KR100679420B1

KR100679420B1 - 다환 방향족 탄화수소 분해능을 가진 균주

Info

Publication number: KR100679420B1
Application number: KR1020060026037A
Authority: KR
Inventors: 박정훈; 김만
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2006-03-22
Filing date: 2006-03-22
Publication date: 2007-02-07

Abstract

본 발명은 분해가 어려운 다환 방향족 탄화수소(PAHs: polycyclic aromatic hydrocarbons)를 생물학적으로 분해 할 수 있는 KCCM 10740P(Pseudomonas sp. KM1) 균주에 관한 것이다. 유류로 오염된 토양 정화에 있어서 PAHs의 분해가 어려운 것으로 알려져 있으며, 특히 3환- 및 4환-방향족 탄화수소의 제거가 어려운 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는 공업단지에서 유류로 오염된 토양으로부터 Pseudomonas sp. KM1 균주를 분리 동정하였다. 본 균주는 naphthalene, acenaphthylene, acenaphthene, fluorene, phenanthrene, pyrene, fluoranthene 등과 같은 다환 방향족 탄화수소를 분해 할 수 있다. 또한 균주 KCCM 10740P는 이들 다환 방향족 탄화수소가 혼합되어 있는 경우 혼합된 오염물 전체를 동시에 분해할 수 있으며, 특히 fluoranthene의 분해속도에 비해 naphthalene, acenaphthylene, acenaphthene, fluorene, phenanthrene 과 pyrene의 분해 속도가 빠른 특징을 가진다. 본 균주는 pH 3와 8 사이에서 생장이 가능하며, 특히 pH 6과 8 사이에서 생장이 잘된다. 또한 25^oC와 35^oC 사이에서 활성이 좋은 박테리아이다. 일반적으로 유류 오염된 매개체들(물, 토양 등)은 다양한 PAH들로 혼합되어 있으며, 이들 혼합된 오염물들을 효과적으로 정화하는데 본 균주를 매우 유용하게 이용할 수 있다.

다환방향족탄화수소(PAHs), 생물정화, 토양오염, Pseudomonas sp. KM1, KCCM 10740P

Description

다환 방향족 탄화수소 분해능을 가진 균주{Degrading bacteria of polycyclic aromatic}

도 1은 본 발명에 따른 다환방향족탄화수소 분해 균주인 KCCM 10740P(Pseudomonas sp . KM1)을 보여주는 SEM사진.

도 2는 Pseudomonas sp. KM1의 pH에 따른 성장특성

도 3은 Pseudomonas sp. KM1의 온도에 따른 성장특성

도 4는 1일 후 Pseudomonas sp. KM1에 의한 7 PAHs 에 대한 분해유무를 보여주는 HPLC 분석결과: 좌측은 대조군(균주를 넣지 않은 경우), 우측은 실험군(균주를 넣은 경우)

도 5는 3일 후 Pseudomonas sp. KM1에 의한 7 PAHs 에 대한 분해유무를 보여주는 HPLC 분석결과: 좌측은 대조군(균주를 넣지 않은 경우), 우측은 실험군(균주를 넣은 경우)

도 6은 5일 후 Pseudomonas sp. KM1에 의한 7 PAHs 에 대한 분해유무를 보여주는 HPLC 분석결과: 좌측은 대조군(균주를 넣지 않은 경우), 우측은 실험군(균주를 넣은 경우)

본 발명은 다환방향족 탄화수소(PAHs: polycyclic aromatic hydrocarbons)를 분해하는 균주인 KCCM 10740P(Pseudomonas sp . KM1) 에 관한 것이다.

PAHs는 여러 개의 벤젠고리가 융합된 형태를 지닌 유기화합물로서 탄소화합물의 불완전 연소 시 발생하는 화합물이다. 석탄, 경유, 휘발유 등 화석 연료를 사용하는 내연기관의 자동차 배출가스 또는 화력발전소의 배출가스에서 많이 발생되며, 화산이나 산불 등 자연적인 요소에 의해서도 생성된다. 일반적으로 인위적인 발생량이 자연적인 것보다 훨씬 많으며, PAHs의 화합물의 종류는 매우 다양하며 오염원에 따라 발생되는 물질의 분포가 다르다. 화력 발전소에서 배출되는 PAHs는 주로 2내지 3환의 방향족화합물이며, 석유제품과 연관된 PAHs는 3환의 phenanthrene 화합물이 많으며, 열분해 산물로는 4환 내지 5환의 방향족화합물이 많은 것으로 보고되고 있다. 화력 발전소에서 불완전 연소에 의해 발생되는 PAHs의 약 97% 정도는 연소 후처리 시스템 특히 백 필터에서 제거되나 나머지는 대기로 방출되고 발전소 주변의 토양에 침적된다. 연속적인 축적 현상이 장기간 일어남으로 인해 주변에 침적되는 PAHs의 농도가 증가되고 주변 토양이 오염된다.

