CN111733100B - 一株降解聚乙烯地膜的申氏不动杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株可降解聚乙烯地膜的新疆乌苏泥火山细菌及其应用。该菌株为申氏不动杆菌（Acinetobacter schindleri）WS‑9‑2，是从新疆特殊地理环境泥火山中分离筛选获得，已于2019年11月13日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.18947。该菌株能利用聚乙烯为唯一碳源进行生长并且能附着于聚乙烯地膜膜片上形成密集的生物膜，侵蚀、高效降解聚乙烯地膜，对地膜降解30天的失重率达6.56%。具有耐高低温、耐盐、耐酸碱、耐干旱等抗逆性，为聚乙烯地膜的生物降解提供了具有较强环境适应性的新的菌种资源。
Description
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，涉及一株从新疆本地特殊地质环境乌苏泥火山中分离出具有耐高温、耐盐、耐酸碱、耐干旱，并能够高效降解聚乙烯地膜的申氏不动杆菌及其应用。
背景技术
聚乙烯(Polyethylene, PE)是线性的饱和碳氢化合物。在我国农业生产中，以聚乙烯为主要成分的塑料地膜已经广泛应用四十多年。我国农用塑料地膜产量和用量均居世界首位，产量达100万吨以上，是其他所有国家总和的1.6倍，未来10年我国地膜覆盖面积每年仍将以10%的速度增加。地膜覆盖技术给农业带来了白色革命，在西部干旱、半干旱气候条件下，地膜的保墒保水作用尤为显著，具有显著的增产效果，但同时也带来了严重的“白色污染”问题。聚乙烯地膜在自然界几乎不能被降解，在土壤中可稳定存在200~400年，但聚乙烯具有高分子量、表面活化能较低、强疏水性以及缺乏被微生物酶系统所利用的功能团等原因，导致聚乙烯在自然环境中降解速度非常缓慢。同时造成土壤通透性、土壤微生物活动和土壤肥力水平降低，还可能导致地下水下渗困难，加重土壤次生盐碱化等问题。目前国内报道处理聚乙烯的方法，如焚烧、填埋、光氧化降解、热降解、机械降解、催化降解及生物降解等。非生物降解处理方式会产生大量的有害气体污染空气，占用大量土地，会造成土壤环境不稳定，而聚乙烯地膜中部分添加剂中含有不同过渡金属配合物，再次对环境有严重污染，以上方法成本高、易造成二次污染、适用范围狭窄等特点，未能从源头上彻底消除环境污染。而采用生物降解不仅能耗低且不会造成二次污染，因此生物降解是绿色环保的降解方式。
新疆泥火山多形成在油、气藏发育地区，其周边蕴藏着丰厚的油气资源。在喷出的泥浆内混有原油及甲烷等为主要成分的烃类气体，与聚乙烯的化学结构相似。在这种特殊的地质环境下生存的微生物类群，通过长期进化产生了对环境的适应能力，从中孕育出能够利用聚乙烯作为营养物质的微生物种群。因此从其特殊环境中筛选对聚乙烯地膜高效降解的细菌菌株，对于减少“白色污染”具有积极的意义。
发明内容
本发明针对聚乙烯在环境中难以降解的问题，已有的研究中筛选出的聚乙烯降解菌株十分有限，不同菌株对聚乙烯的降解效率差异大，缺乏高效菌株；本发明旨在提供一种经鉴定为耐高温，耐盐，耐酸碱，耐干旱的，并能够高效降解聚乙烯地膜的申氏不动杆菌及其应用，为聚乙烯地膜的降解提供新的菌源。
本发明所提供的一株可降解聚乙烯地膜的细菌菌株，为申氏不动杆菌（Acinetobacter schindleri）WS-9-2。该菌株已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。保藏日期为2019年11月13日，保藏编号为CGMCC No.18947。
本发明所述的可降解聚乙烯地膜的申氏不动杆菌WS-9-2分离自新疆本地天山北麓乌苏市南约40 km白杨沟镇泥火山。
本发明所述的可降解聚乙烯地膜的申氏不动杆菌WS-9-2应用于降解聚乙烯地膜菌剂的制备。
本发明所述的可降解聚乙烯地膜的申氏不动杆菌WS-9-2应用于农田土壤中聚乙烯地膜的降解。
具体的本发明从新疆本地天山北麓乌苏市南约40 km白杨沟镇泥火山，通过采集泥火山泥水混合液，梯度稀释后富集培养，转接至以聚乙烯膜片或粉末为唯一碳源的培养基中共培养，从中分离、筛选获得一株能够利用聚乙烯为唯一碳源的降解菌WS-9-2。该菌株生物学特性如下：生长最适温度为35℃，好氧性培养物。在LB平板培养基上，形成圆形、表面湿润、平坦有光泽、边缘整齐、淡黄色菌落。光学显微镜下为长杆状，无芽孢，无鞭毛，革兰氏染色阴性。经对所分离菌株WS-9-2的16S rDNA基因序列测定，结果发现本发明提供的菌株其16S rDNA基因序列与申氏不动杆菌（Acinetobacter schindleri）模式菌株的同源性最高，相似性达98.8%，结合生理生化测定从而确定分离出的细菌菌株WS-9-2为申氏不动杆菌(Acinetobacter schindleri)。
