CN101184836A - 用于顽抗有机物和重金属整治的表面活性生物催化剂 - Google Patents

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Abstract

已经鉴定了分离并纯化的细菌的新菌株，其具有降解包括多种PAHs的石油烃的能力。数个隔离群也显示产生生物表面活性剂的能力。生产生物表面活性剂的能力连同降解PAHs的能力的组合可以增强降解PAHs的效率。另外，所述生物表面活性剂也提供结合重金属离子而从土壤或水环境除去的附加能力。

Description

用于顽抗有机物和重金属整治的表面活性生物催化剂
在联邦赞助的研究与开发之下关于发明权利进行的声明
在美国能源部资助的合同号DE-AC09-96SR18500之下用政府支持进行本发明。政府具有本发明中的某些权利。
发明领域
本发明涉及用于生物修复细菌菌株以及利用所述细菌菌株的方法。特别是，它涉及可以降解聚芳烃(PAHs)的独特细菌隔离群以及使用这些新细菌菌株用于生物整治的方法。通过指示有机物和无机物整治的双重用途的菌株的一种，也已经证明通过减少生物利用率的铅整治。
发明背景
在说明书中参考多种科学论文和专利。将这些公布通过参考结合于此以描述与本发明有关系的现有技术状态，并提供可以在实施本发明实施方案中有用的标准工艺和装置的详细资料。
聚芳烃(PAHs)是普遍的常见污染物，特别是与有关炼油厂、某些精炼石油产品、石油储存场所、和石油溢出地点中发现。高水平的PAHs与人中的诱变和致癌作用有关，并且对迁移以及土壤和地表水源的污染形成高风险。结果，已经在降解PAHs及相关石油产品以整治环境的技术和方法中存在相当大的兴趣。生物试剂处理PAHs的用途在本领域内是众所周知的。授予Daane的美国专利号6,503,746描述了用于PAH整治努力中的芽孢杆菌(Bacillaceae)科的细菌菌株。
授予Linn的美国专利号3,616,204公开了用已知降解不需要的污染物的微生物培养物接种污染的土壤。在Linn中描述的程序另外涉及引入营养添加物以增加土壤整治效率。
授予Pickard的美国专利号5,100,455公开了利用本地微生物区系和动物区系与腐殖底物组合以生物处理土壤污染物，包括石油有关的烃。授予Norris的美国专利号4,849,360公开了处理石油污染土壤的生物反应器，其中将空气强制通过污染的土壤以促进生物整治。所述生物反应器使用补充有磷和氮养分的本地微生物区系。
虽然多种PAH-降解细菌是已知的并且已经用在多种整治的应用中，但是关于鉴定新的和有用的种类，仍然需要本领域中的改进，所述种类具有对于石油污染物的迅速降解有效的新性质。此外，仍然需要涉及金属整治领域的改进，诸如通过减少存在于污染土壤、含有金属的废液和工业过程材料内的金属的生物利用率。
发明概述
本发明涉及降解包括聚芳烃(PAHs)的石油污染物的方法。另外，本发明涉及增强重金属从土壤去除的生物处理过程。本发明使用来自炼油厂区域的细菌隔离群的分离并纯化的细菌菌株。某些隔离群具有产生有用生物表面活性剂的进一步能力。
本发明的至少一种现有实施方案的一个方面是提供在原位和非原位整治条件下产生生物表面活性剂的分离的细菌菌株。分离并纯化的细菌菌株产生生物表面活性剂的固有能力有助于细菌的整治性质。生物表面活性剂提供增加的PAHs溶解度并使所述细菌接近PAHs，因此通过细菌菌株增加生物整治的效率。生物表面活性剂还可以减少土壤Pb生物利用率，并且认为其具有在其它也响应表面活性剂处理的金属污染物的生物整治中的效用。
本发明的至少一种实施方案的另一个方面涉及分离并纯化的细菌菌株，其中产生表面活性剂的性质有助于石油和源自石油的产物的增溶作用。生物表面活性剂增加石油产品的增溶作用，其促进石油产品的水冲洗或除去，所述石油产品与生物表面活性剂聚集体诸如微团和相关的结构缔合。此外，生物表面活性剂也增加石油产品的生物利用率，其增强降解污染物的微生物能力。增强的生物利用率有益于分离和纯化菌株以及存在于污染底物中的其它有益微生物。
