CN117736905A - 一株Brucella intermedia XC-2及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株Brucella intermedia XC‑2及其应用。Brucella intermedia XC‑2保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：63809。本研究从石油污染场地中驯化和分离得到1株以高浓度菲和萘作为碳源的菌株XC‑2，并对其进行菌种鉴定，生长特性研究。此外，我们还探究了XC‑2对菲和萘的降解特性，为PAHs污染的生物修复提供参考。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株Brucella intermedia XC-2及其应用。
背景技术
目前，随着人们对煤以及石油在工业生产、交通运输等方面的需求不断增大，多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)排放问题日益凸显。PAHs指由两个或两个以上苯环结构组成的烃类有机化合物，是一种具有生物放大、累积效应以及致癌、致畸和致突变的持久性有机污染物(POPs)(Kuppusamy S et al.,2015)，对人类健康和生态安全造成严重威胁。PAHs的危害已引起国际社会广泛关注，美国环境保护署(EPA)将16种PAHs列为了优先控制污染物(Asagbra M C et al.,2015)，我国也将部分PAHs指标列入了水土环境的相关标准中(申月芳等，2023)。萘和菲是研究PAHs降解的模式化合物，其中，菲由3个苯环稠合而成，具有PAHs的典型结构—k区和湾区，它们均广泛存在于水体、沉积物、土壤等自然环境中(Seo et al.,2009)。
通常，修复PAHs污染的方法有物理、化学、植物和微生物修复等。与其他修复方法相比，微生物法处理有毒有机污染物具有操作简便、成本较低、治理效果较好、无二次污染等优点。微生物降解法是指通过自然界中的细菌或细菌将多环芳烃部分或完全转化为可供其自身利用的物质(Eevers Net al.,2017)，达到实际降解的目的，由于多环芳烃的亲脂性对微生物的细胞膜有直接影响，因此这也是生物降解法亟待解决的问题。自然界中存在很多细菌可用于降解菲、萘等多环芳烃，已经发现且降解能力较好的有荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、洋葱伯克霍尔德氏菌、解环菌属、真养产碱杆菌、萘酚单胞菌、争论产碱杆菌、鞘氨醇单胞菌属和贝耶林基亚菌属等。除了细菌，自然界中还有一些细菌和海洋微藻可以降解菲。Fu等研究了接种内生菌对菲的去除作用(Fu et al.,2018)。此外，Mansouri等报道了反硝化产碱菌、分枝杆菌和枯草芽孢杆菌，具有降解低PAHs分子量的能力(Mansouri Aetal.,2017)。因此，筛选出能有效降解高浓度菲、萘的菌株具十分重要的应用价值和现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供Brucella intermedia XC-2保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：63809。
本发明的第二个目的是提供一种菌剂，包含上述Brucella intermedia XC-2作为活性成分。
本发明的第三个目的是提上述Brucella intermedia XC-2或其菌剂在在多环芳烃和/或石油烃污染环境的生物修复中的应用。
所述的多环芳烃和/或石油烃污染环境包括多环芳烃和/或石油烃污染的土壤和水体。
所述的多环芳烃为PAHs。
进一步优选为菲和萘。
本研究采用50mg·L-1的菲和萘同时作为菌株降解底物，以期为多环芳烃生物处理提供数据支持。本研究报道菌株为Brucella intermedia XC-2，目前关于该菌对污染物的降解研究较少，国内外也暂未有其对PAHs降解的相关报道。本研究从石油污染场地中驯化和分离得到1株以高浓度菲和萘作为碳源的菌株XC-2，并对其进行菌种鉴定，生长特性研究。此外，我们还探究了XC-2对菲和萘的降解特性，为PAHs污染的生物修复提供参考。
Brucella intermedia XC-2保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：63809。
附图说明
图1是菌株XC-2的形态特征；
图2是采用邻位相接法构建的系统发育树；
图3是菌株XC-2对菲、萘的降解率。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
1 材料与方法
1.1 样品来源
供试土壤采自山东某石油污染场地表层土壤，以高浓度菲和萘为碳源对其进行长期驯化，通过多次筛选和分离纯化得到高效PAHs降解细菌。
1.2培养基
1.2.1无机盐培养基
土壤微生物的富集培养以及纯菌条件下菲和萘的降解实验，均采用无机盐培养基培养，其配方如表1(含苯并[a]芘溶液)所示。
