CN109266588A

CN109266588A - 一株肠杆菌xm及其在bde 28降解中的应用

Info

Publication number: CN109266588A
Application number: CN201811372975.1A
Authority: CN
Inventors: 王莹莹; 张娅迪; 韩伟; 王曦; 顾捷; 陈林
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2018-11-19
Filing date: 2018-11-19
Publication date: 2019-01-25
Anticipated expiration: 2038-11-19
Also published as: CN109266588B

Abstract

本发明公开了一株肠杆菌XM及其在BDE 28降解中的应用，该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017年9月12日，保藏编号为CGMCC No.14607。该菌株为革兰氏阴性菌，淡黄色，呈表面隆起的乳白色不透明圆形菌落。扫描电镜下该菌为杆状。在液体培养基中，菌株XM对三溴联苯醚(BDE 28)具有很好的降解效果。在35℃好氧条件下，BDE 28初始浓度为200μg/L，7天对BDE 28的降解率达54.12％。本发明筛选的兼性降解菌可以利用BDE 28为唯一碳源，并有效降解BDE 28，该发明可用于多溴二苯醚污染场地的修复。

Description

一株肠杆菌XM及其在BDE 28降解中的应用

技术领域

本发明属于环境污染生态修复领域，具体涉及一株BDE 28降解菌株及其在污染修复中的应用，可用于水体中BDE 28的去除。

背景技术

多溴二苯醚(PBDEs)是一种高效的溴代阻燃剂，结构上类似多氯联苯(PCBs)，化学通式为C₁₂H_(0-9)Br_(1-10)O,是一系列苯环上氢原子被溴取代的芳香族化合物，根据苯环上溴原子个数和位置的不同，总共有209种同系物。因其具有热稳定性高、价格低廉、添加量少及优异的阻燃效率的特点被广泛应用于建筑材料、电子产品、家具、交通工具、纺织品等产品中。作为一种新型的持久性有机物(POPs)，PBDEs具有环境持久性、生物累积性、长距离迁移能力和高生物毒性等特征从而被广泛关注，有着“环境荷尔蒙”之称，更是有一部分列入了“斯德哥尔摩公约”。其中，低溴代联苯醚相比高溴代联苯醚具有更高的挥发性、水溶性和生物富集性，被认为更危险。BDE28作为一种低溴代联苯醚，已被证实有甲状腺毒性效应、神经系统毒性效应以及生殖发育毒性，对人体和生态环境造成了很大的威胁。因此，必须不断深入对PBDEs降解技术的研究。

目前，对于PBDEs的降解我国现主要采用的方法有光降解法、生物法(包括微生物降解)、零价铁还原以及电催化还原。在诸多降解技术研究过程中，微生物降解因为投资较少、菌种来源广泛、不会对环境产生二次污染等特点被认为是当前对于PBDEs降解最具有前景的手段之一。PBDEs的微生物降解主要是通过厌氧和好氧菌的还原脱溴作用及甲基化或羟基化反应来完成的。好氧降解因为降解周期短且能够使目标污染物开环而彻底降解这一特性在微生物降解PBDEs上显现出了极大的优越性，尤其是低溴代联苯醚的开环作用上。目前低溴代联苯醚的研究主要集中在毒性较大的BDE 47的降解，然而BDE 47的降解产物之一的BDE 28仍有很大毒性，针对BDE 28的报道研究却比较少。因此，高效的BDE 28降解菌株亟待发现，探讨其降解特性对于拓宽BDE 28的降解途径具有重要的科学意义和应用价值。本发明中BDE 28为2,4,4'-三溴联苯醚；BDE 47为2,2',4,4'-四溴联苯醚。

发明内容

本发明的目的是解决环境中BDE 28的微生物降解问题，提供一株肠杆菌BDE28降解中的应用。

本发明技术方案：

本发明首先提供了一株BDE 28兼性降解菌株肠杆菌(Enterobacter sp.XM)，该菌株已于2017年9月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，建议分类命名为Enterobacter sp.，其保藏号为CGMCCNo.14607。

