CN113755338B - 一种多环芳烃降解菌株P.domesticum LJD-1及其菌剂和应用 - Google Patents

一种多环芳烃降解菌株P.domesticum LJD-1及其菌剂和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多环芳烃降解菌株P.domesticum LJD‑1及其菌剂和应用。本发明从杭州某石油污染场地取得土壤样品中驯化和分离得到一株以菲为碳源的降解菌株LJD‑1。LJD‑1能够利用菲作为碳源，在菲初始浓度分别为50mg·L‑1的无机盐培养液中培养7d后，降解率可达到79.1％，将其制成菌剂后，其降解率为61.0％。因此可见，菌株Pyronema domesticum LJD‑1及其菌剂均对菲具有较强的修复效果。因此，该菌株在石油污染土壤中多环芳烃的生物修复方面具有较好的应用潜力。

Description

一种多环芳烃降解菌株P.domesticum LJD-1及其菌剂和应用
技术领域：
本发明属于有机污染物降解领域，具体涉及一种多环芳烃降解菌株Pyronemadomesticum LJD-1及其菌剂和应用。
背景技术：
随着现代工业的快速发展，工业废水造成的污染也日益严重。各种有机污染物，如多环芳烃(PAHs)持久性存在。多环芳烃是一类具有两个或多个稠环的疏水性有机化合物，是化石燃料(煤、石油等)、废物焚烧和木材加工过程中普遍存在的副产品。
多环芳烃的生物修复或微生物降解是使用微生物去除废水中的污染物，被认为是一种具有成本效益和生态友好的补救选择，因此被用作工业污水处理厂的主要处理方法。菲是一种三环芳烃，它与PAHs的致癌性有着非常密切的关系。目前，已报道的菲降解真菌菌株较少，主要包括Trichoderma，Scedosporium，Fusarium，Penicillium和Aspergillus等。由于环境中的大部分微生物都是不可培养的，很多微生物尤其是具有特定功能的微生物都不能通过纯培养的方式分离获得。因此，筛选出能有效降解高浓度菲的菌株具有重要的应用价值和现实意义。本实验以质量浓度为50mg·L-1的菲作为菌株降解的底物，以期为多环芳烃生物处理提供数据支持。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种具有多环芳烃降解能力Pyronema domesticumLJD-1，其于2021年7月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：61797。
本研究报道菌株为Pyronema domesticum，可以从土壤中分离出来。目前关于该菌对污染物的降解研究较少，国内外也暂未有其对PAHs降解的相关报道。本研究从杭州某石油污染场地取得土壤样品中驯化和分离得到1株以高浓度菲作为碳源的菌株LJD-1，并对其进行菌种鉴定，生长特性研究。此外，将其制成菌剂，以探究LJD-1菌剂对菲的降解特性，为石油污染土壤中PAHs的生物修复提供参考。
本发明的第二个目的是提供Pyronema domesticum LJD-1在降解菲中的应用。
优选，所述的降解菲是降解石油污染土壤中的菲。
优选是将Pyronema domesticum LJD-1应用在菲污染的环境中对菲进行降解。
本发明的第三个目的是提供一种菲降解菌剂，其包含Pyronema domesticum LJD-1作为活性成分。
优选，所述的菲降解菌剂的制备方法为：
a.将玉米与水按质量比1:5比例加热制成糊状后，按质量比例150：100:10:1加入木屑，麦麸和木质素磺酸钠，挼搓成团，将团状培养基质混合物放入搓丸机中制得球状培养基质，灭菌烘干备用；
b.将Pyronema domesticum LJD-1制成菌液。
c.将菌液按质量比1:10的比例加入到质量分数3％的海藻酸钠溶液中，将球状培养基质与此溶液充分混合，完成后加入质量浓度为4％的无菌氯化钙溶液，硬化处理，得到丸状的包封真菌；
d.将包封后的真菌小丸装入无菌培养袋内，于28℃培养箱内，培养3-7天，待表面长满白色菌丝后即为菲降解菌剂。
优选，所述的步骤b的菌液是菌丝含量10g/L的菌液。
本发明的第四个目的是提供一种降解菲的方法，将所述的Pyronema domesticumLJD-1洒于含有菲的环境中，对菲进行降解。
优选，是将Pyronema domesticum LJD-1洒于菲污染的环境中对菲进行降解。
优选，是将Pyronema domesticum LJD-1洒于石油污染土壤中对菲进行降解。