进一步，通过对申氏不动杆菌WS-9-2进行实验室人工模拟各种胁迫环境，即耐盐、耐酸碱、耐干旱及耐高温处理，通过测定对聚乙烯地膜的降解性能，即通过聚乙烯膜失重率、表面形态变化、表面化学官能团变化，聚乙烯膜片的力学性能的测定，发现分离菌株申氏不动杆菌(Acinetobacter schindleri)WS-9-2是一株能高效降解聚乙烯地膜，同时具有优良抗逆能力的功能菌株。具有以下有益效果：
（1）本发明提供的一株从新疆天山北麓乌苏市南约40 km白杨沟镇泥火山筛选出可降解聚乙烯地膜的申氏不动杆菌(Acinetobacter schindleri)WS-9-2菌株，在其他研究中还未见报道。
（2）本发明获得的聚乙烯地膜降解细菌申氏不动杆菌(Acinetobacter schindleri)WS-9-2菌株，能够利用聚乙烯为唯一碳源生长并且能聚集附着于膜片上形成密集的生物膜，侵蚀、高效降解聚乙烯地膜。该菌株30 d对聚乙烯地膜膜片的降解率可达6.56%，现国内报道的从不同环境分离获得的聚乙烯地膜降解菌的60 d降解率一般为5%。
（3）本发明的聚乙烯地膜降解菌株申氏不动杆菌(Acinetobacter schindleri)WS-9-2具有较强的抗逆能力，对盐、高温、酸碱、干旱等不利环境因子表现出很强的耐受性。能够耐受5.0%NaCl盐离子浓度，在pH 5.0~9.0，-0.6~-1.6 mPa渗透势，10~40℃生长温度范围内均可生长，为聚乙烯地膜的生物降解提供了具有较强的环境适应性的高效菌种资源。
（4）本发明的降解菌株WS-9-2能在LB培养基中生长良好，易于培养，便于开发研制成降解菌剂，在加速聚乙烯地膜残留物降解中具有良好的应用前景且丰富了菌种来源。
附图说明
图1所示为申氏不动杆菌WS-9-2在LB培养基上的菌落形态。
图2 所示为基于16S rDNA基因构建的申氏不动杆菌WS-9-2的系统发育树。
图3 所示为聚乙烯降解菌降解30天后聚乙烯膜片在场发射电子扫描电镜下观察到的形貌特征图，A:为对照；B:接菌WS-9-2。
图4 所示为申氏不动杆菌WS-9-2降解聚乙烯地膜前后聚乙烯膜片表面官能团变化图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
本领域技术人员应理解，这些实施例仅用于说明本发明而绝不对本发明的范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。
本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例1. 泥火山中菌群的富集及聚乙烯降解菌的分离与筛选
（1）泥火山中菌群的富集
以新疆本地乌苏泥火山和克拉玛依市独山子区泥火山为分离材料，称取泥浆样品10 g加入装有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分振荡之后，过滤制成泥浆浸出液；吸取10 mL泥浆浸出液分别加到装有50 mL富集培养基A和富集培养基B的250 mL锥形瓶中，置于恒温振荡器中30℃、160 r/min 富集培养3 d。
将聚乙烯地膜统一剪成4.0×4.0 cm大小，约0.005 g的膜片，用0.5% KCl溶液浸泡1 h，再用100%无水乙醇清洗3-4次，无菌蒸馏水润洗，放入干燥无菌的培养皿中烘干，在紫外灯下照射灭菌4 h（0.25 h翻动1次）后，加入到经高压蒸汽灭菌处理的50 mL基础无机盐培养液中。同时移入5mL泥火山菌群富集液，30℃，160 r/min下振荡进行共培养10 d后，再按5%的接种量将培养液接入新鲜的含聚乙烯地膜的基础无机盐培养液中培养10 d。
富集培养基A：酵母膏10 g、K2HPO4 0.7 g、KH2PO4 0.7 g、MgSO4.7H2O 0.7 g、NH4NO31.0 g、NaCl 0.005 g、FeSO4.7H2O 0.002 g、ZnSO4.7H2O 0.002 g、MnSO4.H2O 0.001 g、蒸馏水1000 mL、pH 7.2。
富集培养基B：牛肉膏3 g、蛋白胨3 g、酵母膏5 g、K2HPO4 0.7 g、KH2PO4 0.7 g、MgSO4.7H2O 0.7 g、NH4NO3 1.0 g、NaCl 0.005 g、FeSO4.7H2O 0.002 g、ZnSO4.7H2O 0.002g、MnSO4.H2O 0.001 g、蒸馏水1000 mL、pH 7.2。
基础无机盐培养基：K2HPO4 0.7 g，CaCl2.2H2O 0.7 g，KCl 0.5 g，MgSO4.7H2O 0.7g，NH4NO3 1.0 g，NaCl 0.005 g，ZnSO4.7H2O 0.002 g，MnSO4.H2O 0.001 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0-7.2。
