CN113755371B - 菌株A.seifertii P52-1及其在降解多氯联苯中的应用 - Google Patents

菌株A.seifertii P52-1及其在降解多氯联苯中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了菌株A.seifertii P52‑1及其在降解多氯联苯中的应用。Acinetobacter seifertii P52‑1，其于2021年7月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：61707。本发明从广东省清远某电子垃圾回收厂污水沉积物底泥中驯化和分离得到一株以多氯联苯为碳源的降解菌株P52‑1。该菌株能够利用多氯联苯作为碳源，在多氯联苯初始浓度分别为10mg·L‑1的无机盐培养液中培养10天后，降解率均可达到60％以上。因此，该菌株在多氯联苯的生物修复方面具有较好的应用潜力。

Description

菌株A.seifertii P52-1及其在降解多氯联苯中的应用
技术领域：
本发明属于有机污染物降解领域，具体涉及菌株Acinetobacter seifertii P52-1及其在降解多氯联苯中的应用。
背景技术：
多氯联苯(Polychlorinated Biphenyls,PCBs)是联苯上的氢原子被一个或多个氯原子取代后形成的氯代烃类化合物。根据氯原子取代数目和位置的不同，共有209种同系物。PCBs是一种持久性有机污染物(POPs,Persistent Organic Pollutants)，具有较高的辛醇-水分配系数，极难溶于水而易溶于脂肪和有机溶剂，易通过食物链危害人类的健康。因为PCB的高危害性，在2001年就被列入《斯德哥尔摩公约》中规定的12种优先控制污染物之一。
环境中有毒有害有机污染物的自然衰减主要依赖相关微生物代谢作用，生物修复技术具有成本低、效果好、无二次污染等优点，因此该方法是目前多氯联苯污染修复最具潜力的修复手段。目前，已报道的多氯联苯降解菌株较少，主要包括厌氧降解细菌Desulfitobacterium、Dehalospirillum multivorans、Desulfomonile tiedjei、Dehalobacter restricus、Desulforomonas chloroethenica和好氧降解菌Burkholderiaxenovorans、Alcaligenes sp.和Sphingomonas paucimobilis。然而，大部分降解细菌都属于严格厌氧细菌，需要在严格的厌氧条件下对高氯PCBs(四氯以上的高氯联苯)进行脱氯，降解成低氯联苯。低氯联苯很少进行厌氧脱氯过程，大部分低氯联苯可以直接被好氧降解菌经过联苯降解途径转化为氯代苯甲酸，产生的氯代苯甲酸通过其他好氧菌进一步矿化为二氧化碳和水。由于环境中的大部分微生物都是不可培养的，很多微生物尤其是具有特定功能的微生物都不能通过纯培养的方式分离获得。因此，筛选出能有效降解多氯联苯的菌株具有重要的应用价值和现实意义。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种具有多氯联苯降解能力的Acinetobacterseifertii P52-1，其于2021年7月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：61707。
本研究报道菌株为Acinetobacter seifertii P52-1，据报道，Acinetobacterseifertii P52-1菌株对于有机化合物如乙酸、乙醇具有显著的降解能力，但关于该菌株对有机污染物，尤其是持久性有机污染物如多氯联苯降解研究国内外还未见报道。本研究从广东省清远市某电子垃圾回收厂污水底泥中驯化和分离得到1株以高浓度多氯联苯(PCB9)作为碳源的菌株P52-1，对其进行鉴定，并研究其生长特性和对PCB9的降解特性，为PCBs污染环境的生物修复提供参考。
本发明的第二个目的是提供Acinetobacter seifertii P52-1在降解多氯联苯中的应用。
优选，所述的多氯联苯是PCB9。
优选，所述的降解多氯联苯是降解土壤或污水中的多氯联苯。
优选是将Acinetobacter seifertii P52-1应用在多氯联苯污染的环境中对多氯联苯进行降解。
本发明的第三个目的是提供一种多氯联苯降解菌剂，其包含Acinetobacterseifertii P52-1作为活性成分。
本发明的第四个目的是提供一种降解多氯联苯的方法，将所述的Acinetobacterseifertii P52-1洒于含有多氯联苯的环境中，对多氯联苯进行降解。
优选，是将Acinetobacter seifertii P52-1洒于多氯联苯污染的环境中对多氯联苯进行降解。
