CN110343637B - 肠杆菌hy1及在降解对苯二甲酸双羟乙酯中的应用 - Google Patents

肠杆菌hy1及在降解对苯二甲酸双羟乙酯中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种肠杆菌HY1及在降解对苯二甲酸双羟乙酯中的应用，以肠杆菌HY1为酶源，以对苯二甲酸双羟乙酯为底物，以基础无机盐培养基为反应介质，在25‑37℃下反应，实现对底物的降解；对苯二甲酸双羟乙酯降解能力的新菌株‑‑Enterobacter sp.HY1，该菌株降解BHET的最适温度和最适pH值分别为37℃和8.0，最适氮源为酵母膏，在120h内对250、500、1000mg/L BHET降解率分别为93.46％、87.73％、80.81％。

Description

肠杆菌HY1及在降解对苯二甲酸双羟乙酯中的应用
(一)技术领域
本发明涉及一株对苯二甲酸双羟乙酯(BHET)降解菌——肠杆菌(Enterobactersp.)HY1及其在微生物降解对苯二甲酸双羟乙酯(BHET)中的应用。
(二)背景技术
聚对苯二甲酸乙二醇酯(Polyethlene terephthalate，PET)是现在使用最多的有机合成物之一，大量使用后的PET废弃物对环境微生物降解的抵抗性很强，导致其存在周期长，因此PET废弃物已成为严重的全球性环境污染有机物。对苯二甲酸双羟乙酯(BHET)，可由对苯二甲酸(TA)和乙二醇(EG)经过酯化过程制得。BHET是PET合成、降解过程中产生的中间物之一，其化学结构单元与PET类似，是研究PET生物降解最合适的模式化合物之一。此外，BHET可因焚烧塑料垃圾挥发进入大气环境，生产和使用涤纶有关的企业，也会有部分含有BHET的废气或工业污水排放到环境，而日常生活中使用的塑料袋或其他的塑料垃圾等，在进行掩埋处理时，其中的BHET和PET也会逐渐进入土壤。因此，筛选降解BHET的微生物既可用于环境中BHET的处理，也可提高筛选降解PET微生物的效率。发明人以BHET为模式化合物，从杭州市垃圾处理厂和废品回收站等长期存在BHET材料、PET聚酯塑料的场所中分离出1株BHET降解菌Enterobacter sp.HY1，并研究了其对BHET的降解特性。
(三)发明内容
本发明目的是提供一株具有对苯二甲酸双羟乙酯(BHET)降解能力的菌株——肠杆菌(Enterobacter sp.)HY1，及其在微生物降解BHET中的应用。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种新菌株--肠杆菌(Enterobacter sp.)HY1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018560，保藏日期2018年8月21日，地址中国武汉武汉大学，邮编430072。
本发明还提供一种所述肠杆菌HY1在微生物降解对苯二甲酸双羟乙酯(BHET)制备对苯二甲酸(TA)中的应用，所述的应用为：以肠杆菌HY1为酶源，以对苯二甲酸双羟乙酯为底物，以基础无机盐培养基为反应介质，在25-37℃(优选30℃)下反应，实现对底物的降解；所述基础无机盐培养基组成：K2HPO4·3H2O 1.0g/L，NaCl1.0g/L，氮源0.5g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，CaCl2 0.0755g/L，FeCl3·6H2O 0.0143g/L，溶剂为蒸馏水，pH 5-9(优选pH8)。
进一步，所述酶源以OD600＝1.0种子液形式加入，所述种子液在基础无机盐培养基中的体积加入量为2％。
进一步，所述酶源是肠杆菌HY1经扩大培养的种子液，所述种子液是将肠杆菌HY1接种至LB液体培养基，30℃培养24h后，离心，收集菌体，将菌体用基础无机盐液体培养基重悬至菌液浓度为OD600＝1.0，以此作为种子液。
进一步，所述底物在基础无机盐培养基中的加入终浓度为50-3000mg/L，优选250mg/L。
进一步，所述氮源为(NH4)2SO4、NH4Cl、酵母提取物、蛋白胨和CH4N2O，优选酵母提取物。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
本发明筛选一株具有对苯二甲酸双羟乙酯(BHET)降解能力的新菌株--Enterobacter sp.HY1，该菌株降解BHET的最适温度和最适pH值分别为37℃和8.0，最适氮源为酵母膏，在120h内对250、500、1000mg/L BHET降解率分别为93.46％、87.73％、80.81％；该菌株HY1对BHET的降解初始步骤为：对苯二甲酸双羟乙酯(BHET)→对苯二甲酸单羟乙酯(MHET)→对苯二甲酸(TA)。该菌株为首次报道的可降解BHET的Enterobacter属微生物，可用于环境中BHET净化处理。
(四)附图说明
图1菌株HY1降解BHET的HPLC图；
图2菌株HY1的系统发育进化树；
图3BHET标准曲线；
图4温度对Enterobacter sp.HY1生长的影响；
图5温度对Enterobacter sp.HY1降解的影响；
图6pH对Enterobacter sp.HY1生长的影响；
图7pH对Enterobacter sp.HY1降解BHET的影响；
图8不同氮源对Enterobacter sp.HY1生长的影响；
图9不同氮源对Enterobacter sp.HY1降解BHET的影响；
图10不同底物浓度对Enterobacter sp.HY1生长的影响；
