状，湿润光滑。
用试剂盒对玫瑰菌SN13-21进行革兰氏染色，并在油镜下观察菌株，该菌株的革兰氏染色图见图4。从图4能够看出菌株呈红色，为革兰氏阴性菌。
2、生理生化鉴定
参照《常见细菌系统鉴定手册》中的生理生化鉴定指标，对实施例1提供的玫瑰菌SN13-21进行生理生化鉴定。
本实施例提供的菌株的生理生化鉴定指标包括过氧化氢酶能力、甲基红MR实验、VP实验、氧化酶能力、淀粉水解能力、产硫化氢能力、硝酸盐还原能力、丙二酸盐利用能力、柠檬酸盐利用能力、明胶液化能力。生理生化鉴定结果如表1。
表1本菌株的生理生化鉴定结果
表性特征 反应特征 表性特征 反应特征
过氧化氢酶 + 产硫化氢 +
MR实验 - 硝酸盐还原 +
VP实验 - 丙二酸盐利用 +
氧化酶 + 柠檬酸盐利用 -
淀粉水解 - 明胶液化 -
表中，+表示本菌株有反应或可以利用，-表示本菌株没有反应或不可以利用。
3、16S rDNA序列分析
本发明实施例采用Ezup细菌基因组DNA抽提试剂盒提取菌株S N3-21中的DNA。PCR扩增的正向引物为27F(5’-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3’)，反向引物为1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGAC TT-3’)。
PCR反应体系为：2×PCR Master Mix 25μL；正向引物和反向引物各1μL；模板1μL；ddH2O补足50μL。
PCR反应体系为：在温度为94℃预变性4min，1个循环；94℃变性45s，55℃退火45s；72℃延伸90s，30个循环；4℃保存。
PCR产物由上海生工生物工程股份有限公司进行测序，测序结果如SEQ ID NO.1所示。将所得序列在GenBank中进行Blast相似性比对，得到相似性较高的序列。运用MEGA7.0软件构建菌株的系统发育树，本菌株的16S rDNA序列与玫瑰菌(Roseibium aggregatum)的同源性达到99.9％，本菌株的系统发育树见图5。
综合上述形态学观察、生理生化鉴定及16S rDNA序列分析结果，能够确定本菌株SN13-21为玫瑰菌(Roseibium aggregatum)，其被命名为玫瑰菌SN13-21，
保藏编号：CGMCC No.22300，保藏日期：2021年5月10号，分类命名：聚团玫瑰菌Roseibium aggregatum，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。
实施例3玫瑰菌SN13-21的产PHA能力测定
本实施例对玫瑰菌SN13-21进行了产PHA能力的测定，该测定包括以下内容：
1.PHA的提取
将本发明实施例1得到的玫瑰菌SN13-21接种至液体培养基中，于30℃，150r/min条件下恒温震荡培养4天。培养结束后，取发酵液在5000r/min下离心20min，获得细胞沉淀，然后进行冷冻干燥处理；称取10mg的细菌冻干样品，放入脂化管中，然后加入1mL的氯仿(含0.5mg/mL苯甲酸甲酯)和1mL含15％(v/v)浓硫酸的甲醇溶液，在100℃油浴下密封处理2.5h，进行甲酯化反应；反应结束后，将样品冰浴冷却5min，然后加入0.5mL去离子水，充分混匀30s，在3500r/min下离心分层10min，取下层氯仿相用于色谱分析。
所述液体培养基包括营养肉汤培养基(NB)、以葡萄糖为单一碳源的无机盐培养基(M1)和以丙酮酸钠为单一碳源的无机盐培养基(M2)，组分如下：
NB：10g/L的蛋白胨，5g/L的牛肉膏，5g/L的NaCl，pH 7.0，121℃灭菌25min。
M1：10g/L的葡萄糖，9g/L的Na2HPO4，1.5g/L的KH2PO4，1g/L的NH4Cl，0.2g/L的MgSO4，0.02g/L的CaCl2，0.0012g/L的枸椽酸铁铵，加入100μL的微量元素液(1g/L ZnSO4,0.3g/L MnCl2,3g/L H3BO3,2g/L CoCl2,0.1g/L CuCl2,0.2g/L NiCl2,0.3g/L NaMoO4)，pH7.0，121℃灭菌25min。