本发明从广东省清远某电子垃圾回收厂污水沉积物底泥中驯化和分离得到一株以多氯联苯为碳源的降解菌株P52-1，根据菌株形态、革兰氏反应、16S rDNA基因测序分析及系统发育分析，鉴定该菌株为Acinetobacter seifertii P52-1。P52-1生长的最佳环境条件为：温度为35℃，pH值为7；该菌株的16S rDNA基因测序分析结果显示与P52-1最相近的菌株为Acinetobacter seifertii(相似的100％)。该菌株能够利用多氯联苯作为碳源，在多氯联苯初始浓度分别为10mg·L-1的无机盐培养液中培养10天后，降解率均可达到60％以上。因此，该菌株在多氯联苯的生物修复方面具有较好的应用潜力。
Acinetobacter seifertii P52-1，其于2021年7月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：61707
附图说明：
图1是在以多氯联苯为碳源的无机盐固体培养基上生长的P52-1。
图2是P52-1和其相关菌的基于16S rRNA基因序列的系统发生关系，构建方法为邻接法，自展值设定重复1000次，图中仅展示了自展值大于50％的结果，比例尺0.005代表每个核苷酸的替换率。
图3是菌株在高浓度PCB9的无机盐培养基中的降解效率(初始浓度10mg·L-1)。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：Acinetobacter seifertii P52-1的分离和鉴定
1、材料与方法
1.1样品来源
从广东清远某电子垃圾回收厂污水底泥中采集污水样品，以高浓度多氯联苯(PCB9)为碳源进行长期驯化，通过多次筛选和分离纯化得到高效的多氯联苯降解菌。
1.2培养基
1.2.1无机盐培养基
无机盐培养基用于样品中微生物的富集培养，纯菌条件下多氯联苯降解实验。该培养基配方见表1。其配制方法是将各成分加入到溶剂水中，混合均匀，灭菌制得。
表1无机盐培养基配方
Figure BDA0003235720370000041
1.2.2营养培养基
营养培养基用于细菌的分离、纯化、保藏、活化等常规微生物的培养。本实验所用的液体营养培养基种类及成分见表2。若实验需要配制固体培养基，仅需在原有培养基配方的基础上增添质量分数1.5-2％的琼脂粉。若菌株的培养条件无特别说明，培养基pH均调节至7。其配制方法是将各成分加入到溶剂水中，混合均匀，灭菌制得。
表2Luria-Bertani培养基(LB)成分
Figure BDA0003235720370000051
1.3菌株的驯化、筛选和分离
将采集的污水加入到营养培养基(LB)中，分别以浓度为10mg·L-1的多氯联苯作为降解的底物(即在LB中加入多氯联苯，使其终浓度为10mg·L-1)，放置于30℃培养箱中避光震荡培养。利用以多氯联苯为碳源的无机盐培养基进行菌株驯化，7d为一个驯化周期。取10％的接种量转接到具有相同培养体系的新鲜营养培养基(LB)中并重复上述富集过程，如此重复三次。
将上述获得的第四代富集培养样品以稀释平板法进行涂布分离，样品用营养培养基(LB)分离。将涂布好的样品置于原培养温度30℃条件下培养，经过48小时左右，培养基表面形成明显的单菌落，根据菌落的形态大小、颜色、透明度等特征挑取不相同的若干单菌落，并在营养培养基平板上进行划线纯化，培养。若经过划线纯化的平板上仍能观察到不同特征的单菌落，将其再次进行划线分离，直至在同一平板上只能观察到相同特征的单菌落为止。实验中筛选得到1株对多氯联苯有高效降解性能的菌株P52-1。挑取纯化后的单菌落到相应液体营养培养基中培养至对数期，将菌液和无菌的甘油混合分装至无菌的2ml冻存管中(甘油浓度为15％)，放置于-80℃长期保存。
A、形态特征
菌株P52-1是一株从广东清远某电子垃圾回收厂污水底泥中分离出的细菌，经活化以后，在30℃有氧的条件下该无机盐培养基制成的平板上生长48h后，能形成直径为1.0-2.0mm白色、圆形、表面光滑、向上凸起的、革兰氏染色呈阴性、菌株个体为杆状的菌落。该菌为专性好氧菌，氧化酶阴性，过氧化氢酶阳性，其在无机盐上生长的群落图见图1。
B、菌株P52-1的分子生物学特征
分子生物学特性鉴定主要包括测序及系统发育树的构建。在进行测序和构建系统发育树的之前，需先需要提取细菌的DNA(实验使用的细菌基因组DNA快速提取试剂盒来自北京艾德莱生物科技有限公司)。为了对细菌的分类学进行研究，通常需要扩增16S rRNA基因以及构建系统发育树，扩增的基因为原核生物中编码rRNA所组成部分中的一段DNA，因其具有高度的保守性、特异性和较合适的序列长度，通常被用于检测和鉴定细菌。