图11不同底物浓度对Enterobacter sp.HY1降解BHET的影响；
图12不同BHET浓度的拟合降解动力学曲线；
图13Enterobacter sp.HY1降解BHET的HPLC图；
图14Enterobacter sp.HY1降解BHET的MS图，A为对苯二甲酸，B为BHET和MHET。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
1.材料与方法
1.1培养基：
(1)基础无机盐培养基(BSM)：K2HPO4·3H2O 1.0g/L，NaCl 1.0g/L，(NH4)2SO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，CaCl2 0.0755g/L，FeCl3·6H2O 0.0143g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.5，115℃灭菌30min。
(2)LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.0，115℃灭菌20min。
(3)筛选培养基：在BSM培养基中加入10g/L的BHET的DMSO溶液，使培养基中BHET的终浓度为250mg/L。
固体筛选培养基是在筛选培养基中添加15g/L琼脂。
1.2试剂：对苯二甲酸双(2-羟乙基)酯(BHET)，分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；甲醇(HPLC级)购自天津四友精细化学品有限公司；其余试剂均为分析纯。
1.3方法
1.3.1 BHET降解菌株的筛选
在杭州市垃圾处理厂和废品回收站等长期存在BHET材料、PET聚酯塑料的场所，取其附近的1g土壤或1ml水样，置于100mL水中，混匀，静置，然后取1mL加入到筛选培养基中，30℃，180rpm培养4d，重复多次驯化。将有明显生长的培养液稀释涂布到固体筛选培养基培养，同时测BHET降解情况，分离得到单菌落。将初筛获得的单菌落接种至筛选培养基，30℃，180rpm培养，每隔24h取样测定OD600，用HPLC检测0h和120h时样品中的BHET残留含量，以筛选出降解效率最高的菌株，记为菌株HY1。
1.3.2菌株的16S rDNA基因测序
利用Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒，提取菌株HY1的全基因组DNA，16SrDNA基因扩增使用的引物为27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)与1492R(RGGTTACCTTGTTACGACTT)，测序工作由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成，16S rDNA基因为SEQ ID NO.1所示，采用MEGA 4.0软件构建系统发育树，见图2。
1.3.3 BHET标准曲线
将BHET溶于二甲基亚砜(DMSO)中，使BHET终浓度为50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L。取各浓度溶液10μL，利用HPLC检测BHET残留量，以BHET浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线，见图3。
1.3.4不同培养条件对菌株生长和降解BHET的影响
(1)将筛选到的菌株HY1接种至LB液体培养基，30℃培养24h后，离心，收集菌体，将菌体用基础无机盐液体培养基重悬至菌液浓度为OD600＝1.0，以此作为种子液。按体积浓度2％的接种量接种至含BHET 250mg/L的BSM培养基，在30℃培养120h，取样采用HPLC检测BHET的残留量及OD600。
(2)将步骤(1)中温度设为25℃、30℃、37℃，培养120h，每隔24h取样采用HPLC检测BHET的残留量及OD600。
(3)将步骤(1)中培养基pH分别设置为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，30℃培养120h，分别在0h和120h时取样，采用HPLC检测BHET的残留量及OD600。
(4)将步骤(1)培养基中的氮源分别设置为(NH4)2SO4、NH4Cl、酵母膏、蛋白胨和CH4N2O(浓度均为0.5g/L)，30℃培养120h，分别在0h和120h时取样，采用HPLC检测BHET的残留量及OD600。
(5)将步骤(1)中氮源改为酵母膏，底物BHET浓度分别改为250、500、1000、2000、3000mg/L，30℃培养120h，每隔24h取样，采用HPLC检测BHET的残留量及OD600。
有机污染物在微生物胞内的降解属酶促反应，其反应过程应符合米氏方程：V＝Vm[C]/(Km+[C])，方程中[C]表示底物浓度，V为反应速率，Km表示最大反应速度达一半时的底物浓度；当[C]<<Km时，为一级反应，方程可写为lnC＝-Kt+A(C为初始BHET浓度，t为时间，K为反应速率常数，A为常数)。假设菌株对BHET的生物降解遵循一级反应动力学方程，将降解过程中BHET残留浓度的测定数据进行对数转换，用ORIGIN 8.0软件拟合降解动力学方程，并计算BHET的半衰期t1/2＝ln 2/K。
1.3.5 BHET的HPLC检测及降解中间产物分析
