CN104232501B - 一株降解聚乙烯的肠杆菌及其应用 - Google Patents

一株降解聚乙烯的肠杆菌及其应用 Download PDF

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本发明公开了降解聚乙烯的肠杆菌及其应用。本发明提供的菌株为肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)YZ1 CGMCC No.6816。本发明提供的菌剂活性成分为肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)YZ1 CGMCC No.6816。本发明提供的菌株对聚乙烯塑料能够有效的侵蚀和降解。本发明提供的菌剂，生产成本低，能够在60天内降解5%(质量百分比)的聚乙烯。本发明所提供的菌株和菌剂可以适用于垃圾填埋场和各种水体和土壤环境中的聚乙烯废物，能够保证聚乙烯能被生物降解。本发明提供的筛选能够高效降解塑料的微生物的方法可以快速有效地获得高纯度、高活性的可降解塑料的微生物。本发明能够为解决当前聚乙烯塑料废物对环境的污染和大量占用填埋场填埋容量的问题提供技术和方法，对于保护环境和降低垃圾的处理成本具有重要意义。

Description

一株降解聚乙烯的肠杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术和环境技术领域。具体而言，本发明涉及筛选可快速降解塑料的微生物的方法及该微生物的用途。
背景技术
随着人类社会的不断发展，人口的增加及技术的不断进步，塑料已经应用在了人类生活和生产的各个方面。聚乙烯以其优良的性能已成为人们生活生产中使用广泛，极其重要的产品，其是合成树脂中产量最高的品种，约占塑料总产量的四分之一。全球2011年聚乙烯产量已经达到1.32×109吨。然而，由于聚乙烯在自然环境中极难降解，因此如何处理废旧聚乙烯已成为了一大难题。
目前，焚烧和填埋是最常用的处理方法。焚烧过程中会产生大量二氧化硫、氮氧化物、二恶英等有害气体，给环境带来二次污染；而填埋处理将会占用大量土地。据报道，未经前处理过的聚乙烯在土壤中填埋30年，其矿化率不到0.2%。
为了解决由于废旧塑料引起的环境污染问题，世界各国研究人员都在努力探寻一种有效处理塑料的方法。一方面为对聚乙烯塑料进行改性，即向传统塑料中加入一些促进降解的添加剂（如过渡金属络合物等光敏剂），或者共混添加易降解的天然高分子（如淀粉，纤维素，蛋白质等）。但是这种方法成本高，不耐用，聚乙烯的原有性质得不到保证。另一方面采用物理或化学方法处理聚乙烯，如对其进行减容、切碎、直接热裂解、催化裂解、超临界流体技术等，处理后使聚乙烯降解成低分子产物，产物可作为化工原料重新利用。然而这种方法成本高，耗能巨大，降解效果不稳定。
因此，目前对于废旧塑料的处理方法还有待进一步改进。
发明内容
本发明的目的是旨在提供一株降解聚乙烯的肠杆菌株及其应用。
本发明提供的肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)，名称为YZ1，属于生癌肠杆菌(Enterobacter cancerogenus),已于2012年11月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.6816。
本发明还保护一种菌剂，它的活性成分为肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)YZ1 CGMCC No.6816。
所述菌株和/或菌剂在降解聚乙烯塑料中的应用属于本发明的保护范围；所述聚乙烯包括各种规格和形状的聚乙烯塑料的至少一种。
本发明还保护一种所述菌株和菌剂在降解聚乙烯塑料废物中的应用。
本发明还保护一种降解聚乙烯塑料废物的方法，该方法包括：在将上述的菌株和/或菌剂与塑料接触，由此可以利用生物降解的方法处理聚乙烯塑料废物。
所述的应用，其特征在于：所述聚乙烯塑料废物存在于垃圾填埋场中和/或各种水体环境中的至少一种。
本发明的一个目的在于提出一种具有快速有效地筛选可降解塑料菌株的方法，通过该方法筛选得到的菌株能够高效降解塑料。
所述筛选可降解塑料菌株的方法包括：以塑料为碳源，对啮噬塑料昆虫的鞘翅目拟步甲虫科昆虫(Coleoptera:Tenebrionidae)的肠道菌群进行培养，以便获得所述可降解塑料菌株。
所述筛选可降解塑料菌株的方法进一步包括：获得所述啮噬塑料昆虫的肠道内容物；将所述肠道内容物与生理盐水混合，以便获得肠道菌悬液；以及利用无机盐培养基，并且采用聚乙烯塑料作为唯一碳源，对所述获得肠道菌悬液的至少一部分进行富集培养，以便获得含有所述可降解塑料微生物的培养液。利用固体培养基，对所述含有所述可降解塑料微生物的培养液进行培养，以便获得所述可降解塑料的微生物的单菌落。
生产菌剂的工艺为：斜面种-摇瓶种-种子罐-生产罐-产品(包装剂型为液体菌剂或固体吸附菌剂)。