聚合酶链式反应(PCR)主要是用来扩增不同的基因片段，PCR需要不同的引物(27F和1492R)，PCR扩增反应的体系：10×buffer 2.5μl，Mg2+(25mmol/l)1.5μl，dNTP(25mmol/l)0.3μl，正向引物(10mmol/l)0.5μl，反向引物(10mmol/l)0.5μl，Taq酶：0.25μl，DNA组模板0.1μl，去离子水19.35μl。Pcr扩增反应条件：95℃条件下变性，55℃的条件下退火，72℃的条件下延伸，这个过程循环30次，72℃的条件下延伸10min，pcr反应结束后于4℃条件下保存。扩增所需基因后用0.75-1％的琼脂糖并加入核酸染色剂GelRed配制成凝胶块，在凝胶块中加入PCR产物和包含各种长度片段的DNA标记物(maker)并放置于电泳仪内，电泳仪内装入TBE(Tris硼酸)缓冲液，使电泳仪在一定的电压下工作20min后取出，放置于300nm的紫外灯下进行观察以确定PCR产物扩增反应成功。然后将扩增成功的pcr产物送往华大基因科技有限公司测序，测序引物与扩增引物相同。
将测序所得的细菌16s rRNA基因序列上传到EzTaxon-e(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)上，此网站会将提交的序列与已被公认种的典型菌株的16S rRNA基因序列进行比对，得到序列间的相似度信息。根据序列比对的结果分析即可选取相应的典型菌株作为本实验分离菌株的模式菌，同时还可以获得模式菌的16S rRNA基因序列，构建系统发育分析以证明模式菌与实验分离菌株具有差异，从而来鉴定分离的菌株。构建系统发育树利用MEGA 5.05程序，通常采用邻接法、最小进化法和最大简约法构建进化树，其中最常用的为邻接法，自展值常设定为重复1000次计算。
通过PCR和基因测序得到该菌株的16S rRNA基因序列(其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示)。通过16S rRNA基因比对发现，该菌株与Acinetobacter seifertii CMCC(B)25090(MW255151.1)和Acinetobacter seifertii WS1(MT632639.1)的基因相似度为100％。由以上结果可得出本实验所分离的细菌P52-1为Acinetobacter seifertii这个种。。
利用P52-1的16S rRNA基因序列和与其相似度较高的16S rRNA基因序列制作系统发育树，从而获得其16S rRNA基因与其相似性较高的16S rRNA基因之间的同源性结果。采用邻位相接法构建的系统发育树见图2。目前，在环境领域内关于该菌株的应用鲜有报道。因此，得到高效的多氯联苯降解菌对含PCBs污染水体、底泥和土壤的处理和深度修复有重要的理论和实际意义。
由以上结果可得出本实验所分离的菌株P52-1为Acinetobacter seifertii这个种，命名为Acinetobacter seifertii P52-1，其于2021年7月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：61707。
实施例2：Acinetobacter seifertii P52-1的生长条件
A、生长温度的测定：
配置菌株生长所需的营养培养基(LB)，配好后拿到灭菌锅进行灭菌。将活化好的菌种0.1ml接入到10ml培养基内(实验组)，用不接种细菌的培养基作为对照(对照组)，将培养基放入不同温度下培养18h，对照组和每个温度对应的实验组均有三个重复，每天都需观察细菌的生长情况，当遇到肉眼难以区分的结果时，用可见-紫外分光光度计测定培养基在波长λ＝600nm处的吸光值，最后得出新菌可生长温度和最适生长温度范围。测试温度如下：4℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃和55℃。
B、生长pH的测定：
配置菌株生长所需的营养培养基(LB)，用如下缓冲体系调节培养液的pH，pH 4.0-5.0，0.1mol/l柠檬酸钠和0.1mol/l柠檬酸；pH 6.0–8.0，0.1mol/l NaOH和0.1mol/lKH2PO4；pH9.0–10.0，0.1mol/l NaHCO3和0.1mol/l Na2CO3；pH 11.0，0.1mol/l NaOH和0.05mol/lNa2HPO4。配好后拿到灭菌锅进行灭菌。活化好的菌种0.1ml接入到10ml培养基内，每个pH做三个重复，用不接种细菌的培养基作为对照，将培养基放入新菌生长最适温度下培养7d，每天都需观察细菌的生长情况，当遇到肉眼难以区分的结果时，用可见-紫外分光光度计测定培养基在波长λ＝600nm处的吸光值，最后得出新菌可生长pH和最适生长pH范围。测试的pH如下：3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。
在营养培养基中，P52-1能够在25-45℃的温度条件下生长，最适生长温度为35℃；该菌能够在4.0-9.0的pH条件下生长，最适生长pH为7.0。
实施例3：多氯联苯(PCB9)降解实验