表1无机盐培养基配方
1.2.2营养培养基
营养培养基用于细菌的分离、纯化、保藏、活化等常规微生物的培养。本实验所用的液体营养培养基种类及成分见表2。若实验需要配制固体培养基，仅需在原有培养基配方的基础上增添1.5-2％的琼脂粉。若菌株的培养条件无特别说明，培养基pH均调节至7.0。
表2Luria-Bertani培养基(LB)成分
1.3菌株的驯化、筛选和分离
将采集的土壤加入到营养培养基中，分别以浓度为50mg·L-1的菲和萘作为降解的底物，放置于30℃培养箱中避光震荡培养。利用以菲和萘为碳源的无机盐培养基进行菌株驯化，7d为一个驯化周期。取10％的接种量转接到具有相同培养体系的新鲜营养培养基中并重复上述富集过程，如此重复三次。
将上述获得的第四代营养培养样品以稀释平板法进行涂布分离，样品用营养培养基分离。将涂布好的样品置于原培养温度条件下培养，经过48小时左右，培养基表面形成明显的单菌落，根据菌落的形态大小、颜色、透明度等特征挑取不相同的若干单菌落，并在营养培养基平板上进行划线纯化，培养。若经过划线纯化的平板上仍能观察到不同特征的单菌落，将其再次进行划线分离，直至在同一平板上只能观察到相同特征的单菌落为止。实验中筛选得到1株对菲和萘均有高效降解性能的菌株XC-2。挑取纯化后的单菌落到相应液体营养培养基中培养至对数期，将菌液和无菌的甘油混合分装至无菌的2ml冻存管中(甘油浓度为15％)，放置于-80℃长期保存。
1.4菌株的生长条件
生长温度的测定：配置菌株生长所需的液体营养培养基，配好后拿到灭菌锅进行灭菌。将活化好的菌种接入到培养基内(实验组)，用不接种细菌的培养基做为对照(对照组)，将培养基放入不同温度下培养18h，对照组和每个温度对应的实验组均有三个重复，每天都需观察细菌的生长情况，当遇到肉眼难以区分的结果时，用可见-紫外分光光度计测定培养基在波长λ＝600nm处的吸光值，最后得出新菌可生长温度和最适生长温度范围。测试温度如下：4℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃和55℃。
生长pH的测定：配置菌株生长所需的液体营养培养基，用如下缓冲体系调节培养液的pH，pH 4.0-5.0，0.1mol/l柠檬酸钠和0.1mol/l柠檬酸；pH 6.0–8.0，0.1mol/l NaOH和0.1mol/lKH2PO4；pH 9.0–10.0，0.1mol/l NaHCO3和0.1mol/l Na2CO3；pH 11.0，0.1mol/lNaOH和0.05mol/l Na2HPO4。将细菌接入到培养基内，每个pH做三个重复，用不接种细菌的培养基作为对照，将培养基放入新菌生长最适温度下培养7d，每天都需观察细菌的生长情况，当遇到肉眼难以区分的结果时，用可见-紫外分光光度计测定培养基在波长λ＝600nm处的吸光值，最后得出新菌可生长pH和最适生长pH范围。测试的pH如下：3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。
盐浓度耐受：配置菌株生长所需的液体营养培养基，调节培养基的盐浓度。将活化好的新菌接入到已灭菌的培养基内，每个盐浓度做三个重复，用不接菌的培养基作为对照，将培养基放置在新菌生长最适条件下培养7d，每天都需观察细菌的生长情况，当遇到肉眼难以区分的情况时，用可见-紫外分光光度计测定培养基在波长λ＝600nm处的吸光值，最好得到新菌所能耐受的盐浓度范围。测试盐浓度如下：0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％。
1.5分析方法
取各处理样品用于化学分析，具体步骤如下：(1)样品预处理：将各培养样品加入二氯甲烷萃取，同时添加5μL浓度为200mg/L的回收率指示剂，充分震荡后转入分液漏斗中静置。分层后收集有机相，把下层液体放回摇瓶再用等体积二氯甲烷重复萃取，合并萃取液，并将其转移至含有适量已活化铜片的平底烧瓶中进行旋转蒸发，浓缩至约2mL，加入少量正己烷(约5mL)，旋转蒸发至2mL，重复洗三次，将有机溶剂置换为正己烷。置换后的浓缩液用玻璃填充柱(直径约为9mm)净化。柱填料自下而上为3cm 3％去活化中性氧化铝，3cm3％去活化硅胶和1cm的无水硫酸钠。用适量正己烷活化柱子，15mL正己烷/二氯甲烷(体积比为1:1)混合试剂淋洗填充柱，并用棕色试剂瓶收集洗脱液约15mL，氮吹使其浓缩至约0.5mL，最后转移至1.5mL细胞瓶中，冷冻保存。上机测定前加入5μL内标物六甲基苯，其浓度为200mg/L。(2)仪器分析：采用安捷伦7890气相色谱仪-5975质谱仪联用测定各处理样品中PAHs含量。使用的色谱柱为安捷伦DB 5-MS毛细管色谱柱(柱长30m，内径0.25mm，膜厚度0.25μm)。安捷伦7890气相色谱仪-5975质谱仪联用测定PAHs含量。采用安捷伦DB 5-MS(柱长30m，内径0.25mm，膜厚度0.25μm)毛细管色谱柱进行分离分析。所得数据用安捷伦色谱工作站处理，菲和萘定量用6点校正曲线和内标法进行。微生物细胞浓度的测定采用光电比浊法，以OD来表示，即波长为600nm时紫外光透过所测定菌液样品的光密度值。
1.6菌株鉴定