（2）聚乙烯降解菌的分离
将聚乙烯粉末放置于无菌干燥的培养皿上，平铺成薄层，在紫外灯下照射灭菌3 h（0.25 h翻动一次）后，加入到灭菌并熔化的基础无机盐固体培养基中，制成以聚乙烯（10g/L）为唯一碳源的培养基。倒平板、待平板培养基冷却凝固后，在每个平板分别涂布0.7 mL的泥火山菌群富集液，30℃恒温培养箱培养7-10 d。挑取能在此培养基上生长的细菌菌株，并在该培养基上反复多次划线分离、纯化，获得单菌落，4℃保存备用。
（3）聚乙烯降解菌的筛选
将筛选获得的以聚乙烯为唯一碳源的菌株接种于含定量聚乙烯膜片的基础无机盐培养基中共培养5 d，测定聚乙烯膜片的失重率，比较各菌株的降解能力。将初筛出的降解性能较高的菌株进一步测定10 d，20 d，30 d聚乙烯膜片的失重率，从中复筛出一株降解性能最高的菌株。
聚乙烯膜片的失重率测定：将聚乙烯膜片用2% SDS溶液浸泡4 h，再用无菌水振荡清洗3次以去除膜表面附着的细菌，40℃干燥后，用万分之一天平精确称重膜片质量。地膜失重率（%）=（处理前膜片初始质量-接种处理后膜片质量）/处理前膜片质量×100%
通过初筛，从乌苏泥火山和独山子泥火山中共获得21株聚乙烯降解菌株，如表1所示，进一步复筛出一株降解性能最高的菌株WS-9-2，30 d降解率为6.56%，如表2所示。
表1 分离菌株降解聚乙烯膜片的初筛结果
WS-乌苏泥火山；DSZ-独山子泥火山。
表2降解菌10-30 d复筛后失重率
实施例2. 聚乙烯降解菌株WS-9-2的鉴定
（1）菌株的形态和培养特征观察
将菌株WS-9-2接种在LB固体培养基上进行培养，培养48 h后形成圆形、表面湿润、平坦有光泽、边缘整齐、淡黄色菌落，如附图1 所示。光学显微镜下为长杆状，无芽孢，无鞭毛，革兰氏染色呈红色，革兰氏染色阴性。
（2）菌株16S rDNA基因的序列测定及分析
提取WS-9-2菌株总DNA为模板进行PCR扩增，引物为以细菌16S rRNA通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1429R（5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'）。PCR反应体系为25 μL：DNA模板1.0 μL，10μmol/L 27F/1429R各1.0 μL，10 mmol/L dNTPs 1.5 μL，10×PCRBuffer(2.5 mmol/L MgCl2) 2.5 µL，2.5 U/μL TaqDNA 聚合酶0.5 μL，补足灭菌超纯水至25 μL。反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸1.5 min，35个循环；72℃延伸7 min，4℃保存。扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测后，由上海生工生物工程股份有限公司对PCR产物进行克隆测序，测序结果见SEQ ID No: 1。
将所得的序列结果在美国国立生物信息中心（NCBI）进行BLAST检索，选择相似性高的模式菌株作为参比菌株，利用MEGA5.0软件中的邻接法（Neighbor-joining）构建16SrDNA 基因系统发育树，自展值（Bootstrap）1000。结果如附图2所示，菌株WS-9-2与不动杆菌属(Acinetobacter sp.)不同种菌株聚在一个大分支上，并且与申氏不动杆菌（Acinetobacter schindleri）的模式菌株聚为一簇，同源性最高达到98.8%。
（3）WS-9-2的生理生化鉴定
细菌菌株WS-9-2的生理生化鉴定主要参照《常见细菌系统鉴定手册》和《微生物学实验》，鉴定结果如表3所示，WS-9-2菌株的生理生化特性符合不动杆菌属的特征，其中与申氏不动杆菌（Acinetobacter schindleri）模式菌株最为相似。
表3 菌株WS-9-2生理生化特性测定结果
注: +：阳性； −：阴性；ND：未测定。
基于以上生物学特征，将菌株WS-9-2鉴定为申氏不动杆菌（Acinetobacter schindleri）。该菌株已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。保藏日期是2019年11月13日，保藏编号为CGMCC NO.18947。
实施例3. 申氏不动杆菌WS-9-2菌株降解聚乙烯膜片的应用验证试验
将聚乙烯地膜剪成4.0×4.0 cm大小约0.005 g的膜片，用3% KCl溶液浸泡1 h，再用100%无水乙醇清洗3-4次，最后无菌蒸馏水清洗，放入干燥无菌的培养皿中烘干后在紫外灯下照射灭菌3 h。在无菌条件下，将WS-9-2(接种量为10%)加入含聚乙烯膜片的基础无机盐液体培养基中（装液量100 mL/500 mL锥形瓶），160 r/min，30℃恒温摇床震荡培养30 d，以不接菌为对照，设5个平行，重复3次。经过30 d处理后聚乙烯膜用2% SDS溶液浸泡4 h，再用无菌水清洗几次去除膜表面附着的菌，40℃烘干后，分析聚乙烯膜失重率、表面形态变化、表面官能团变化，聚乙烯膜力学性能变化。所述基础无机盐培养基的成分同实施例1所述。