将处于对数生长期的Acinetobacter seifertii P52-1按10％的接种量分别接种于含有初始为10mg·L-1的多氯联苯(PCB9)的无机盐培养基(实施例1)中，温度35℃振荡培养10d，并做平行实验3次。不添加纯菌Acinetobacter seifertii P52-1的处理为对照处理。
取各处理样品用于化学分析，具体步骤如下：(1)样品预处理：将各培养样品加入二氯甲烷萃取，同时添加5μL浓度为200mg/L的回收率指示剂(13C-PCB9)，充分震荡后转入分液漏斗中静置。分层后收集有机相，把下层液体放回摇瓶再用等体积二氯甲烷重复萃取，合并萃取液，并将其转移至含有适量已活化铜片的平底烧瓶中进行旋转蒸发，浓缩至约2mL，加入少量正己烷(约5mL)，旋转蒸发至2mL，重复洗三次，将有机溶剂置换为正己烷。置换后的浓缩液用玻璃填充柱(直径约为9mm)净化。柱填料自下而上为3cm 3％去活化中性氧化铝，3cm 3％去活化硅胶和1cm的无水硫酸钠。用适量正己烷活化柱子，15mL正己烷/二氯甲烷(体积比为1:1)混合试剂淋洗填充柱，并用棕色试剂瓶收集洗脱液约15mL，氮吹使其浓缩至约0.5mL，最后转移至1.5mL细胞瓶中，冷冻保存。(2)仪器分析：采用安捷伦7890气相色谱仪-5975质谱仪联用测定各处理样品中PCBs含量。使用的色谱柱为安捷伦DB5-MS毛细管色谱柱(柱长30m，内径0.25mm，膜厚度0.25μm)。所得数据用安捷伦色谱工作站处理，多氯联苯定量用6点校正曲线和内标法进行。微生物细胞浓度的测定采用光电比浊法，以OD来表示，即波长为600nm时紫外光透过所测定菌液样品的光密度值。
根据GC-MS测定并分析得出菌株P52-1能够降解多氯联苯，并且在含有10mg/L浓度PCB9的无机盐培养液中培养10天后，降解率可达到60％以上(图3)。说明菌株P52-1是一种能够降解多氯联苯，且耐受多氯联苯能力很强的菌株，对PCBs适应性强。
结论：
1、从广东清远某电子垃圾回收厂污水底泥中富集分离获得1株能以多氯联苯为碳源生长的多氯联苯降解菌P52-1。
2、该菌株为革兰氏染色呈阴性菌，能形成直径为1.0-2.0mm、白色、圆形、表面光滑、向上凸起的、菌株个体为杆状的菌落。根据分子生物学手段分析，可得出本实验所分离的细菌P52-1为Acinetobacter seifertii，并绘制了其进化树。目前针对该菌株应用的报道十分少见，尤其是利用其降多氯联苯的研究尚未见报道。
3、菌株的最佳生长条件为确定菌株的最佳生长条件为温度35℃，pH 7.0。菌株P52-1能够利用多氯联苯作为碳源对其进行降解，在PCB9初始浓度在10mg·L-1的无机盐培养液中培养10天后，降解率可达到60％以上。综上，P52-1是一种能够降解多氯联苯且对多氯联苯具有很强耐受能力的菌株，对多氯联苯适应性强，在生物修复方面具有较好的应用潜力。
序列表
<110> 中国科学院广州地球化学研究所
<120> 菌株A.seifertii P52-1及其在降解多氯联苯中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1394
<212> DNA
<213> Acinetobacter seifertii P52-1
<400> 1
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Claims (8)

1.Acinetobacter seifertii P52-1，保藏编号为：GDMCC No：61707。
2.权利要求1所述的Acinetobacter seifertii P52-1在降解多氯联苯中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的多氯联苯是PCB9。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的降解多氯联苯是降解土壤或污水中的多氯联苯。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，是将Acinetobacter seifertii P52-1应用在多氯联苯污染的环境中对多氯联苯进行降解。
6.一种多氯联苯降解菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述的Acinetobacterseifertii P52-1作为活性成分。
7.一种降解多氯联苯的方法，其特征在于，将权利要求1所述的Acinetobacterseifertii P52-1洒于含有多氯联苯的环境中，对多氯联苯进行降解。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，是将Acinetobacter seifertii P52-1洒于多氯联苯污染的环境中对多氯联苯进行降解。
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