用所述菌株制备所述菌剂具体可采用如下步骤：
1、将菌株YZ1(原种)在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上备用。
2、将试管种接种于2000ml摇瓶(含400ml肉汤培养基)中，恒温振荡培养至对数期，准备接种种子罐。
3、配制发酵培养基(葡萄糖1%，KH2PO40.2%；K2HPO40.2%；NH4NO30.1%；MgSO4·7H2O0.05%；NaCl0.01%；FeSO4·7H2O0.03%；ZnSO4·7H2O0.03%；MnSO4·7H2O0.03%；酵母膏0.03%；pH值7.2～7.5)，将400升发酵培养基加入500升种子罐，121℃高压湿热灭菌，冷却至33℃后，将摇瓶菌种按10%(体积百分比)的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为200转/分，无菌空气通入量为1:0.6(体积比)。
4、生产罐(生产量为4吨)所采用培养基成分与发酵培养基相同(投料量3.5吨)，投料后的生产罐1.1kg/cm2的压力下，121℃高压湿热灭菌，灭菌后冷却至室温。通无 菌空气后，将对数期的种子液按10%(体积百分比)的接种量加入生产罐，接种后生产罐的温度控制在28～35℃，生产罐培养过程中无菌空气的通气量为1:0.6，搅拌速度为180转/分，整个工艺流程培养时间为24～35小时；发酵结束后菌体数量达到109个/ml以上。
5、发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型。
本发明提供了一种聚乙烯降解菌株和菌剂，在60天内最大降解率为5%，这为利用生物降解聚乙烯塑料废物提供了一种可行的技术手段。将该菌株和/菌剂应用到垃圾填埋场，能够有效降解垃圾中的聚乙烯废物，提高垃圾填埋场的填埋容量，能创造显著的经济和环境保护效益。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明的一个实施例，固体培养下聚乙烯膜上肠杆菌的生长曲线；(a)菌落形成单位法（CFU）计数和(b)实时定量基因扩增荧光检测（qPCR）计数结果。
图2是根据本发明的一个实施例，聚乙烯膜上肠杆菌的生长活性。(a)扫描电镜（SEM）观察28天聚乙烯塑料膜面微生物细和(b)菌生存力测试（BacLight Dead/Live）观察28天聚乙烯塑料膜面微生物，红色为死菌，绿色为活菌。
图3是根据本发明的一个实施例，聚乙烯膜降解的形貌观察。(a)空白聚乙烯塑料膜的SEM观察，(b)降解28天后的聚乙烯塑料膜SEM观察，(c)空白聚乙烯塑料膜的原子力显微镜（AFM）观察，(d)降解28天后的聚乙烯塑料膜AFM观察。
图4是根据本发明的一个实施例，聚乙烯膜的衰减全反射-傅里叶变换红外光谱法（ATR-FTIR）测试结果。空白聚乙烯塑料膜和YZ1菌株降解28天后的聚乙烯塑料膜。
图5是根据本发明的一个实施例，聚乙烯膜本身的抗拉强度测试测试结果。
图6是根据本发明的一个实施例，以聚乙烯塑料为唯一碳源在液体培养下肠杆菌的生长曲线。
图7是根据本发明的一个实施例，在液体培养基下培养肠杆菌对聚乙烯的降解速率。
具体实施例
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下面通过具体的实施例，对本发明进行说明，需要说明的是这些实施例仅仅是为了说明目的，而不能以任何方式解释成对本发明的限制。另外，在下列实施例中如果没有特别说明，则所采用的设备和材料均为市售可得的。
实施例1
一、肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)YZ1的筛选与分离培养
对啮噬塑料昆虫虫体进行消毒，使用75%（v/v）的乙醇洗净虫体，之后用无菌水冲洗两次以洗去虫身上酒精，至虫体洁净。无菌条件下在培养皿中进行操作。取出已消毒的虫体，解剖后拉出其肠道。之后在肠道边滴一滴生理盐水，并用弯头镊子头部轻轻赶出肠道中肠液，用移液器提取肠液，再使用0.85%生理盐水稀释5倍，制成肠道菌悬液。将制备好的肠道菌悬液1ml加入锥形瓶中，再量取19ml灭菌液体无机盐培养基加入锥形瓶，制成20ml液体培养肠道菌液。液体无机盐培养基配方为：KH2PO40.7g，K2HPO40.7g，NH4NO31.0g，MgSO4·7H2O0.7g，NaCl0.005g，FeSO4·7H2O0.002g，ZnSO4·7H2O0.002g，MnSO4·7H2O0.001g，水1000ml。将已消毒的聚乙烯膜（1×1cm2、0.5×0.5cm2两种大小）加入到菌液中作为底物，在28℃条件下以150rpm的速度培养，培养时间60天。以聚乙烯为唯一碳源诱导筛选培养，完毕后用移液器器吸取0.1ml进行平板涂布，挑取长出的单菌落进行划线分离，经过5次划线分离后得到肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)YZ1单菌，对其进行保藏。