本发明肠杆菌XM的筛选方法为：

电子垃圾土壤样品采集自某循环经济产业区废旧电子信息产品回收拆解地，在50mL含有1μg/mL BDE 28溶液的无机盐培养基中加入2g土样，充入高纯氩气排除培养基中的空气，塞好瓶塞，放入厌氧培养箱暗室培养箱30℃静置培养7天，然后按10％的接种量转接到2μg/mLBDE 28无机盐培养基中，继续培养使BDE 28的最终浓度达到5μg/mL。将最后一次的培养液在LB固体培养基上用平板划线法对菌株进行分离纯化，挑选生长较快的优势菌落，进行平板分离，反复纯化3次，得到单一纯菌落，转接到液体LB培养基中扩大培养后，提取该菌株DNA，PCR扩增后，进行16S rRNA测序，将所测序列提交GenBank进行分析，鉴定该菌株为兼性肠杆菌Enterobactersp.XM。

本发明同时提供了肠杆菌XM在PBDEs降解中的应用，所述肠杆菌XM对BDE 28具有很好的降解效率，可用于PBDEs污染水体和土壤的修复。特别是肠杆菌在对BDE 28的降解中的应用；所述肠杆菌对BDE 28具有较好的降解能力，通过降解实验，得出当BDE 28浓度为200μg/L，初始接菌量为3.5×10⁵cells/mL时，培养7天后降解率为54.12％。

本发明的优点和积极效果：

本发明与现有修复方法或技术相比有以下显著优点和有益效果：

(1)本发明首次发现肠杆菌(Enterobactersp.XM)对BDE 28具有较好的降解能力。

(2)该菌株对于水体中BDE 28的降解，除了菌种以外不需投加任何化学药品和其它添加物，不会产生二次污染。并且操作流程简单，对管理条件要求低，可用于BDE 28污染水体的修复。

附图说明

图1为肠杆菌XM扫描电镜图。

图2为肠杆菌XM流式细胞检测图。

图3为肠杆菌XM的生长与BDE 28降解效果关系图。

该图说明：在pH 7，0.5％盐度下，将肠杆菌以3.5×10⁵cells/mL转接到BDE28的浓度为200μg/L的无机盐培养基中，在35±2℃的培养箱中以200rpm/min的转速进行降解培养，7天的细菌生长量可达7×10⁶cells/mL左右，降解率可达54.12％。

图4为初始BDE28浓度对XM生长和降解BDE 28的影响。

该图说明：在好氧条件下，BDE 28初始浓度为200μg/L降解效果最好，降解效率为45.23％。

图5为温度对XM生长和降解BDE 28的影响。

该图说明：在好氧条件下，BDE 28初始浓度为200μg/L时，35℃降解效果最好。

图6为盐度对XM生长和降解BDE 28的影响。

该图说明：在好氧条件下，BDE 28初始浓度为200μg/L，35℃时，盐度为0.5％降解效果最好，降解效率为49.64％。

图7为pH对XM生长和降解BDE 28的影响。

该图说明：在好氧条件下，BDE 28初始浓度为200μg/L，35℃，盐度为0.5％时，pH为7降解效果最好，降解效率为50.17％。

图8为转速对XM生长和降解BDE 28的影响。

该图说明：在好氧条件下，BDE 28初始浓度为200μg/L，35℃，盐度为0.5％，pH为7时，转速为200rpm/min降解效果最好，降解效率为54.12％。

具体实施方式

本发明提供的肠杆菌(Enterobactersp.XM)为2017年9月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)、分类命名为Enterobactersp.、保藏号为CGMCC No.14607的肠杆菌XM。该菌株为革兰氏阴性菌，淡黄色，呈表面隆起的乳白色不透明圆形菌落，扫描电镜下该菌为杆状。其扫描电镜图及流式细胞检测图如附图1和附图2所示。

本发明所述肠杆菌XM的筛选方法，具体步骤如下：

电子垃圾土壤样品2016年5月采集自天津子牙循环经济产业区废旧电子信息产品回收拆解地。在50mL含有1μg/mL BDE 28溶液的无机盐培养基中加入2g土样，充入高纯氩气排除培养基中的空气，塞好瓶塞，放入厌氧培养箱暗室培养箱30℃静置培养7天，然后按10％的接种量转接到2μg/mL BDE 28无机盐培养基中，继续培养使BDE 28的最终浓度达到5μg/mL。将最后一次的培养液在LB固体培养基上用平板划线法对菌株进行分离纯化，挑选生长较快的优势菌落，进行平板分离，反复纯化3次，得到单一纯菌落，转接到液体LB培养基中扩大培养后，提取该菌株DNA，PCR扩增后，进行16S rRNA测序，将所测序列提交GenBank进行分析，鉴定该菌株为兼性肠杆菌Enterobactersp.XM。