根据菌株的革兰氏染色反应结果、形态特性、生理特性对菌株进行初步鉴定。
分子生物学特性鉴定主要包括测序及系统发育树的构建。在进行测序和构建系统发育树的之前，需先需要提取细菌的DNA(实验使用的细菌基因组DNA快速提取试剂盒来自北京艾德莱生物科技有限公司)。为了对细菌的分类学进行研究，通常需要扩增16S rRNA基因以及构建系统发育树，扩增的基因为原核生物中编码rRNA所组成部分中的一段DNA，因其具有高度的保守性、特异性和较合适的序列长度，通常被用于检测和鉴定细菌。
聚合酶链式反应(PCR)主要是用来扩增不同的基因片段，PCR需要不同的引物(27F和1492R；，PCR扩增反应的体系：10×buffer 2.5μl，Mg2+(25mmol/l)1.5μl，dNTP(25mmol/l)0.3μl，正向引物(10mmol/l)0.5μl，反向引物(10mmol/l)0.5μl，Taq酶：0.25μl，DNA组模板0.1μl，去离子水19.35μl。Pcr扩增反应条件：95℃条件下变性，55℃的条件下退火，72℃的条件下延伸，这个过程循环30次，72℃的条件下延伸10min，pcr反应结束后于4℃条件下保存。扩增所需基因后用0.75-1％的琼脂糖并加入核酸染色剂GelRed配制成凝胶块，在凝胶块中加入PCR产物和包含各种长度片段的DNA标记物(maker)并放置于电泳仪内，电泳仪内装入TBE(Tris硼酸)缓冲液，使电泳仪在一定的电压下工作20min后取出，放置于300nm的紫外灯下进行观察以确定PCR产物扩增反应成功。然后将扩增成功的pcr产物送往华大基因科技有限公司测序，测序引物与扩增引物相同。
将测序所得的细菌16s rRNA基因序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)上传到EzTaxon-e(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)上，此网站会将提交的序列与已被公认种的典型菌株的16S rRNA基因序列进行比对，得到序列间的相似度信息。根据序列比对的结果分析即可选取相应的典型菌株作为本实验分离菌株的模式菌，同时还可以获得模式菌的16S rRNA基因序列，构建系统发育分析以证明模式菌与实验分离菌株具有差异，从而来鉴定分离的菌株。构建系统发育树利用MEGA 5.05程序，通常采用邻接法、最小进化法和最大简约法构建进化树，其中最常用的为邻接法，自展值常设定为重复1000次计算。
2结果与分析
2.1XC-2的鉴定
2.1.1形态特征
经活化以后，XC-2在30℃有氧的条件下该无机盐培养基制成的平板上生长48h后，能形成直径为0.5-2.0mm白色、圆形、表面光滑、微微向上凸起的、革兰氏染色呈阴性菌落。该菌为专性好氧菌(图1)。
2.1.2菌株XC-2的分子生物学特征
通过PCR和基因测序所得到的一个长为1380bp 16S rRNA基因序列。通过16S rRNA基因比对发现，该菌株与Brucella intermedia strain DN3的基因相似度为100％。由以上结果可得出本实验所分离的细菌XC-2为Brucella intermedia这个种。
利用XC-2的16S rRNA基因序列和与其相似度较高的16S rRNA基因序列制作系统发育树，从而获得XC-2的16S rRNA基因与其相似性较高的16S rRNA基因之间的同源性结果。采用邻位相接法构建的系统发育树见图2。目前，在环境领域内关于该菌株的应用鲜有报道。因此，得到高效的菲、萘降解菌对含菲、萘污染土壤的处理和深度修复有重要的理论和实际意义。
上述Brucella intermedia XC-2保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：63809。
2.1.3菌株XC-2的生长
在营养肉汤培养基中，XC-2能够在15-50℃的温度条件下生长，最适生长温度为该菌的富集温度30℃；该菌能够在5.0-9.0的pH条件下生长，最适生长pH为7.0；该菌的盐耐受能力较弱，能在盐浓度为0％到7％的条件下生长，且在0％的盐浓度下长势最好。
3.1.5高菲、萘浓度条件下菌株XC-2的生长及降解
根据以上实验结果，确定菌株的最佳生长条件为温度30℃，pH 7.0，添加NaCl为0％。菌株XC-2在高浓度菲和萘中的生长及降解实验均在这个条件下进行。将处于对数生长期的菌株XC-2按10％的接种量分别接种于含有初始为50mg·L-1的菲和萘的无机盐培养基中，振荡培养，并做平行实验3次。
结果显示，XC-2能够分别在高浓度菲和萘条件下生长。根据GC-MS测定并分析得出菌株XC-2能够降解菲和萘，并且在含有50mg/L浓度菲或萘的无机盐培养液中培养7天后，降解率均可达到85％以上(图3)。说明菌株XC-2是一种既能降解菲和萘，且耐受这两种化合物能力很强的菌株，对PAHs适应性强。
3结论
从山东某石油污染土壤中富集分离获得1株能以菲和萘为碳源生长的菲、萘降解菌XC-2。该菌株为革兰氏染色呈阴性菌，能形成直径为0.5-2.0mm白色、圆形、表面光滑、微微向上凸起的菌落。根据分子生物学手段分析，可得出本实验所分离的细菌XC-2为Brucella intermedia菌株，并绘制了其进化树。目前针对该菌株应用的报道很少，尤其是利用其降解菲和萘的研究尚未见报道。
