CN102911898B - 一株降解高分子多环芳烃的菌株及其在污染土壤生物修复中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于环境工程和微生物工程技术领域，尤其涉及一株降解多环芳烃的根癌农根菌(Agrobacteriumtumefaciens)tzym及其在污染土壤生物修复中的应用。本发明提供的根癌农根菌(Agrobacteriumtumefaciens)，命名为tzym，于2012年6月24日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，其保藏号CCTCC NO：M2012243。地址：中国武汉武汉大学。该菌株可以应用于治理高分子多环芳烃污染土壤。
Description
技术领域
本发明属于环境工程和微生物工程技术领域，尤其涉及一株降解多环芳烃的根癌农根菌(Agrobacterium tumefaciens) tzym及其在污染土壤生物修复中的应用。
背景技术
多环芳烃（PAHs）是一类持久性有机污染物（POPs）。固体废旧金属拆解当地的PAHs污染源主要来自于废旧机器油、电器产品的润滑油和来自废旧金属拆解中的木材、有机高分子化合物、纸张等含碳氢化合物的物质经不完全燃烧或在还原性气氛中经热分解而生成的。由于多环芳烃及其衍生物具有致癌性、致突变性和致畸性，以及急性毒性和亚致死作用，使得多环芳烃污染土壤的控制和修复迫在眉睫。
多环芳烃（PAHs）污染土壤修复是当前环境修复中研究的热点。生物降解是对PAHs污染土壤进行修复的重要途径之一。对于多环芳烃污染，国内外进行了大量多环芳烃降解微生物的筛选工作。到目前为止，已分离出多个具有多环芳烃降解能力的菌株，如假单胞菌属、分枝杆菌属、芽孢杆菌属等，并没有根瘤菌科用于多环芳烃修复的报道。
低分子量（2个或3个苯环）PAHs，如萘、菲、蒽，容易作为微生物生长所需的碳源而快速降解，而高分子量PAHs包含4个或以上的苯环，因其低水溶性和高稳定性，不易被微生物降解，成为消除PAHs污染的难点。
发明内容
本发明针对现有技术中高分子多环芳烃降解菌降解能力不足之处，提供一种降解高分子多环芳烃菌株，该菌株可以应用于治理高分子多环芳烃污染土壤。
为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案得以实现的：本发明提供的根癌农根菌(Agrobacterium tumefaciens)，命名为tzym，于2012年6月24日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，其保藏号CCTCC NO：M 2012243。地址：中国武汉武汉大学。
所述菌株具有以多环芳烃为唯一碳源和能源进行生长的能力。
所述降解多环芳烃的菌株在被多环芳烃污染的土壤的生物修复中的应用。
所述多环芳烃选自芘、苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[a]芘、二苯并[a，b]蒽中的一种或多种的混合物。
所述菌株的16SrDNA序列如SEQ NO.1所示。
利用所述降解多环芳烃的菌株进行土壤生物修复的方法，其特征在于该方法由以下步骤组成：选取多环芳烃污染土壤100g，将根癌农根菌(Agrobacterium tumefaciens)tyzm按质量百分比3.5%用量与土壤混合均匀，加水使土壤含水率保持在15%，放入恒温振荡器中，控制培养温度在20℃的恒温条件下，振荡培养修复120小时。
tzym是从浙江省台州市固体废弃物拆解场某污染土壤中分离并筛选得到。菌株可在15～35℃，pH值6.0～8.5培养条件下较好生长；在LB固体平板上生长菌落形态为圆形,乳白色,微隆起,边缘整齐,湿润;细胞杆状,革兰氏染色阴性;无芽孢;有荚膜,有鞭毛。
作为优选，本发明所述菌株能以高分子多环芳烃为唯一碳源和能源生长。
上述高分子多环芳烃降解菌的筛选方法，可按如下步骤依次实施：
（1）从固废拆解场采集距地表下5～20cm处表层土壤样品，作为菌源进行自然富集培养；所述富集培养基含有：葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、 MgSO4；
（2）取（1）中所述富集培养液接种于无机盐选择培养基中进行选择培养，所无机盐选择培养基含有：柠檬酸钠、（NH4）2SO4、MgSO4、K2HPO4、KH2PO4；添加多环芳烃（高分子多环芳烃芘、苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[a]芘、二苯并[a，b]蒽的浓度均为150mg/L～250mg/L）；
（3）取（2）中所述选择培养物稀释涂布于固体无机盐选择培养基上，进行分离进行分离即得到多环芳烃降解菌tzym。
上述高分子多环芳烃降解菌tzym可用于高分子多环芳烃土壤污染的生物修复。
本发明tzym可在15～35℃，pH值6.0～8.5培养条件下较好生长；菌株形态特征为菌株形态特征为杆状,革兰氏染色阴性;无芽孢;有荚膜,有鞭毛；在LB固体平板上生长菌落形态为圆形,乳白色,微隆起,边缘整齐,湿润。
tzym在LB（胰蛋白胨1.0%，酵母提取物0.5g%，氯化钠1.0%）固体培养基培养24小时菌落特征为圆形，菌落直径2～3mm，白色，表面光滑，边缘整齐。