本发明所述肠杆菌XM在BDE 28降解中的应用，具体过程和步骤如下：

1、所述单因素实验中使用的无机盐培养基的组分包括：1)基础无机盐培养基：Na₂HPO₄·12H₂O 25.6g/L,KH₂PO₄3g/L,(NH₄)₂SO₄1.77g/L；2)微量元素培养基：HCl 200μL/L,CaCO₃0.08g/L,FeCl₃·6H₂O 0.0774g/L,MnCl₂·4H₂O 0.0115g/L,CuSO₄·5H₂O 0.00146g/L,CoCl₂·6H₂O 0.0013g/L,ZnO 0.004g/L,H₃BO₃0.00124g/L,EDTA Na₄·2H₂O 0.792g/L,MgCl₂·6H₂O 0.1342g/L,Na₂MoO₄·2H₂O 0.0104g/L；该无机盐培养基的pH为7.4；所述的LB培养基组成包括：10g/L蛋白胨，10g/LNaCl，和5g/L酵母浸粉。

肠杆菌XM对BDE 28降解的最优条件：

将肠杆菌XM于100mL的液体LB培养基中30℃活化45小时使其达到对数期。将菌株进行离心清洗后，在棕色250mL血清瓶中配制以BDE 28为唯一碳源的150mL无机盐培养基。单因素实验选定5因素BDE 28浓度、温度、盐度、pH、转速，分别设定梯度，初始BDE 28浓度(50,100,200,500,1000μg/L),温度(20,25,30,35,40℃),盐度(0,0.5,1.0,2.0,4.0％(w/vNaCl)),pH(5.0,6.0,7.0,8.0,9.0),转速(50,100,150,200,250rpm/min)，优化肠杆菌对BDE 28降解条件。同时设置不加菌为对照组，每个处理3个重复，降解时间为7天，研究结果发现，XM对BDE 28最优的降解条件为BDE 28的浓度为200μg/L，温度35℃，盐度为0.5％，pH为7.0，转速为200rpm/min(如图4-图8所示)。

最优条件下，肠杆菌XM对BDE 28的降解：

将肠杆菌XM于100mL的液体LB培养基中30℃活化45小时使其达到对数期。将菌株进行离心清洗后，在棕色250mL血清瓶中配制以BDE 28为唯一碳源的150mL无机盐培养基。在pH 7，0.5％盐度下，将肠杆菌以3.5×10⁵cells/mL转接到BDE 28的浓度为200μg/L的无机盐培养基中，以不接菌的处理作为实验对照。在35±2℃的培养箱中以200rpm/min的转速进行降解培养。在不同的反应时间取样，测定细菌生长和BDE 28含量变化。实验结果表明，肠杆菌对200μg/LBDE 28进行7天的降解率可达54.12％，如图3所示。

序列表

<110> 南开大学

<120> 一株肠杆菌XM及其在BDE 28降解中的应用

<130> 2018.11.16

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1442

<212> DNA

<213> Enterobacter sp.