국내에서 분석한 자료에 의하면 광양만 유역에서 채취한 토양의 PAHs 농도는 0.01pm에서 최고 171ppm으로 분포되었으며, 주로 열분해 산물인 4환의 방향족화합물이 많은 것으로 나타났다. 40ppm 이상인 경우 매우 위험한 수준임을 감안하면 상당히 높은 농도가 검출된 것이다. 이 지역에서 PAHs의 농도가 높은 이유는 주변 화학 단지에서 배출되는 불완전 연소 및 남해바다에서 종종 있었던 기름유출사고로 인한 것으로 알려졌다. 이 지역 뿐 만 아니라 국내에 여러 지역에서 유기오염물질로 오염된 토양이 있는 것으로 종종 보고되어 왔다.

이들 오염된 토양으로부터 유기 오염물질을 제거하는 기술은 물리적, 화학적 및 생물학적인 방법으로 구분할 수 있다. 물리적인 제거 기술에는 토양 세척 방법, 열탈착, 활성탄 고정, 고화안정화, 토양 증기 추출, 토양 굴착 후 격리 등이 있으며, 화학적 제거 방법에는 토양을 소각시켜 오염물질을 완전 산화하는 방법, 토양 유리화, 용매추출, 오염물질 열분해 등 이 있고, 생물학적인 방법에는 굴착 후 현지에서 생물분해로 처리하는 on-site 방법과 굴착하지 않고 원위치에서 미생물 주입 또는 공기 주입으로 미생물을 활성화 시켜 오염물을 분해 제거하는 in-situ 방법이 있다.

이들 여러 가지 처리 방법들 중에서 생물학적 처리 방법이 친환경적이고, 경제적인 방법으로 알려져 있으며, 실제 미국에서 생물학적 처리 방법에 의한 토양의 처리 양이 증가 하는 것으로 알려져 있다. 미생물에 의한 유기물질 분해는 박테리아 내부에 존재하는 효소의 산화 또는 환원 반응에 의해 이루어지며, 일반적으로 분자량이 적은 물질이 큰 물질에 비해 분해가 빨리 이루어진다. 유기물질의 특성에 따라 미생물에 의한 분해 정도가 달라지므로, 생물학적 처리 방법을 모든 유기오염물에 적용할 수 있는 것은 아니다. 현재로서는 휘발성이고 수용성이 큰 저분자 유기오염물에 제한적으로 적용되고 있는 실정이다.

PAHs는 상대적으로 휘발성 및 용해도가 낮고, 미생물에 의한 분해가 어려운 유기오염물로 알려져 있으므로, PAHs를 효율적으로 분해할 수 있는 균주 개발 및 이에 대한 연구가 진행되고 있다.

따라서, 본 발명은 상기와 같은 종래의 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, PAHs로 오염된 토양시료를 채취하여 PAHs 분해능을 가진 균주를 분리한 후, 상기 균주를 동정한 다음 분리된 균주를 이용하여 2환-, 3환-, 4환-PAHs를 생물학적으로 분해시킬 수 있는 미생물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 2환-, 3환-, 4환-방향족 탄화수소를 효과적으로 분해하는 균주 Pseudomonas sp. KM1(KCCM 10740P)를 제공한다.