本发明至少一种实施方案的又一个方面是规定分离并纯化的细菌的菌株，所述菌株降解2-至3-环低分子量的PAHs，诸如萘、菲和荧蒽以及PAH降解中间体。
本发明至少一种实施方案的还另一个方面是提供分离的、纯化的细菌菌株，其降解4-环和更高分子量的PAHs，包括嵌二萘和荧蒽。一般地，与低分子量PAHs相比，4-环和高级PAHs在环境中是更加稳定的并且是耐降解的。因此，提供降解4-环和高级高分子量PAHs的细菌菌株的能力是显著的。
PAH降解中间体还可以作为金属螯合剂起作用。该螯合活性或金属络合作用可以辅助含有PAHs和金属的废物中的整治。另外，至少一些在这里鉴定的菌株除能够降解菲之外还具有降解数个不同类型PAHs(包括2-，3-，和4-环PAHs)的能力。
本发明的至少一种实施方案的又一个方面是提供分离和纯化的细菌菌株，所述菌株具有在除去来自污染土壤和底物的金属中有用的表面活化性能。分离并纯化的细菌菌株产生生物表面活性剂单体。生物表面活性剂单体以足够数量产生，以致所述单体聚集成包括微团的三维结构。生物表面活性剂微团限定与土壤中金属离子结合的极性头基团。可以通过水悬浮液或冲洗除去含有金属离子的微团，因此降低底物的金属离子含量。然后更容易将得到的包含在生物表面活性剂微团之内的除去的金属分离并浓缩用于有效的处理或储存。
本发明的至少一种现有实施方案的又一个方面是提供分离并纯化的细菌培养物，其在构成条件下产生生物表面活性剂，所述分离的菌株还能在生物整治条件期间降解PAHs。
本发明的至少一种现有实施方案的又一个方面是提供分离并纯化的细菌菌株，所述菌株具有在生物整治条件下降解广泛范围的不同类型PAHs的能力。
本发明的至少一种现有实施方案的又一个方面提供分离并纯化的细菌菌株，所述菌株具有引起总石油烃(TPH)全面减少的能力。另外，某些隔离群在生物整治条件期间产生生物表面活性剂的能力对于其它可以存在于污染土壤或其它废产物中的微生物增加了石油烃的生物利用率。
本发明的至少一种现有实施方案的又一个方面是提供分离并纯化的细菌菌株，所述菌株具有降解PAHs的能力以及在生物整治条件期间产生生物表面活性剂的能力。
本发明的至少一种现有实施方案的又一个方面是允许分离并纯化的细菌菌株(strands)具有引起可以存在于土壤或含铅废液之内的铅的可利用率的全面减少。由一个或多个隔离群产生的生物表面活性剂可以与无机磷酸盐组合使用以减少污染底物诸如土壤内的铅的生物利用率。
本发明的至少一种实施方案的其它方面包括生物整治来自污染环境的石油污染物的方法，所述方法包含下列步骤：提供被石油污染物污染的底物供应；将至少一种细菌隔离群引入到所述污染底物供应中，所述细菌隔离群代谢石油污染物的组分并另外产生生物表面活性剂；和，在处理时间内提供足够的养分，足以使利用石油污染物的隔离群降解石油污染至100ppm TPH或更少的目标浓度。
本发明的这些及其它方面是由用于石油产品和PAHs生物整治的生物学纯的菌株提供的，所述菌株包含选自表2中所鉴定隔离群的隔离群。
参考下列说明书和后附的权利要求，本发明的这些及其它特征、方面和优势将变得更好理解。
附图简述
图1陈述了曲线图，显示对于高度污染的土壤(900mg Pb/Kg土壤)，关于多种添加剂和生物学隔离群的铅的生物利用率。
图2是陈述在处理规程之后土样内的总有机物质改变的曲线图。
优选实施方案说明
本发明对于本领域普通技术人员的充分和允许的公开，包括其最佳方式，更具体地陈述在说明书的其余部分。现在将对于本发明实施方案详细进行参考，其中一个或多个实施例陈述如下。提供每个实施例作为本发明的说明，而不是本发明的限制。事实上，对本领域技术人员显而易见的是，在不背离本发明范围或实质的情况下，可以在本发明中进行多种修改和变化。例如，作为一个实施方案一部分的特征可以用在另一个实施方案上以产生更进一步的实施方案。由此，意欲本发明包括归入后附权利要求和它们的等价物范围之内的这样的修改和变化。将本发明的其它目的、特征和方面公开在下面详细说明中。本领域普通技术人员应当理解，本讨论仅是例举性实施方案的说明，而不意欲作为限制本发明更广泛方面，其更广泛方面在例举性设计中实施。