二、肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)YZ1的鉴定
实施例2
肠杆菌YZ1在固体无机盐培养基中降解塑料:
1、取实施例1筛选得到的肠杆菌YZ1，置于装有肉汤培养基20ml的150ml锥形瓶中，摇床转速150rpm，温度28摄氏度培养1～2天。再接种入装有肉汤培养基50ml的250ml锥形瓶中，相同条件下发酵培养1天得到菌液。离心、生理盐水重悬三次，洗去原有培养基，保证菌悬液中无碳源和其他营养物质。测定菌悬液的OD600值并稀释到合理倍数，获得浓度在1～3×106CFU/ml的菌悬液。
2、用移液器取上述浓度的菌悬液5mL，滴加在固体无机盐培养基中心，进行涂布培养。涂布完毕后，将准备好已用75%酒精消毒的5cm×5cm聚乙烯膜平铺在培养基表面，让膜充分与培养基和菌液接触。控制组加聚乙烯膜，不加菌液。将平板放入恒温培养箱中，28～30℃，相对湿度不低于85%的条件下培养28天。
3、聚乙烯膜上肠杆菌YZ1的生长情况采用CFU计数，qPCR计数，BacLight Dead/Live和SEM观察得到。自培养开始算起，分别在0天，1天，3天，5天，7天，14天，21天，28天进行平板计数，使用平板菌落计数法和qPCR两种方法。培养28天后，揭下聚乙烯膜，使用两种染料将聚乙烯膜上细菌染色进行BacLight Dead/Live。SYTO9将细菌染成绿色，代表活细菌，碘化丙啶将细菌染成红色，代表死细菌。黑暗中反应10-15min，用荧光显微镜拍摄图像。附着有肠杆菌的YZ1的聚乙烯膜通过微生物固定后进行SEM观察。CFU计数和qPCR计数显示，在28天的培养过程中聚乙烯上的肠杆菌YZ1快速扩增，从最初的105增加到108，增长幅度达到3个数量级，如图1。Baclight结果由图2给出，在培养了28天之后聚乙烯上的菌体绝大部分具有活性。图2 SEM克清晰观察到聚乙烯表面密集分布的菌体。以上结果说明这株肠杆菌能够以聚乙烯为碳源生长繁殖，肯定其利用聚乙烯能力。
4、聚乙烯的降解通过SEM，AFM，FTIR和力学性能测试得到确认。以上测试均使用肠杆菌YZ1培养28天，洗去表面微生物的聚乙烯，具体方法：将实验后的聚乙烯膜放入75%（v/v）乙醇溶液中浸泡30min，然后用无菌水小心冲洗5遍，洗净膜上乙醇和残留生物膜，干燥后进行测试。SEM和AFM观察到聚乙烯表面产生了明显的菌株侵蚀现象，如图3。图4中FTIR结果表明聚乙烯表面化学结构发生变化，聚乙烯被肠杆菌YZ1所氧化。图5给出力学性能测试，表明聚乙烯的机械强度明显变化，肯定肠杆菌YZ1对聚乙烯的降解作用。
实施例3
肠杆菌YZ1在液体无机盐培养基中降解塑料：
将实施例1筛选得到的肠杆菌YZ1按照实施例2的方法制备得到菌悬液。向250ml锥形瓶中加入该菌悬液10ml和液体无机盐培养基40ml，聚乙烯膜用剪刀剪成小片状(约0.5mm×0.5mm)，并加入锥形瓶中，在28℃摇床100rpm的转速旋转培养。在第7天，14天，21天，28天，60天分别设置3个平行。到相应时间点取出聚乙烯称重并测定菌液OD600值。各时间点的OD600值结果如图6所示，在60天的培养中菌细胞浓度呈现不断增长的趋势，与CFU计数类似。各时间点的聚乙烯塑料称重质量如图7所示，由图7可知在培养过程中聚乙烯称重质量不断下降。菌液OD600值和聚乙烯失重表明肠杆菌YZ1能够完成对聚乙烯的降解。
生物材料样品保藏
肠杆菌(Enterobacter cancerogenus YZ1)，保藏日期：2012年11月12日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (7)

1.生癌肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)YZ1，其保藏编号为CGMCC No.6816。
2.一种菌剂，它的活性成分为生癌肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)YZ1CGMCCNo.6816。
3.权利要求1所述的生癌肠杆菌或权利要求2所述的菌剂在降解聚乙烯塑料中的应用；所述聚乙烯塑料包括各种规格和形状的聚乙烯塑料的至少一种。
4.权利要求1所述的生癌肠杆菌或权利要求2中所述的菌剂在降解聚乙烯塑料废物中的应用。
5.一种降解聚乙烯塑料废物的方法，该方法包括：在将权利要求1所述的生癌肠杆菌或权利要求2中所述的菌剂与塑料接触，由此可以利用生物降解的方法处理聚乙烯塑料废物。
6.权利要求4所述的应用或权利要求5所述的方法，其特征在于，所述聚乙烯塑料废物存在于垃圾填埋场中。
7.权利要求4所述的应用或权利要求5所述的方法，其特征在于，所述聚乙烯塑料废物存在于各种水体和/或土壤环境中。
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