<400> 1

tgcttatcaa agtggtagcg ccctcccgaa ggttaagcta cctacttctt ttgcaaccca 60

ctcccatggt gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gtagcattct 120

gatctacgat tactagcgat tccgacttca tggagtcgag ttgcagactc caatccggac 180

tacgacgcac tttatgaggt ccgcttgctc tcgcgaggtc gcttctcttt gtatgcgcca 240

ttgtagcacg tgtgtagccc tactcgtaag ggccatgatg acttgacgtc atccccacct 300

tcctccagtt tatcactggc agtctccttt gagttcccgg ccggaccgct ggcaacaaag 360

gataagggtt gcgctcgttg cgggacttaa cccaacattt cacaacacga gctgacgaca 420

gccatgcagc acctgtctca gagttcccga aggcaccaaa gcatctctgc taagttctct 480

ggatgtcaag agtaggtaag gttcttcgcg ttgcatcgaa ttaaaccaca tgctccaccg 540

cttgtgcggg cccccgtcaa ttcatttgag ttttaacctt gcggccgtac tccccaggcg 600

gtcgacttaa cgcgttagct ccggaagcca cgcctcaagg gcacaacctc caagtcgaca 660

tcgtttacgg cgtggactac cagggtatct aatcctgttt gctccccacg ctttcgcacc 720

tgagcgtcag tctttgtcca gggggccgcc ttcgccaccg gtattcctcc agatctctac 780

gcatttcacc gctacacctg gaattctacc cccctctaca agactctagc ctgccagttt 840

cgaatgcagt tcccaggttg agcccgggga tttcacatcc gacttgacag accgcctgcg 900

tgcgctttac gcccagtaat tccgattaac gcttgcaccc tccgtattac cgcggctgct 960

ggcacggagt tagccggtgc ttcttctgcg ggtaacgtca attgctgcgg ttattaacca 1020

caacaccttc ctccccgctg aaagtacttt acaacccgaa ggccttcttc atacacgcgg 1080

catggctgca tcaggcttgc gcccattgtg caatattccc cactgctgcc tcccgtagga 1140

gtctggaccg tgtctcagtt ccagtgtggc tggtcatcct ctcagaccag ctagggatcg 1200

tcgcctaggt gagccgttac cccacctact agctaatccc atctgggcac atctgatggc 1260

aagaggcccg aaggtccccc tctttggtct tgcgacgtta tgcggtatta gctaccgttt 1320

ccagtagtta tccccctcca tcaggcagtt tcccagacat tactcacccg tccgccactc 1380

gtcacccgag agcaagctct ctgtgctacc gttcgactgc atgtgtagct gccgcaaggc 1440

cg 1442

Claims

1.一株肠杆菌XM，其特征在于：该肠杆菌XM于2017年9月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.14607。

2.根据权利要求1所述的肠杆菌XM，其特征在于：该肠杆菌菌株为革兰氏阴性菌，淡黄色，呈表面隆起的乳白色不透明圆形菌落。

3.根据权利要求1所述的肠杆菌XM，其特征在于：该肠杆菌的筛选方法为：

电子垃圾土壤样品采集自某循环经济产业区废旧电子信息产品回收拆解地，在50mL含有1μg/mL BDE 28溶液的无机盐培养基中加入2g土样，充入高纯氩气排除培养基中的空气，塞好瓶塞，放入厌氧培养箱暗室培养箱30℃静置培养7天，然后按10％的接种量转接到2μg/mL BDE 28无机盐培养基中，继续培养使BDE 28的最终浓度达到5μg/mL；将最后一次的培养液在LB固体培养基上用平板划线法对菌株进行分离纯化，挑选生长较快的优势菌落，进行平板分离，反复纯化3次，得到单一纯菌落，转接到液体LB培养基中扩大培养后，提取该菌株DNA，PCR扩增后，进行16S rRNA测序，将所测序列提交GenBank进行分析，鉴定该菌株为兼性肠杆菌Enterobacter sp.XM。

4.权利要求1-2所述的肠杆菌XM的应用，其特征在于：在多溴二苯醚降解中的应用。

5.根据权利要求3所述的肠杆菌XM的应用，其特征在于：所述的应用是指肠杆菌XM在对BDE 28的降解中的应用。

6.根据权利要求4所述的肠杆菌XM的应用，其特征在于：所述肠杆菌XM对BDE 28具有降解能力，通过单因素实验，得出该菌株对BDE 28降解的条件为：200μg/L BDE 28浓度，35℃，0.5％盐度，pH 7.0，200rpm/min转速。

7.根据权利要求4或5所述的肠杆菌XM的应用，其特征在于：肠杆菌XM对BDE 28降解率为54.12％。

8.根据权利要求6所述的肠杆菌XM的应用，其特征在于：所述单因素实验中使用的无机盐培养基的组分包括：1)基础无机盐培养基：Na₂HPO₄·12H₂O 25.6g/L,KH₂PO₄ 3g/L,(NH₄)₂SO₄ 1.77g/L；2)微量元素培养基：HCl 200μL/L,CaCO₃ 0.08g/L,FeCl₃·6H₂O 0.0774g/L,MnCl₂·4H₂O 0.0115g/L,CuSO₄·5H₂O 0.00146g/L,CoCl₂·6H₂O 0.0013g/L,ZnO 0.004g/L,H₃BO₃ 0.00124g/L,EDTA Na₄·2H₂O 0.792g/L,MgCl₂·6H₂O 0.1342g/L,Na₂MoO₄·2H₂O0.0104g/L；该无机盐培养基的pH为7.4。

9.根据权利要求6所述的肠杆菌XM的应用，其特征在于：所述的LB培养基组成包括：10g/L蛋白胨，10g/LNaCl，和5g/L酵母浸粉。