本发明涉及从波兰的百年Czechowice炼油厂获得的细菌隔离群。来自炼油厂的陈旧淤泥特征在于它的酸性(pH2)性质并且含有高浓度PAHs以及重金属。另外，所述淤泥特征在于废催化剂、沥青、硅藻土、硅胶和煤飞灰的存在，全部含有从前已经沉积在所述位置的高本底水平的重金属(Pb/Cd/Zn)。收集位置是来自具有接近120,000吨废料的区域，所述废料沉积在3米深覆盖3.8公顷区域的无衬里的污水池中。在暴露于萘蒸气的酸性基本培养基(pH4)上，总共从所述淤泥分离出45种细菌、68种真菌和7种酵母种类。
隔离群的子集由常规分类标准BIOLOGTM和SSU rRNA基因的分析而表征。所述细菌组包括变形细菌(Proteo bacteria)、罗尔斯通氏菌(Ralstonia)、假单胞菌(Pseudomonas)和产碱菌属(Alcaligenes)种类。所述隔离群的另外表征可以参见表1和2中提供的信息。关于公布Use ofBIOLOGTM Technology for Hazardous Chemical Screening，MicrobiologicalTechniques 18：329-347，1993，描述了利用基本营养因素以及所关心的多种有机底物的BIOLOGTM表征规程，并且通过参考结合于此。
利用萘蒸气酸性无机盐基础生长培养基，总共分离出45种细菌、68种真菌和7种酵母种类。虽然不单独陈述，但是应当指出，许多隔离群具有代谢儿茶酚的能力，并且所述细菌隔离群特征在于降解PAHs的能力。另外，应当指出，分离并纯化的具有降解PAHs能力的生物也具有降解与总石油烃测量有关的多种石油污染物的能力。
如在下面的表1中所陈述，当在含有萘、菲或荧蒽的基本培养基中生长时，观察到指定为CZORL1B、BP20和CZORUBsm并且相应于表2中隔离群1至3的三种细菌种类产生表面活性剂。观察到表1中鉴定的另外九种菌株降解PAHs的范围，显示所述隔离群具有降解污染物的催化的或酶催化的能力，即使没有证明所述另外隔离群具有产生表面活性剂的能力。以上鉴定的菌株在百分之一蛋白胨、胰蛋白酶、酵母抽提物、葡萄糖(PTYG)板上生长和维持。所述细菌在30℃有氧的生长并在4℃在基本培养基上维持或长期储存在保持在-70℃的冷冻培养基中或液氮(-196℃)中。利用如公布C.R.Woese(1987)的Bacterial Evolution，Microbial Reviews51：221-271中所陈述的并通过参考结合于此的rDNA或脂肪酸甲酯(FAME)鉴定规程进行所述细菌的鉴定。在2003年10月9日，由美国典型培养无保藏中心(ATCC)，Rockville，Maryland保藏如表2中鉴定的隔离群1至12的保藏物，并且具有指明的ATCC保藏号。提交到ATCC的伴随每一隔离群的保藏形式通过参考结合于此。
下列特征的检定：a
隔离群靛蓝后分裂(meta fission)NAP PHE ANT FLE ACE FLA PYR
萘蒸气上的分离b
BAA-1(PB19)靛蓝
BAA(PB16)  靛蓝
BP19A(PB17)靛蓝
BAB(PB14)  靛蓝
CZORL1B(KN-1)C     后分裂
BP20 CZORL1B(KN-2)C后分裂
CZORLI Bsm(KN-3)C  后分裂
PB15       靛蓝    NAP(指定为BP20)
用菲过喷的分离d
BPA        靛蓝          PHE ANT FLE
BPB        靛蓝          PHE ANT FLE
BPC        靛蓝          PHE ANT FLE
BPD        靛蓝          PHE ANT FLE