本发明从杭州某石油污染场地取得土壤样品中驯化和分离得到一株以菲为碳源的降解菌株LJD-1，根据菌株形态、生理特征、ITS基因测序分析及系统发育分析，鉴定该菌株为Pyronema domesticum LJD-1。LJD-1生长的最佳环境条件为：温度为28℃，pH 6.0，不添加NaCl；该菌株的ITS基因测序分析结果显示与LJD-1最相近的菌株为Pyronemadomesticum A10(相似度为100％)。LJD-1能够利用菲作为碳源，在菲初始浓度分别为50mg·L-1的无机盐培养液中培养7d后，降解率可达到79.1％，将其制成菌剂后，其降解率为61.0％。因此可见，菌株Pyronema domesticum LJD-1及其菌剂均对菲具有较强的修复效果。因此，该菌株在石油污染土壤中多环芳烃的生物修复方面具有较好的应用潜力。
Pyronema domesticum LJD-1，其于2021年7月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：61797。
附图说明：
图1是菌株LJD-1在PDA培养基上生长72小时的正面和反面。
图2是菌株LJD-1和其相关菌的基于ITS基因序列的系统发生关系，构建方法为邻接法，自展值设定重复1000次，图中仅展示了自展值大于50％的结果，比例尺0.01代表每个核苷酸的替换率。
图3是菌株LJD-1在不同温度、pH和耐盐度条件下生长，(a)pH；(b)温度；(c)耐盐度。
图4是菌株LJD-1和LJD-1菌剂(LGD-1-agent)在含菲的无机盐培养基中的降解效率(初始浓度50mg·L-1)。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：Pyronema domesticum LJD-1的分离和鉴定
1、材料与方法
1.1样品来源
从杭州某石油污染场地取得土壤样品，以高浓度菲为碳源进行长期驯化，通过多次筛选和分离纯化得到高效的菲降菌。
1.2培养基
1.2.1无机盐培养基
无机盐培养基用于样品中微生物的富集培养，纯菌以及菌剂条件下菲降解实验。该培养基配方见表1。其配制方法是将各成分加入到溶剂水中，混合均匀，灭菌制得。
表1 无机盐培养基配方
Figure BDA0003235707570000041
Figure BDA0003235707570000051
1.2.2营养培养基
营养培养基用于真菌的分离、纯化、保藏、活化等常规微生物的培养。本实验所用的液体营养培养基种类及成分见表2。若实验需要配制固体培养基，仅需在原有培养基配方的基础上增添质量分数1.5-2％的琼脂粉。若菌株的培养条件无特别说明，培养基pH均调节至6。其配制方法是将各成分加入到溶剂水中，混合均匀，灭菌制得。
表2 Potato-Dextrose broth培养基(PDA)成分
Figure BDA0003235707570000052
1.3菌株的驯化、筛选和分离
将采集的污染土壤加入到无机盐培养基中，另加入硫酸链霉素和青霉素(浓度为100ug/ml)以抑制真菌生长，再加入浓度为100mg·L-1的菲作为降解的底物，放置于28℃培养箱中避光震荡培养。取10％的接种量转接到具有相同培养体系的新鲜100mg·L-1菲为碳源的无机盐培养基中并重复上述富集过程，7d为一个驯化周期，如此重复三次。
将上述获得的第四代富集培养样品以稀释平板法进行涂布分离，样品用营养培养基分离。将涂布好的样品置于28℃下培养，经过48小时左右，培养基表面形成明显的单菌落，根据菌落的形态大小、颜色、菌丝等特征挑取不相同的若干单菌落，并在营养培养基平板上进行划线纯化，培养。若经过划线纯化的平板上仍能观察到不同特征的单菌落，将其再次进行划线分离，直至在同一平板上只能观察到相同特征的单菌落为止。实验中筛选得到1株对菲有高效降解性能的菌株LJD-1。挑取纯化后的单菌落到相应固体试管营养培养基中培养，用灭菌后的液体石蜡进行封存，放置于-4℃长期保存。
A、形态特征
LJD-1是一株杭州某石油污染场地取得土壤样品分离出的真菌，经活化以后，在28℃有氧的条件下，PDA平板上生长72h后，能形成直径为8mm白色、圆形、白色绒毛状菌丝向上生长的菌落(图1)。该菌为专性好氧菌。
B、分子生物学特征
分子生物学特性鉴定主要包括测序及系统发育树的构建。在进行测序和构建系统发育树的之前，需先需要提取真菌的DNA(实验使用的真菌基因组DNA快速抽提试剂盒来自生工生物工程(上海)股份有限公司)。为了对真菌的分类学进行研究，通常需要扩增ITS基因以及构建系统发育树，扩增的基因为真核中编码rRNA所组成部分中的一段DNA，因其具有高度的保守性、特异性和较合适的序列长度，通常被用于检测和鉴定真菌。