确定菌株的最佳生长条件为温度30℃，pH 7.0，NaCl浓度为0％。XC-2能够分别利用菲和萘作为碳源对他们进行降解，在菲或萘初始浓度在50mg·L-1的无机盐培养液中培养7天后，它们的降解率均可达到85％以上。综上，XC-2是一种能够降解菲和萘且对菲和萘具有很强耐受能力的菌株，对多环芳烃适应性强，在生物修复方面具有较好的应用潜力。
菌株序列：
SEQ ID NO.1：
GCCTGCCTCCTTGCGGTTAGCACAGCGCCTTCGGGTAAAACCAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGCACTCGAGTTGCAGAGTGCAATCCGAACTGAGATGGCTTTTGGAGATTAGCTCACACTCGCGTGCTCGCTGCCCACTGTCACCACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGCCCGTAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCTCGGCTTATCACCGGCAGTCCCCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCCGATCCAGCCGAACTGAAGGATAGTGTCTCCACTAACCGCGATCGGGATGTCAAGGGCTGGTAAGGTTCTGCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAATGTTTAATGCGTTAGCTGCGCCACCGAAGAGTAAACTCCCCAACGGCTAACATTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGCGTCAGTAATGGTCCAGTGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCGAATATCTACGAATTTCACCTCTACACTCGGAATTCCACTCACCTCTACCATACTCAAGACTAACAGTATCAAAGGCAGTTCCGGGGTTGAGCCCCGGGATTTCACCCCTGACTTATTAGCCCGCCTACGTGCGCTTTACGCCCAGTAAATCCGAACAACGCTAGCCCCCTTCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGAAGTTAGCCGGGGCTTCTTCTCCGGTTACCGTCATTATCTTCACCGGTGAAAGAGCTTTACAACCCTAGGGCCTTCATCACTCACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTGCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTATGGATCGTCGCCTTGGTAGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATCCAACGCGGGCCGATCATTTGCCGATAAATCTTTCCCCTTTCGGGCTCATACGGTATTAGCACAAGTTTCCCTGAGTTATTCCGTAGCAAATGGTACGTTCCCACGCGTTACTCACCCGTCTGCCGCTCCCCTTGCGGGGCGCTCGACTG
Claims (6)
1.Brucella intermedia XC-2，保藏编号为：GDMCC No：63809。
2.一种菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述的Brucella intermedia XC-2作为活性成分。
3.权利要求1所述的Brucella intermedia XC-2或其菌剂在多环芳烃和/或石油烃污染环境的生物修复中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的多环芳烃和/或石油烃污染环境包括多环芳烃和/或石油烃污染的土壤和水体。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的多环芳烃为PAHs。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的多环芳烃为菲和萘。
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Legal Events
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| GR01 | Patent grant | ||
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