BPE        靛蓝          PHE ANT FLE
BPF        靛蓝后分裂    NAP PHE ANT FLE ACE FLA PYR
BPG        靛蓝后分裂
BPH    靛蓝后分裂        PHE ANT FLE    FLA PYR
BPI    靛蓝              PHE ANT FLE
BPJ    靛蓝                  ANT FLE
BPK                      PHE ANT FLE
BPL    靛蓝              PHE     FLE
BPM    靛蓝              PHE ANT FLE        PYR
BPN    靛蓝              PHE ANT FLE    FLA
BPO    靛蓝              PHE ANT FLE
BPP    靛蓝              PHE
BPQ    靛蓝              PHE ANT FLE
BPR    靛蓝后分裂        PHE
a缩写；靛蓝，从吲哚产生靛蓝；后分裂，2，3儿茶酚加双氧酶活性；NAP，萘；PHE，菲；ANT，蒽；FLE，芴；ACE，苊；FLA，荧蒽；PYR，芘.
b暴露于萘的琼脂板上分离的细菌.
c产生生物表面活性剂的细菌
d暴露于菲晶体的琼脂板上分离的细菌.
表1
隔离群的二羟基化的加双氧酶和2，3儿茶酚双加氧酶活性和PAH降解范围。
隔离群                  鉴定                                   ATCC序列号
1)CZOR-L1B(KN-1)        ALCALIGENES-PIECHAUDIISRS.             PTA-5580
2)BP-20(KN-2)           RALSTONIA PICKETTII SRS.               PTA-5579
3)CZOR-L1Bsm(KH-3)      PSEUDOMONAS-PUTIDA BIOTYPE B SRS       PTA-5581
4)BPB                   FLEXIBACTER CF.SANCTI SRS              PTA-5570
5)BPC                   PSEUDOMONAS FREDRIKSBERGENSIS SRS      PTA-5571
6)BPE                   STAPHYLOCOCCUS WARNERI.LMG 19417SRS    PTA-5572
7)BPF                   SPHINGOMONAS SRS                       PTA-5573
8)BPH                   SPHINGOMONAS SP.S37 SRS                PTA-5574
9)BPI                   PHYLOBACTERIUM SRS                     PTA-5575
                    (αPROTEOBACTERIUM TA-A1)
10)BPJ          SERRATIA FICARIA SRS                   PTA-5576
                    (αPROTEOBACTERIUM TA 12-21)
11)BPK          AGROBACTERIUMTUMEFACIENS SRS           PTA-5577
12)BPL          RHIZOBIUM SP.SDW045 SRS                PTA-5578
表2.