聚乙烯膜失重率测定：精确称重聚乙烯膜片质量，计算失重率。结果表明，聚乙烯膜片在与接种申氏不动杆菌WS-9-2共培养30天后失重率达6.56%。
聚乙烯膜表面形态变化测定：经30 d接菌处理后的聚乙烯膜片，固定喷金后，利用场发射扫描电镜观察聚乙烯膜表面形态的微观变化。结果如附图3所示，经30 d接菌降解后的聚乙烯膜片表面变得粗糙，出现明显的侵蚀孔洞和清晰的裂痕，而对照组的膜片表明则光滑完整，无任何变化。
表面官能团变化测定：采用傅里叶红外光谱仪（Bruker Vertex 70）测定聚乙烯膜片的表面化学官能团变化。扫描波长范围为1000-3500 cm-1，分辨率为4.0 cm-1，扫描次数100次。结果如附图4所示，经过30 d接菌降解后的聚乙烯膜与对照相比，傅立叶变换红外(FTIR)光谱出现一些波长峰的消减，消失的振动峰主要在1742 cm-1、1300 cm-1，1081 cm-1位置偏移，其中聚乙烯C-H伸缩振动峰在2148 cm-1，1304 cm-1处削弱，表明申氏不动杆菌WS-9-2对聚乙烯膜有降解的能力。
聚乙烯膜力学性能测定：采用RGM-4002型微机控制电子万能试验机，按GB/T1040.3-2006标准执行，拉伸速度50 mm/min，检测接菌降解处理30 d后聚乙烯膜片的拉伸强度，断裂伸长率和弹性模量等力学性能。结果显示，经30 d接菌降解后的聚乙烯膜拉伸强度由对照的228.5 Mpa减小到135.6 Mpa；断裂伸长率对照为342.5 Mpa减小到252.5 Mpa；弹性模量为17.411 Mpa减小到11.272 Mpa。表明经30 d接菌降解后，聚乙烯膜片的断裂伸长率和拉伸强度下降较大，抵抗弹性变形能力降低，说明申氏不动杆菌WS-9-2减小了聚乙烯膜片分子间作用力，使力学性能下降。
实施例4. 聚乙烯降解菌WS-9-2的抗逆能力测定
对申氏不动杆菌WS-9-2的抗逆能力主要进行了耐盐、耐酸碱、耐干旱及生长温度范围测定。以LB培养基为基础培养基，均以pH 7.0，30℃培养的LB液体培养基作为阳性对照，每个处理设重复3次。耐盐、耐酸碱、耐干旱能力的测定均是将菌株在LB培养基平板上活化后，接种于LB液体培养基中，30℃，160 r/min培养24 h（OD600值0.800）作为接种液，以2%的接种量接种于各处理的培养液中，30℃，160 r/min震荡培养24 h，UV-2000型分光光度计在600 nm波长处测定各处理菌悬液的光密度值，作为菌株生长量指标。每个处理5个平行样，重复3次，每组试验重复3次。
耐盐性测定：配制含NaCl的LB培养液，其中NaCl的质量体积分数为0%、0.1%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%。
耐酸、碱能力测定：用NaOH或HCl调节LB培养液初始pH值，pH值依次为5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0、11.0。
耐干旱性测定：用聚乙二醇6000（Polyethylene Glycol 6000，PEG 6000）人工模拟干旱条件，在基础培养基中加入不同量的PEG6000，使培养液的渗透势Ψ分别为0、-0.6mPa、-0.8 mPa、-1.0 mPa、-1.2 mPa、-1.4 mPa、-1.6 mPa共7个水平。
生长温度范围测定：共设7个温度处理，分别在10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃恒温摇床中培养24h后测定OD600值。
试验结果表明申氏不动杆菌WS-9-2抗逆能力较强。具有较强的耐盐能力，在含0%~5% NaCl培养液中均能生长，当NaCl浓度达到5%时，申氏不动杆菌WS-9-2也能良好的生长，菌液OD600值为1.716，表现出一定的耐盐性；申氏不动杆菌WS-9-2在pH 5.0-pH 9.0之间能维持较高的生长量，表明菌株有较广的酸碱适应范围。申氏不动杆菌WS-9-2能在渗透势-0.6~-1.6 mPa范围内生长，在渗透式-1.6 mPa处理下生长OD600值达到0.803，说明该菌株有较好的耐干旱能力；申氏不动杆菌WS-9-2的生长温度范围较广，在10~40 ℃温度范围内均能生长，最适温度为35℃且菌液OD600值为2.154，在40℃时良好生长，OD600值为2.002，说明该菌株具有一定的耐热性。