tzym的生理生化特征，见表1。
表1Tzym的生理生化特征
| 鉴定项目 | 鉴定结果 |
| 吲哚产生 | - |
| M．R实验 | + |
| V．P实验 | - |
| 明胶水解 | + |
| 尿酶实验 | - |
| 酪素水解 | + |
| 苯丙氨酸脱羧酶 | - |
| 精氨酸双水解酶 | - |
| 卵磷脂酶 | - |
| （NH4）2SO4 | + |
| KNO3 | + |
| NH4Cl | + |
| 丙二酸盐利用 | - |
| 柠檬酸盐利用 | + |
| 淀粉水解 | + |
| 纤维素水解 | - |
| 葡萄糖产酸产气 | - |
| 乳糖产酸产气 | - |
| 过氧化氢酶 | + |
| 葡萄糖利用 | + |
| 麦芽糖利用 | - |
| 阿拉伯糖利用 | + |
| 木糖利用 | - |
| 甘露醇利用 | + |
| 甘油利用 | + |
| 蔗糖利用 | - |
tzym的16SrDNA基因的PCR扩增、测序由北京三博远志公司完成，得到了长度为1385bp的16SrDNA全序列。选择同源性大于97%的基因序列进行系统发育分析，表明菌株与Agrobacterium tumefaciens（BLN4）同源性最高，结合菌株形态、菌落特征及生理生化特性，鉴定菌株属于根癌农根菌（Agrobacterium tumefaciens）。
本发明的tzym既可以在营养培养基，如：普通牛肉膏蛋白胨、普通LB、营养琼脂中生长，又可在以多环芳烃为唯一碳源、能源的无机盐基础培养基中生长。
综上所述，本发明具有以下优点：本发明提供的tzym对污染土壤中的高分子多环芳烃有快速降解能力，且降解底物范围广，降解率高。
分类命名：根癌农根菌 tzym
拉丁文名：Agrobacterium tumefaciens tzym
保藏单位：中国典型培养物保藏中心
地址：中国武汉武汉大学
保藏日期：2012年6月24日
保藏编号：CCTCC NO：M 2012243。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明，但是本发明并不限于这些实施例。
实施例1
本发明提供的tzym的分离筛选方法。
从固废拆解场采集距地表下5～20cm处表层土壤样品，作为菌源进行自然富集培养，将葡萄糖2g，胰蛋白胨4g，牛肉膏4g，MgSO4 0.8g加入到400mL的蒸馏水中，配制好的培养液在121℃的温度条件下灭菌处理20min，在此培养基上培养三天，再配制无机盐基础培养基，加入芘、苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[a]芘、二苯并[a，b]蒽的多环芳烃化合物，配制成溶液后再加入蒸馏水定容至500mL，上述加入芘、苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[a]芘、二苯并[a，b]蒽的量要使配制好的培养液中芘、苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[a]芘、二苯并[a，b]蒽的最终浓度均为200mg/mL，然后将配制好的培养液在121℃的温度条件下灭菌处理20min，即得所需的培养液。在此培养基上培养三天，稀释涂布分离出一株菌命名为tzym，该菌于2012年6月24日保藏于“中国典型培养物保藏中心”其保藏号CCTCC NO： M 2012243。
tzym的16SrDNA基因的PCR扩增、测序由北京三博远志公司完成。根据测序结果构建系统发育树。系统发育表明菌株与Agrobacterium tumefaciens的进化距离最近，结合形态、菌落特征及生理生化特性，鉴定菌株属于根癌农根菌(Agrobacterium tumefaciens)。
实施例2
根癌农根菌降解高分子多环芳烃。
选取芘、苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[a]芘浓度各为200mg/Kg多环芳烃污染的污染土壤100g，接种tzym，加入量为土壤干重的3.5%，加少量水使土壤含水率保持在15%左右，放入振荡器中，控制培养温度在20℃的恒温条件下，振荡培养修复120小时，提取纯化处理后进行液相色谱分析，芘、苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[a]芘的降解率均为90%以上。
本发明中所描述的具体实施例仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 台州职业技术学院
<120> 一株降解高分子多环芳烃的菌株及其在污染土壤生物修复中的应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1385
<212> DNA
<213> Agrobacterium tumefaciens
<400> 1
cttggcgcag gcttaccatg cagtcgacgc cccgcaaggg gagtggcaga cgggtgagta 60
acgcgtggga acataccctt tcctgcggaa tagctccggg aaactggaat taataccgca 120