隔离群鉴定
以上鉴定的细菌隔离群已经确定为清楚的种类。每一鉴定的隔离群具有PAH降解性质并且也已经证明减少土壤中TPH的能力。另外，某些隔离群具有产生生物表面活性剂的能力。基于rDNA表征和表1和2中关于生理生长特点的变化，相信每个隔离群是新的。
上面鉴定的隔离群1-3，ATCC PTA-5580(皮氏产碱菌SRS(Alcaligenespiechaudii SRS))；ATCC PTA-5579，(皮氏拉斯通氏菌SRS(Ralstonia pickettiiSRS))；和ATCC PTA-5581(恶臭假单胞菌生物型B SRS(Psuedomonasputida Biotype B SRS)，全部证明产生生物表面活性剂的能力，在培养条件期间注意到所述生物表面活性剂的形成。对于每个隔离群评价生物表面活性剂渗出物并确定具有符合表面活性剂的表面张力改变性质。隔离群4-12全部表明生物降解多种PAHs的能力(表1)。如下面的实施例1中陈述，在生物反应器整治研究中利用表2中鉴定的12种隔离群的聚生体整治土壤中含有的石油烃，导致在所述生物整治条件下产生可见的大量生物表面活性剂。
认为某些隔离群产生生物反应物的能力通过数种不同机理增强整治。生物表面活性剂的生产增加PAHs及其它疏水性石油化合物的生物有效性。增加的生物有效性包括产生表面活性剂以增溶的能力并且使所述隔离群适用于PAHs及其它石油化合物。因而，所述隔离群产生表面活性剂的能力增加隔离群降解并代谢PAHs的效率。
如实施例1所表明，使用的隔离群聚生体导致在所述土壤内产生可见的大量表面活性剂。通常已知生物表面活性剂具有由极性头和非极性尾组成的化学。在水溶液中，生物表面活性剂用来减少液体表面张力并促进不同极性液体之间乳液的形成。该能力促进生物表面活性剂的有效性，因为生物表面活性剂的疏水的、非极性尾部区域和生物表面活性剂微团可以截留油剂及其它石油化合物。截留的油剂和石油化合物对于生物降解用的细菌具有更大的生物利用率。另外，可以定期从所述体系除去或冲洗含有截留油剂和石油化合物的微团，因此提供从土壤底物进一步隔离并分离石油化合物的能力。
另外，由所述生物表面活性剂形成的微团促进从土壤除去金属。微团的亲水极性头基团将结合存在于土壤内的金属和金属离子。一旦结合，所述微团的可溶属性容许收集微团和结合的金属。一旦收集，可以进一步处理微团和包含的金属的现有浓缩体积而从生物表面活性剂分离所述金属。另外，已经发现，选择的产生生物表面活性剂的隔离群可用于减少存在于土壤内的某些金属诸如铅的生物利用率。对于某些整治，不将表面活性剂用于除去污染物，而是提供污染地点长期稳定的方法。稳定包括减少铅的生物利用率以及防止铅在地表径流中迁移至相邻的未污染地点和地下水。
实施例1
建造了移动的生物反应器并供应有四吨量的被低水平铯-137和26,000ppm石油烃污染的土壤。污染土壤是从Savannah River Site(Aiken，SC)获得的风化物。所述石油产品的来源和构成是未知的，但是认为其是用过的机油和柴油燃料的混合物。
用7％陈化肥料的填充剂补偿所述土壤。对于每个隔离群，添加三升对数生长期的培养物并且分配在四吨混合的废土壤之内。所述生物反应器安装有具有底部进料换气管的上升的、次级的、多孔板，其提供环境空气对于生物反应器的连续供应。另外，将氮、钾、和磷肥(10-10-10)的周期养分补充用于增强生物反应器内的生物活性。附装流入和流出水的偶联。将空气压缩机、真空泵、和液泵用于控制并调节通过生物反应器的空气和液体流量并控制生物反应器中的水分含量。