如上述所述，即可较好的实现本试验，上述的实施例仅仅是对本试验的优选实施方式进行描述，并非对本试验的范围进行限定，在不脱离本试验设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本试验的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本试验保护确定的保护范围内。
序列表
<110> 新疆农业大学
<120> 一株降解聚乙烯地膜的申氏不动杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 1475
<212> DNA
<213> 申氏不动杆菌WS-9-2(Acinetobacter schindleri )
<400> 2
tctcagagtt ggatcctggc tcagattgaa cgctggcggc aggcttaaca catgcaagtc 60
gagcggggag aggtagcttg ctacatgtcc tagcggcgga cgggtgagta atgcttagga 120
atctgcctat tagtggggga caacgttccg aaaggaacgc taataccgca tacgtcctac 180
gggggaaagc aggggatctt cggaccttgc gctaatagat gagcctaagt cggattagct 240
agttggtggg gtaaaggcct accaaggcga cgatctgtag cgggtctgag aggatgattc 300
gccacactgg gaatgagacc cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg 360
gacaatgggc gcaagcctga tccagccatg ccgcgtgtgt gaagaaggcc ttttggttgt 420
aaagcacttt aagcgaggag gaggctcctt tagttaatac ctaaagtgag tggacgttac 480
tcgcagaata agcaccggct aactctgtgc cagcagccgc ggtaatacag agggtgcgag 540
cgttaatcgg atttactggg cgtaaagcgt gcgtaggcgg ctttttaagt cggatgtgaa 600
atccctgagc ttaacttagg aattgcattc gatactggaa agctagagta tgggagagga 660
tggtagaatt ccaggtgtag cggtgaaatg cgtagagatc tggaggaata ccgatggcga 720
aggcagccat ctggcctaat actgacgctg aggtacgaaa gcatggggag caaacaggat 780
tagataccct ggtagtccat gccgtaaacg atgtctacta gccgttgggg cctttgaggc 840
tttagtggcg cagctaacgc gataagtaga ccgcctgggg agtacggtcg caagactaaa 900
actcaaatga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgatgca 960
acgcgaagaa ccttacctgg ccttgacata ctaagaactt tccagagatg gattggtgcc 1020
ttcgggaact tagatacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg 1080
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ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg agtttgttgc accagaagta ggtagtctaa 1440
ccgcaaggag gacgcttacc acgggggccc gagac 1475
Claims (4)
1.一株降解聚乙烯地膜的申氏不动杆菌，其特征在于，所述菌株保藏名称为申氏不动杆菌(Acinetobacterschindleri)WS-9-2，保藏编号为CGMCCNo.18947。
2.如权利要求1所述的申氏不动杆菌，其特征在于，基因序列如SEQ ID NO:1所示。
3.权利要求1所述的申氏不动杆菌的应用，其特征在于，应用于降解聚乙烯地膜菌剂的制备。
4.权利要求1所述的申氏不动杆菌的应用，其特征在于，应用于农田土壤中聚乙烯地膜的降解。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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