또한 본 발명은 생물학적으로 다환 방향족 탄화수소를 분해하는 방법에 있어서, 상기 균주 Pseudomonas sp. KM1(KCCM 10740P)를 이용하는 것을 특징으로 하는 다환 방향족 탄화수소의 분해 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

상기 균주는 PAHs로 오염된 토양으로부터 분리된다. 채취한 토양을 yeast 1%을 포함한 MSM배지 10㎖에 넣고, 균 성장은 탁도를 통해 확인하였다. 성장이 확인된 균주들은 다시 계대배양을 통해 원하는 균주를 분리하고자 하였다. 이를 반복한 후 , 단일 콜로니를 분리하고 스트리킹(streaking)함으로써 원하는 균주를 얻을 수 있었다. 분리된 단일균은 마지막으로 PAHs 중 하나인 나프탈렌을 탄소원으로 이용할 수 있는 최소(MSM)배지에 colony를 접종하고, 탁도와 색의 변화를 통해 PAHs 분해능을 가진 Pseudomonas sp. KM1을 분리 할 수 있었다. Pseudomonas sp. KM1은 국 제 기탁 기관인 한국미생물보존센터에 기탁번호 KCCM 10740P로 기탁하였다.

또한 본 발명은 상기 미생물 KCCM 10740P(Pseudomonas sp. KM1)이 수용액 및 토양 슬러리 용액에 존재하는 다환방향족 탄화수소를 분해함에 있어 7종의 PAHs 물질들(naphthalene, acenaphthylene, acenaphthene, fluorene, phenanthrene, pyrene, fluoranthene)을 단시간에 분해하는 성질을 갖는 균주의 분해 특성을 제공한다. 또한 균주 KCCM 10740P는 이들 다환 방향족 탄화수소가 혼합되어 있는 경우 혼합된 오염물 전체를 동시에 분해할 수 있으며, 특히 fluoranthene의 분해속도에 비해 naphthalene, acenaphthylene, acenaphthene, fluorene, phenanthrene 과 pyrene의 분해 속도가 빠른 특징을 가진다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예1 ] Pseudomonas sp. KM1균주의 분리

토양 시료를 채취한 다음 mineral salt medium(표1 참조)과 yeast 1g/ℓ를 넣은 액체배지(10㎖)에 일정량의 토양을 넣고, 습식 배양하여 미생물 성장확인을 탁도를 통해 확인한다. 탁도를 통해 균의 성장이 확인된 경우 다환 방향족 탄화수소(1%)를 포함하고 있는 최소영양배지에 다시 성장된 균 1%를 접종시킨다. 이후 성장이 확인되면 다시 신선한 최소영양배지에 배양액을 접종하고 다환방향족탄화수소의 기질이용을 탁도를 통해 확인하였다. 다음 LB고체배지(표1 참조)에 백금이를 이 용하여 도말한 후 24시간 정도 배양, 형성되는 단일 콜로니를 선택하여 분리하고자 하는 균을 순수 분리하였다. 도1은 본 발명의 균주 Pseudomonas sp. KM1(KCCM 10740P)의 SEM 사진이다.


배지	조성	함유량( per liter )
mineral salt medium	KH2PO4	3.4g
	Na2HPO4	3.55g
	(NH4)SO4	1g
	Hunter mineral base	10㎖
LB고체배지	Bacto-tryptone	10g
	Bacto-yeast extract	5g
	NaCl	5g
	Bacto-agar	15g

[ 실시예2 ] 분리된 균주의 동정

상기한 방법으로 분리된 균주는 먼저 그람염색을 통한 현미경 상에서의 형태학적 관찰과 API 20E kit를 이용한 생화학적 특성을 검사하였으며, 분리균의 형태는 전자 현미경(SEM, DSM940A, Germany)을 이용하여 관찰하였다(도1 참조). 동정 방법은 다음과 같다.

먼저 분리된 미생물을 배양하여 희석액(증류수 혹은 Suspention medium)을 이용하여 20배, 50배 희석하여 스트립에 접종하였다. 접종시 kit 큐플 중 ADH, LCD, ODS 는 혐기적 조건을 위하여 광유(mineral oil)를 채우고, CIT,VP 는 큐플까지 균액을 가득 채워 접종하였다. 다음 스트립 위에 뚜껑을 덮고, Tray 밑에는 증류수를 적당량 부어서 균액이 건조되는 걸 방지하였다. 이 후 호기적 상태에서 35℃, 24시간 건식배양 후 동정 판독표를 참조하여 결과를 얻은 결과 Pseudomonas sp. 임을 확인할 수 있었다(표2 참조).