聚合酶链式反应(PCR)主要是用来扩增不同的基因片段，PCR需要不同的引物(ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，PCR扩增反应的体系：10×buffer 2.5μl，Mg2+(25mmol/l)1.5μl，dNTP(25mmol/l)0.3μl，正向引物(10mmol/l)0.5μl，反向引物(10mmol/l)0.5μl，Taq酶：0.25μl，DNA组模板0.1μl，去离子水19.35μl。PCR扩增反应条件：95℃预变性3min，95℃45s，56℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环。72℃延伸10min，反应结束后于4℃条件下保存。扩增所需基因后用0.75-1％的琼脂糖并加入核酸染色剂GelRed配制成凝胶块，在凝胶块中加入PCR产物和包含各种长度片段的DNA标记物(maker)并放置于电泳仪内，电泳仪内装入TBE(Tris硼酸)缓冲液，使电泳仪在一定的电压下工作20min后取出，放置于300nm的紫外灯下进行观察以确定PCR产物扩增反应成功。然后将扩增成功的pcr产物送往华大基因科技有限公司测序，测序引物与扩增引物相同。
将测序所得的真菌ITS基因序列上传到EzTaxon-e(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/上，此网站会将提交的序列与已被公认种的典型菌株的ITS基因序列进行比对，得到序列间的相似度信息。根据序列比对的结果分析即可选取相应的典型菌株作为本实验分离菌株的模式菌，同时还可以获得模式菌的ITS基因序列，构建系统发育分析以证明模式菌与实验分离菌株具有差异，从而来鉴定分离的菌株。构建系统发育树利用MEGA5.05程序，通常采用邻接法、最小进化法和最大简约法构建进化树，其中最常用的为邻接法，自展值常设定为重复1000次计算。
通过ITS基因比对发现，该菌株LJD-1(其ITS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)与Pyronema domesticum strain A10的基因相似度为100％。由以上结果可得出本实验所分离的真菌LJD-1为Pyronema domesticum这个种。
利用LJD-1的ITS基因序列和与其相似度较高的ITS基因序列制作系统发育树，从而获得LJD-1的ITS基因与其相似性较高的ITS基因之间的同源性结果。采用邻位相接法构建的系统发育树见图2。目前，在环境领域内关于该菌株的应用鲜有报道。因此，得到高效的菲降解菌对PAHs污染土壤的处理和深度修复有重要的理论和实际意义。
由以上结果可得出本实验所分离的真菌LJD-1为Pyronema domesticum这个种。命名为Pyronema domesticum LJD-1，于2021年7月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：61797。
实施例2：Pyronema domesticum LJD-1的生长条件
A、生长温度的测定：
配置菌株生长所需的液体营养培养基(实施例1的PDA培养基)，配好后拿到灭菌锅进行灭菌。将活化好的菌种Pyronema domesticum LJD-1 0.1ml接入到10ml PDA培养基中(实验组)，用不接种真菌的PDA培养基作为对照(对照组)，将培养基放入不同温度下培养7天，对照组和每个温度对应的实验组均有三个重复，每天都需观察真菌的生长情况，7天后将培养基倒入称重的离心管后5000转离心30min，倒掉上清液后，放入60度烘箱烘至恒重，称重计算真菌菌丝干重。测试温度如下：18℃、23℃、28℃、33℃和38℃。
B、生长pH的测定：
配置菌株生长所需的液体营养培养基(实施例1的PDA培养基)，用如下缓冲体系调节培养液的pH，pH 4.0-5.0，0.1mol/l柠檬酸钠和0.1mol/l柠檬酸；pH 6.0–8.0，0.1mol/lNaOH和0.1mol/l KH2PO4；pH 9.0，0.1mol/l NaHCO3和0.1mol/l Na2CO3。将活化好的菌种Pyronema domesticum LJD-1 0.1ml接入到10ml不同pH值的PDA培养基中(实验组)，每个pH做三个重复，用不接种真菌的培养基作为对照，将培养基放入新菌生长最适温度下培养7d，每天都需观察真菌的生长情况，7天后将培养基倒入称重的离心管后5000转离心30min，倒掉上清液后，放入60度烘箱烘至恒重，称重计算真菌菌丝干重。测试的pH如下：4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。