在30℃，pH8.0，底物浓度为250mg/L BHET的培养条件下，体积浓度2％的接种量接种入OD600＝1.0菌株HY1种子液至BSM培养基，培养24h后，取菌液10000rpm离心10min后，取600μl上清液，加入甲醇1.4mL，取500μl用0.22μm微孔滤头过滤到液相样品瓶中。色谱分析条件：用Agilent 1260HPLC检测，进样量10μl，流动相为为甲醇：水＝70％：30％，流速0.5mL/min，色谱柱为Diamonsil 5μm C18(2)，250×4.6mm，柱温30℃，二极管阵列(DAD)检测器，检测波长254nm。
将HPLC检测后的样品，继续用6210飞行时间质谱联用仪进行MS检测。质谱条件为：电子轰击(EI)离子源；电离能量70eV；离子源温度230℃，接口温度280℃，全扫面质量范围为40m/z～400m/z。
2.结果与分析
2.1 BHET降解菌的筛选与分离
经过筛选后分离到一株BHET降解菌株HY1，HPLC分析结果表明(图1)，培养120h后，菌株已将250mg/L BHET(出峰时间约5.9min)显著降解，并有中间代谢产物形成。
在30℃下，菌株HY1在筛选培养基平板上培养48h后，形成的菌落呈圆形，凸起，湿润有光泽，乳白色，不透明。菌体形态为短杆状，革兰氏阴性，糖发酵试验、甲基红试验、柠檬酸盐利用试验和接触酶试验结果为呈阳性，PCR扩增16S rRNA基因，GENBANK中的序列登录号为MK681894；用MEGA6.0构建系统发育树(图2)，发现该菌株HY1与Enterobacter的同源性为99.58％；结合形态、生理生化特征及16S rRNA基因序列分析，表明该菌株与Enterobacter属分类特征相符，将其命名为肠杆菌(Enterobacter sp.)HY1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018560，保藏日期2018年8月21日，地址中国武汉武汉大学，邮编430072。
2.2 BHET标准曲线
BHET标准曲线如图3所示，经拟合后方程为y＝16.449x-428.19，R2＝0.9899，线性关系良好。
2.3温度对菌株HY1生长和降解BHET的影响
在不同培养温度(25℃、30℃、37℃)，BHET初始质量浓度为250mg/L，2％接种量的条件下，菌株HY1的生长和对BHET的降解如图4，图5所示，在30℃条件下，OD600最高，生长速率最快；在25℃、30℃、37℃条件下降解120h后，BHET的残留含量分别为157mg/L、39mg/L、55mg/L，以30℃最优，降解率约为84％，因此该菌株的最适生长温度和降解温度均为30℃。
2.4初始pH对菌株HY1生长和降解BHET的影响
培养基初始pH分别设置为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，BHET浓度为250mg/L，2％接种量的条件下，菌株HY1的生长和对BHET的降解如图6，图7所示。在pH＝8条件下，菌株的OD600值最高，生长速率最快，降解120h后，在pH＝4～9的条件下BHET的残留含量分别为151mg/L、116mg/L、79mg/L、52mg/L、91mg/L，说明菌株的最适生长和降解pH均为8.0。
2.5不同氮源对菌株HY1生长和降解BHET的影响
比较不同氮源对菌株HY1生长和降解BHET的影响如图8、图9所示，结果显示菌株在有机氮源中的生长速度明显优于无机氮源，其中以0.5g/L酵母提取物为氮源，菌株的生长速度最快。在无机氮源中，以硫酸铵为氮源对菌株的生长效果最好。经120h降解后，以硫酸铵为氮源对BHET的降解效率最高，降解效率达到89％，其次为酵母提取物，降解率为87％，考虑到以硫酸铵氮源，菌株的生长效率不高，因此因此选择添加0.5g/L的酵母膏作为后续实验的氮源。
2.6BHET浓度对菌株HY1生长和降解的影响
根据上述结果，在30℃，pH8.0，酵母膏为氮源的优化培养条件下，不同底物浓度对菌株HY1降解BHET的影响如图10，图11所示，菌株HY1对初始浓度分别为250、500、1000、2000、3000mg/L时，培养120h后，而BHET的降解率分别为93.46％、87.73％、80.81％、35.41％和7.82％，并在250mg/L的BHET中菌株生长效果最好。BHET的微生物降解是酶促反应过程，菌株对BHET的降解在250-3000mg/L符合酶促一级反应动力学模型(图12，表1)，遵循一级反应动力学方程：lnC＝-Kt+A(C为初始BHET浓度，K为反应速率常数，A为常数)。半衰期是指微生物降解底物时，底物残留浓度为初始浓度的一半时所用的时间。半衰期越短，说明微生物降解底物的速率越快。因此在250mg/L的BHET条件下，降解效率最高，降解半衰期为29.95h，在3000mg/L的BHET条件下，降解半衰期为910.84h。这说明菌株降解BHET时，随着BHET浓度的增加，反应速率常数K逐渐增大，半衰期逐渐变长。
表1不同BHET浓度的降解动力学方程
Figure BDA0002111510140000061
Figure BDA0002111510140000071
2.7菌株HY1降解BHET的中间产物分析
在30℃，pH8.0，底物BHET浓度为250mg/L的培养条件下，BSM培养基接种入菌株HY1，培养24h后，取上清，用HPLC和MS分析该菌株降解BHET的中间产物。HPLC结果如图13所示。BHET的出峰时间为5.9min。BHET经Enterobacter sp.HY1降解后出现了2个未知产物峰，出峰时间分别为4.2min和4.8min。通过采用质谱分析(图14)，其中4.2min的产物，其质荷比(m/z)值为163.1，与对苯二甲酸(TA)相符，而出峰时间为4.8min的另一未知产物，其m/z＝193，与对苯二甲酸单(羟乙基)酯(MHET)相符；综上说明，菌株是通过酯水解方式打开BHET的1个酯键水解成MHET，并继续将另一个酯键水解产生TA，因此菌株降解初始步骤为：对苯二甲酸双羟乙酯(BHET)→对苯二甲酸单羟乙酯(MHET)→对苯二甲酸(TA)。