tacgccctac gggggaaaga tttatcgggg aaggattggc ccgcgttgga ttagctagtt 180
ggtggggtaa aggcctacca aggcgacgat ccatagctgg tctgagagga tgatcagcca 240
cattgggact gagacacggc ccaaactcct acgggaggca gcagtgggga atattggaca 300
atgggcgcaa gcctgatcca gccatgccgc gtgagtgatg aaggccttag ggttgtaaag 360
ctctttcacc ggagaagata atgacggtat ccggagaaga agccccggct aacttcgtgc 420
cagcagccgc ggtaatacga agggggctag cgttgttcgg aattactggg cgtaaagcgc 480
acgtaggcgg atatttaagt caggggtgaa atcccagagc tcaactctgg aactgccttt 540
gatactgggt atcttgagta tggaagaggt aagtggaatt ccgagtgtag aggtgaaatt 600
cgtagatatt cggaggaaca ccagtggcga aggcggctta ctggtccatt actgacgctg 660
aggtgcgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg 720
atgaatgtta gccgtcgggc agtatactgt tcggtggcgc agctaacgca ttaaacattc 780
cgcctgggga gtacggtcgc aagattaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag 840
cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgcagaac cttaccagct cttgacattc 900
ggggtatggg cattggagac gatgtccttc agttaggctg gccccagaac aggtgctgca 960
tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1020
cgcccttagt tgccagcatt tagttgggca ctctaagggg actgccggtg ataagccgag 1080
aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcctcat ggcccttacg ggctgggcta cacacgtgct 1140
acaatggtgg tgacagtggg cagcgagaca gcgatgtcga gctaatctcc aaaagccatc 1200
tcagttcgga ttgcactctg caactcgagt gcatgaagtt ggaatcgcta gtaatcgcag 1260
atcagcatgc tgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg 1320
gagttggttt tacccgaagg tagtgcgcta accgcaagga ggcagctaat cacgttagac 1380
aaggt 1385
Claims (3)
1.一株降解高分子多环芳烃的菌株，其特征在于，该菌株为根癌农根菌(Agrobacterium tumefaciens) tzym，在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO：M 2012243，具备降解高分子多环芳烃的能力，具有以多环芳烃为唯一碳源和能源进行生长的能力，所述多环芳烃选自芘、苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[a]芘的一种或多种的混合物，菌株的16SrDNA序列如SEQ NO.1所示。
2.根据权利要求1所述降解高分子多环芳烃的菌株在多环芳烃污染的土壤的生物修复中的应用，其中，多环芳烃选自芘、苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[a]芘的一种或多种的混合物。
3.利用权利要求1所述降解高分子多环芳烃的菌株进行土壤生物修复的方法，其特征在于该方法由以下步骤组成：选取多环芳烃污染土壤100g，将根癌农根菌(Agrobacterium tumefaciens) tzym按质量百分比3.5%用量与土壤混合均匀，加水使土壤含水率保持在15%，放入恒温振荡器中，控制培养温度在20℃的恒温条件下，振荡培养修复120小时，所述多环芳烃选自芘、苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[a]芘的一种或多种的混合物。
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