M2：10g/L的丙酮酸钠，9g/L的Na2HPO4，1.5g/L的KH2PO4，1g/L的NH4Cl，0.2g/L的MgSO4，0.02g/L的CaCl2，0.0012g/L的枸椽酸铁铵，加入100μL的微量元素液(1g/L ZnSO4,0.3g/L MnCl2,3g/L H3BO3,2g/L CoCl2,0.1g/L CuCl2,0.2g/L NiCl2,0.3g/LNaMoO4)，pH7.0，121℃灭菌25min。
2.PHA的含量测定
本实施例测定的PHA的单体组成包括聚3-羟基丁酸酯(PHB)和聚羟基戊酸酯(PHV)。
本实施例采用气相色谱仪分析甲酯化产物样品，以测定PHA的含量，选用DB-WAX型号色谱柱作为固定相，使用惰性气体氦气作为流动相，进样量为1μL，进样温度250℃，流速0.7mL/min。使用分析纯级别的聚3-羟基丁酸酯(PHB)和聚羟基戊酸酯(PHV)作为标准物，定性分析菌株SN13-21合成的PHA，以苯甲酸甲酯作为内标物，用内标法作定量分析。称取一定梯度质量的PHA产物进行甲酯化预处理，气相分析后，读取PHA单体峰面积/内标峰面积的比值与单体质量/内标物的质量的数据做标准曲线，该标准曲线用于定量分析干细胞中的PHA含量。
上述标准曲线按下式计算：
PHA含量(％)＝PHA浓度(g/L)/CDW(g/L)×100％
其中CDW为菌株的细胞干重。
3.测定结果
本实施例对玫瑰菌SN13-21产PHA能力的测定结果如图6所示，从图6中可以看出利用营养肉汤培养基(NB)、以葡萄糖为单一碳源的无机盐培养基(M1)和以丙酮酸钠为单一碳源的无机盐培养基(M2)发酵培养时，菌株均合成两种不同种类的PHA：聚3-羟基丁酸酯(PHB)和聚羟基戊酸酯(PHV)。
营养肉汤培养基(NB)培养4天后PHA总累计量占细胞干重比值达到0.8％，其中PHB相对占比79.0％，PHV相对占比21.0％。
以葡萄糖为单一碳源的无机盐培养基(M1)培养4天后，PHA总累计量占细胞干重比值达到2.4％，其中PHB相对占比92.0％，PHV相对占比8.0％。
以丙酮酸钠为单一碳源的无机盐培养基(M2)培养4天后，菌株SN13-21产PHA的能力最强，其总累计量占细胞干重比值达到19.9％，其中PHB相对占比98.0％，PHV相对占比2.0％，具有良好的工业化应用前景。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京大学深圳研究院
<120> 一种玫瑰菌及其应用
<130> KHP211115300.4
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1386
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (8)

1.一种玫瑰菌(Roseibium)SN13-21，其特征在于，所述玫瑰菌SN13-21的保藏编号为CGMCC No.22300。
2.根据权利要求1所述的玫瑰菌SN13-21，其特征在于，所述玫瑰菌SN13-21的16s rDNA的序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种菌剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述玫瑰菌SN13-21或其发酵液。
4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中PHA占细胞干重比值大于19.9％；所述PHA为聚3-羟基丁酸酯和聚羟基戊酸酯。
5.一种生产PHA的方法，其特征在于，包括：
使用权利要求1或2所述玫瑰菌SN13-21或权利要求3或4所述菌剂进行发酵培养；所述PHA为聚3-羟基丁酸酯和聚羟基戊酸酯。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养为：
在温度30～35℃的条件下，150～200r/min培养3～6天。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养中使用的培养基为：营养肉汤培养基、以葡萄糖为单一碳源的无机盐培养基或以丙酮酸钠为单一碳源的无机盐培养基中的一种或多种。
8.权利要求1或2所述玫瑰菌SN13-21或权利要求3或4所述菌剂在生产PHA中的应用；
所述PHA为聚3-羟基丁酸酯和聚羟基戊酸酯。
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