C、盐浓度耐受：配置菌株生长所需的液体营养培养基(实施例1的PDA培养基)，调节培养基的盐浓度。将活化好的菌种Pyronema domesticum LJD-1 0.1ml接入到10ml不同盐浓度的PDA培养基中(实验组)，每个盐浓度做三个重复，用不接菌的培养基作为对照，将培养基放置在新菌生长最适温度下培养7d，7天后将培养基倒入称重的离心管后5000转离心30min，倒掉上清液后，放入60度烘箱烘至恒重，称重计算真菌菌丝干重最好得到新菌所能耐受的盐浓度范围。测试盐浓度如下：质量分数0％、2％、4％、6％、8％、10％。
如图3所示，在PDA培养基中，LJD-1能够在23-38℃的温度条件下生长，最适生长温度为该菌的富集温度28℃；该菌能够在4.0-9.0的pH条件下生长，最适生长pH为6.0；该菌的盐耐受能力较弱，能在盐浓度为0％到3％的条件下生长，且在无盐下长势最好。
实施例3：菲降解实验
一、菌剂的制备
1.将玉米与水按质量比1:5比例加热制成糊状后，按质量比例150：100:10:1加入木屑(过200目筛)，麦麸和木质素磺酸钠，挼搓成团。将团状培养基质混合物放入搓丸机中制得直径为8mm的球状培养基质，灭菌烘干备用。
2.将培养好的LJD-1真菌制成菌丝含量为10g/L的菌液。
3.将菌液按质量比1:10的比例加入到质量分数3％的海藻酸钠溶液中，将上述球状培养基质与此溶液充分混合，完成后加入质量浓度为4％的无菌氯化钙溶液，硬化处理20min，得到丸状的包封真菌。
4.将包封后的真菌小丸装入无菌培养袋内，于28℃培养箱内，培养3-7天，待表面长满白色菌丝后即为LJD-1菌剂。
二、将活化培养7d后的菌株LJD-1或LJD-1菌剂按10％的接种量分别接种于含有初始为50mg·L-1的菲的无机盐培养基(实施例1，去掉NaCl，pH 6.0)中，温度28℃振荡培养7d，并做平行实验3次。不添加纯菌Pyronema domesticum LJD-1和LJD-1菌剂的处理为对照处理。
取各处理样品用于化学分析，具体步骤如下：(1)样品预处理：将各培养样品加入二氯甲烷萃取，同时添加5μL浓度为200mg/L的回收率指示剂(菲-d10)，充分震荡后转入分液漏斗中静置。分层后收集有机相，把下层液体放回摇瓶再用等体积二氯甲烷重复萃取，合并萃取液，并将其转移至含有适量已活化铜片的平底烧瓶中进行旋转蒸发，浓缩至约2mL，加入少量正己烷(约5mL)，旋转蒸发至2mL，重复洗三次，将有机溶剂置换为正己烷。置换后的浓缩液用玻璃填充柱(直径约为9mm)净化。柱填料自下而上为3cm 3％去活化中性氧化铝，3cm 3％去活化硅胶和1cm的无水硫酸钠。用适量正己烷活化柱子，15mL正己烷/二氯甲烷(体积比为1:1)混合试剂淋洗填充柱，并用棕色试剂瓶收集洗脱液约15mL，氮吹使其浓缩至约0.5mL，最后转移至1.5mL细胞瓶中，冷冻保存。上机测定前加入5μL内标物六甲基苯，其浓度为200mg/L。(2)仪器分析：安捷伦7890气相色谱仪-5975质谱仪联用测定PAHs含量。采用安捷伦DB 5-MS(柱长30m，内径0.25mm，膜厚度0.25μm)毛细管色谱柱进行分离分析，流速1.2ml/min。所得数据用安捷伦色谱工作站处理，菲定量用6点校正曲线和内标法进行。
根据GC-MS测定并分析得出菌株LJD-1和菌剂均能够降解菲，并且在含有50mg/L浓度菲的无机盐培养液中培养7天后，降解率均可达到60％以上(图4)。其中LJD-1纯菌的降解率为79.1％，将其制成菌剂后，其降解率为61.0％。说明菌株LJD-1是一种能降解菲的强效菌，并且制成菌剂后，也可以发挥降解菲的作用。
结论：
1、从杭州某石油污染场地取得土壤样品中富集分离获得1株能以菲为碳源生长的菲降解菌LJD-1。
2、该菌株为能能形成直径为8mm左右、白色、圆形、白色绒毛状菌丝向上生长的菌落。该菌为专性好氧菌。根据分子生物学手段分析，可得出本实验所分离的真菌LJD-1为Pyronema domesticum菌株，并绘制了其进化树。目前针对该菌株应用的报道很少，尤其是利用其降解多环芳烃和菲的研究尚未见报道。
3、菌株LJD-1的最佳生长条件为温度28℃，pH 6.0，不添加NaCl。LJD-1能够利用菲作为碳源对其进行降解，在菲初始浓度在50mg·L-1的无机盐培养液中培养7d后，降解率可达到79％以上。将菌株LJD-1制成菌剂后，也可以高效地降解菲(降解率为61.0％)。综上，LJD-1是一种能够高效降解多环芳烃的真菌，用其制成的菌剂同样具有较好的降解效果，在生物修复PAHs方面具有较好的应用潜力。