3.结论
本发明以对苯二甲酸双羟乙酯(BHET)为模式化合物，从土壤中筛选到一株BHET降解菌，经分子鉴定初步命名为Enterobacter sp.HY1，该菌株降解BHET的最适温度和最适pH值分别为37℃和8.0，最适氮源为酵母膏，在120h内对250、500、1000mg/L BHET降解率分别为93.46％、87.73％、80.81％；利用HPLC和MS进行中间产物分析，发现该菌株对BHET的降解初始步骤为：BHET→对苯二甲酸单羟乙酯(MHET)→对苯二甲酸(TA)。该菌株为首次报道的可降解BHET的Enterobacter属微生物，可用于环境中BHET净化处理。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 肠杆菌HY1及在降解对苯二甲酸双羟乙酯中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1414
<212> DNA
<213> 肠杆菌(Enterobacter sp.)
<400> 1
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acgcgttaag tcgaccgcct ggggagtacg gccgcaaggt taaaactcaa atgaattgac 900
gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga tgcaacgcga agaaccttac 960
ctactcttga catccagaga acttagcaga gatgctttgg tgccttcggg aactctgaga 1020
caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg ttgtgaaatg ttgggttaag tcccgcaacg 1080
agcgcaaccc ttatcctttg ttgccagcgg ttaggccggg aactcaaagg agactgccag 1140
tgataaactg gaggaaggtg gggatgacgt caagtcatca tggcccttac gagtagggct 1200
acacacgtgc tacaatggcg catacaaaga gaagcgacct cgcgagagca agcggacctc 1260
ataaagtgcg tcgtagtccg gattggagtc tgcaactcga ctccatgaag tcggaatcgc 1320
tagtaatcgt ggatcagaat gccacggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1380
gtcacaccat gggagtgggt gcaaaagaag tagg 1414

Claims (8)

1.肠杆菌(Enterobacter sp.)HY1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018560，保藏日期2018年8月21日，地址中国武汉武汉大学，邮编430072。
2.一种权利要求1所述肠杆菌HY1在降解对苯二甲酸双羟乙酯中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：以肠杆菌HY1为酶源，以对苯二甲酸双羟乙酯为底物，以基础无机盐培养基为反应介质，在25-37℃下反应，实现对底物的降解；所述基础无机盐培养基组成：K2HPO4·3H2O 1.0g/L，NaCl 1.0g/L，氮源0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，CaCl2 0.0755g/L，FeCl3·6H2O 0.0143g/L，溶剂为蒸馏水，pH 5-9。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述酶源以OD600＝1.0种子液形式加入，所述种子液在基础无机盐培养基中的体积加入量2％。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述酶源是肠杆菌HY1经扩大培养的种子液，所述种子液是将肠杆菌HY1接种至LB液体培养基，30℃培养24h后，离心，收集菌体，将菌体用基础无机盐液体培养基重悬至菌液浓度为OD600＝1.0，以此作为种子液。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述底物在基础无机盐培养基中的加入终浓度为50-3000mg/L。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述氮源为(NH4)2SO4、NH4Cl、酵母膏、蛋白胨或CH4N2O。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述氮源为酵母膏。
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