Characteristics	isolated strain KM1
Morphology
Gram strain	-
Shape	Rod
Oxidase	+
VP test	-
Gelatin liquefaction	-
Production of indole	-
Utilization of citrate	+
Urease	-
Argnine dehydrase	-
Ornithine decarboxylase	-
Lysine decarboxylase	-
Nitrate reduction	-
Production of H2S	-
Acid form
Glucose	+
Mannitol	-
Inositol	-
Sorbitol	-
Rhamnose	-
Sucrose	-
Melibiose	-
Amygdalin	-
Arabinose	-
+ : positive reaction, - : negative reaction

[ 실시예3 ] Pseudomonas sp . KM1의 생장특성

대부분의 토양은 특성에 따라 pH가 5~9의 범위를 나타내는 것으로 보고되고 있다. 따라서 분리된 균종인 Pseudomonas sp. KM1이 활동 가능한 pH 범위를 확인하기 위하여, 인산완충용액(phosphate buffer solution,이하 PBS라 칭한다)로 pH를 3,4,5,6,7,8로 각각 조절하고 탄소원으로 1% 나프탈렌을 첨가한 배양배지를 이용하여 상기 Pseudomonas sp. KM1균종의 pH에 따른 다환방향족 탄화수소의 분해능과 증식 정도를 분석하였다. 분석 결과 Pseudomonas sp. KM1는 pH3와 8 사이에서 성장 가능하였으며, 특히 pH6과 pH8 사이에서 증식율이 우수하였다(도2 참조). 따라서 상기Pseudomonas sp . KM1 균주는 오염 토양의 pH특성에 따라 넓은 범위의 pH의 환경에서 효율적으로 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

또한, 온도에 따른 Pseudomonas sp. KM1의 증식 정도를 살펴보기 위해, 상기 균주를 25℃,30℃,35℃에서 성장시킨 결과, 실험온도 모두에서 성장가능 하였으며, 특히 30℃와 35℃에서 성장 속도가 빨랐다(도3 참조).

[ 실시예4 ] Pseudomonas sp. KM1의 분해능 측정

임의로 오염시킨 7종류의 혼합 PAHs의 분해능를 알아보는 실시 예로써, 4.2㎖ vial에 초기농도 범위가 90~2400㎍/ℓ인 PAHs(in methanol)를 넣은 후 시간에 따른 Pseudomonas sp. KM1의 분해능을 HPLC을 이용하여 분석하였다. 실험방법은 다음과 같이 실시하였다. 먼저 전 배양된 Pseudomonas sp. KM1를 포함하는 용액을 15㎖ centrifuge tube에 일정량 넣고, 3000rpm, 10분간 원심분리 한다. 원심 분리 후 상등액은 버리고 다시 멸균된 PBS 용액을 이용하여 기질로 이용되었던 다환 방향족 탄화수소를 3회 정도 세척하여 완전히 제거하였다. 세척된 균주는 OD(600nm)값이 1.0 이상이 되도록 조절하고 다환 방향족 탄화수소로 오염된 4.2㎖ vial에 0.1㎖씩 멸균된 sylinge를 이용하여 접종하였다. 이 후 25℃, 150rpm에서 1일, 3일 또는 5일간 배양하고 원심분리한 후 HPLC 분석용 1㎖ vial에 옮겨 상등액의 PAHs의 농도를 HPLC (Supelcosil LC-PAH 15cm x 4.6mm(5um), acetonitrile:water(90:10), UV/VIS 254nm, flow rate 1.2㎖/min )를 이용하여 분석하였다.

시간에 따른 균주 Pseudomonas sp. KM1에 의한 PAHs의 분해율(%)
	1일	3일	5일
Napthalene	100	100	100
Acenaphthylene	100	100	100
Acenaphthene	100	100	100
Fluorene	100	100	100
Phenanthrene	100	100	100
Flouranthene	42.9	66.1	98.2
Pyrene	100	100	100

[표3]은 임의로 오염된 다환방향족탄화수소의 시간경과에 따른 분해율을 알아본 결과로 Flouranthene를 제외한 다른 PAHs의 경우 하루만에 100%의 높은 분해율을 나타내고 있다(도4, 도5, 도6 참조). 반면 Flouranthene은 다른 오염물질의 분해율에 비해 초기 분해율은 낮지만, 시간이 지날수록 98%이상의 높은 분해율을 보여주고 있다. 즉, Pseudomonas sp. KM1은 짧은 시간동안에 혼합되어있는 다양한 PAHs 오염물질을 동시에 분해할 수 있는 것으로 나타났다.