序列表
<110> 中国科学院广州地球化学研究所
<120> 一种多环芳烃降解菌株P.domesticum LJD-1及其菌剂和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 579
<212> DNA
<213> Pyronema domesticum LJD-1
<400> 1
gaacctgcgg aaggatcatt aaaagttaat tggttatact ccggtataaa tctaattaaa 60
cacctctgag taccttacct gttgcttccg tgaggcctga ctccagtagt ggttcgccac 120
cactggatac ttgcggaagg tatacactta aacactttga atctatgtca tctgtctgat 180
aatgtttata acaaacgtta aaactttcaa caacggatct cttggttctc gcatcgatga 240
agaacgcagc gaaatgcgat aagtagtgtg aattgcagaa ttcagtgaat catcgaatct 300
ttgaacgcac attgcgcctc ctggtattcc gggaggcatg cctgttcgag cgtcattaaa 360
acctcctcaa gctcttttgc ttggtattgg aagaagaggc cgcttgtcgg tctccctttc 420
gaaatgcaat ggcagattgc ctcatgtgcc ctggcgtaat aagatttatc tttcgcttgt 480
gcattgggat gatcccgccg caaaccccca attttttctg gttgacctcg gatcaggtag 540
ggatacccgc tgaacttaag catatcaata agcggagga 579

Claims (10)

1.砖火丝菌（Pyronema domesticum）LJD-1，保藏编号为：GDMCC No：61797。
2.权利要求1所述的砖火丝菌LJD-1在降解菲中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的降解菲是降解石油污染土壤中的菲。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，是将砖火丝菌LJD-1应用在菲污染的环境中对菲进行降解。
5.一种菲降解菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述的砖火丝菌LJD-1作为活性成分。
6.根据权利要求5所述的菲降解菌剂，其特征在于，所述的菲降解菌剂的制备方法为：
a.将玉米与水按质量比1:5比例加热制成糊状后，按质量比例150：100:10:1加入木屑，麦麸和木质素磺酸钠，挼搓成团，将团状培养基质混合物放入搓丸机中制得球状培养基质，灭菌烘干备用；
b.将砖火丝菌LJD-1制成菌液；
c.将菌液按质量比1:10的比例加入到质量分数3%的海藻酸钠溶液中，将球状培养基质与此溶液充分混合，完成后加入质量浓度为4 %的无菌氯化钙溶液，硬化处理，得到丸状的包封真菌；
d.将包封后的真菌小丸装入无菌培养袋内，于28℃培养箱内，培养3-7天，待表面长满白色菌丝后即为菲降解菌剂。
7. 根据权利要求6所述的菲降解菌剂，其特征在于，所述的步骤b的菌液是菌丝含量10g/L的菌液。
8.一种降解菲的方法，其特征在于，将权利要求1所述的砖火丝菌LJD-1洒于含有菲的环境中，对菲进行降解。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，是将砖火丝菌LJD-1洒于菲污染的环境中对菲进行降解。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，是将砖火丝菌LJD-1洒于石油污染土壤中对菲进行降解。
CN202111001793.5A 2021-08-30 2021-08-30 一种多环芳烃降解菌株P.domesticum LJD-1及其菌剂和应用 Active CN113755338B (zh)

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