[ 실시예5 ] 토양 유무에 따른 Pseudomonas sp. KM1의 분해능 측정

토양 유무에 따른 Pseudomonas sp. KM1의 분해능을 알아보기 위해 임의의 다환 방향족 탄화수소(napthalene, pyrene, phenanthrene)를 이용하여 분해능을 측정하였다. 실험 방법은 다음과 같이 실시하였다.

유기물 함량 등 물리화학적 특성이 다른 3가지 토양을 4.2㎖ vial에 각각 0.4g씩 넣고, 멸균된 PBS용액으로 이들 토양 샘플을 균질화 한 후, 나프탈렌(naphthalene)은 4ppm, 피렌(pyrene)과 페난트렌(phenanthrene)은 3ppm으로 각각 오염시켰다. 이 후 25℃ ,150rpm에서 48시간 진탕하여, 오염물질이 흡착평형에 이르게 한 후 Pseudomonas sp. KM1를 주입하여 오염물질의 생물학적 분해를 수행하였다. Pseudomonas sp. KM1 주입 하루 후 상등액의 농도와 토양에 흡착된 다환 방향족 탄화수소 농도를 측정하여 Pseudomonas sp. KM1 균주에 의한 다환방향족 탄화수소의 분해율을 계산하였다. 오염물질의 분석방법은 [실시예4]와 같은 조건의 HPLC분석법을 이용하였다.

균주 Pseudomonas sp. KM1에 의한 Naphthalene 분해율
	Naphthalene
토양	recovery (%)	분해율(%)
신동방	12.10%	87.90%
대조군	92.76%	7.24%

경방	0.00%	100.00%
대조군	77.22%	27.78%

균주 Pseudomonas sp. KM1에 의한 phenantherene 분해율
	Phenantherene
토양	recovery (%)	분해율(%)
신동방	66.76%	33.24%
대조군	82.71%	17.29%

경방	51.91%	48.09%
대조군	82.98%	17.02%

봉동	32.17%	67.83%
대조군	51.74%	48.26%

균주 Pseudomonas sp. KM1에 의한 pyrene 분해율
	pyrene
토양	recovery (%)	분해율(%)
신동방	82.03%	17.97%
대조군	100.00%	0.00%

경방	78.24%	21.76%
대조군	100.00%	0.00%

봉동	39.72%	60.28%
대조군	73.05%	26.95%

[표4,5,6]은 토양을 넣은 후 결과를 나타내는 것으로, 상기한 결과로부터 기질로 첨가된 나프탈렌의 경우 각각의 토양에서 하루만에 87% 이상의 높은 분해율을 보이고 있는 반면, 페난트렌과 피렌의 경우는 각 토양의 특성에 따라 분해율이 다르게 나타났다. 토양에 유기오염물의 흡착은 토양 및 유기오염물의 물리화학적 특성에 따라 크게 차이가 있으며, 또한 미생물은 강하게 흡착된 오염물을 분해하기가 상대적으로 어려운 것으로 알려져 있다. 실험결과에서 보는 봐와 같이 페난트렌과 피렌은 각각 3환- 및 4환- 방향족 탄화수소로 2환-방향족 탄화수소인 나프탈렌보다 토양에 흡착이 많이 일어나며 상대적으로 미생물에 의한 분해가 서서히 일어나는 것으로 나타났다.

위 실시 예는 하루 동안의 분해정도를 본 것으로 분해 시간이 길어 질 경우 토양에 흡착된 PAHs도 서서히 탈착 후 Pseudomonas sp. KM1에 의해 분해되리라 판단된다.

본 발명은 유류오염 토양으로부터 균주 Pseudomonas sp. KM1을 분리함으로써, 분해가 어려웠던 2환-, 3환-, 4환-방향족탄화수소를 생물학적으로 쉽게 분해 할 수 있으며, 다양한 방향족탄화수소로 혼합되어 오염되어있는 매개체(토양 또는 물 등)의 정화에 유용하게 사용할 수 있다.

Claims

단일 또는 혼합 방향족 탄화수소(PAHs: polycyclic aromatic hydrocarbons)를 분해 할 수 있는 특징을 가진 균주 Pseudomonas sp. KM1(KCCM 10740P).
생물학적으로 다환 방향족 탄화수소를 분해 처리하는 방법에 있어서, 제1항의 Pseudomonas sp. KM1(KCCM 10740P)을 이용하는 것을 특징으로 하는 다환 방향족 탄화수소의 분해 방법.