低水平铯-137的存在限制用于监控生物反应器的取样技术的数量和类型并且需要使用与空气流出耦合的高效微粒空气过滤器。周期的CO2测量显示，在五个月的时间间隔中，降解了121磅的石油产品。基于CO2测量，保守估计在五个月评价时间间隔期间，所述生物整治方法从土壤除去16,000mg/kg的石油污染物。表明，在20个月的处理后，4吨量的污染土壤使TPH减少至45ppm。按照处理规程的效率和多功能性，所述隔离群降解石油及其它烃类产品而产生生物表面活性剂的能力提供巨大的优势。例如，相信对于仅由石油和石油副产物污染的土壤，本隔离群可以独立地或者作为聚生体和常规生物整治技术一起使用以改善降解的效率。如上所述，生物表面活性剂的作用对于每个单独细菌产生更大的石油溶解度区域。结果，产生更大的石油产品可用性。另外，到所述隔离群在部分土壤内形成聚集体菌落、生物膜或生物片的程度，认为所述表面活性剂实质上增加细菌聚集体的石油底物的生物利用率。同时，所述表面活性剂也增加可能存在的重金属的增溶作用并且提供通过除去产生的表面活性剂而减少重金属浓度的能力。
如实施例1所示，隔离群聚生体提供生物整治方法，其可以实现来自污染土壤的石油的显著减少。关于配制其中石油污染土壤和低水平放射性物质一起存在的混合废物的处理策略，该性质是特别有用的。当前，被低水平放射性废物污染的并具有另外的石油污染物的土壤对于BTEX(苯、甲苯、乙苯、二甲苯)必须在1ppm的调整限以下，并且对于TPH(总石油烃)在100ppm以下，之后所述土壤可以分类并处理作为低水平放射性废物。符合低水平放射性废物定义的土壤的处理成本是接近262美元/立方米/年。相反，必须将含有超过调整限的低水平放射性物质石油污染的土壤储存作为混合废产物。单独基于每年的成本，混合废土壤的储存成本是接近10,165美元/立方米土壤/年。处理混合废土壤并因此除去基本水平石油污染物的能力是至关重要的。从混合废土壤除去足够石油污染物容许所述废物作为低水平放射性废物处理掉。得到的成本比混合废物的储存成本低38倍。
本接种物的使用是更有利的，因为，不像一些现有技术，土壤改良剂的量保持最小。将土壤改良剂的量保持到最小减少最后的处理成本，特别的对于含有低水平幅射的土壤。
也相信本隔离群对原位整治工程是有用的。可以利用许多常规方法将隔离群聚生体提供给污染的土壤。如果需要，或者以物理或化学形式的连同氧气供应一起的营养补剂促进生物整治活性。一般地给定所述隔离群降解PAHs的能力以及降解石油烃所需的能力，则利用所述隔离群的原位整治是有利的。另外，某些隔离群在土壤生长条件期间产生表面活性剂(生物表面活性剂)使某些隔离群的利用更有利。如所提到，生物表面活性剂增强物理截留石油产品和重金属的能力，以及对于细菌隔离群以及存在于土壤环境内的天然微生物提供增加的石油烃增溶作用和接触。
生物表面活性剂的使用可以引起多种污染底物条件中的有用结果。例如，本领域已知生物表面活性剂具有有用的金属配合性质，其可以减少金属毒性，而允许增强在被有机和金属污染物污染的地点中的其它废物的生物降解。一种这样的出版物，题为“A Rhamnolipid Biosurfactant Reduces Cadmium Toxicity during Naphthalene Biodegradation”，由Sandrin等，Applied and Environmental Microbiology，Oct.2000，pp 45854588，并且将其通过参考结合于此，描述了生物表面活性剂减少具有有机和金属污染物的共污染体系中的金属毒性的能力。
一个另外的出版物，″Microbial Surfactants and their use in Field Studiesof Soil Remediation″，由N.Christofi and I.B.Ivshina，发表在Journal ofApplied Microbiology，2000，93，pp.915-929中，并且通过参考将其结合于此，提供了土壤整治应用中表面活性剂作用的有用综述。在适当的条件之下，关于有机增溶作用、有机降解、金属增溶作用、和金属离析，生物表面活性剂可以提供有用的益处。
在这里公开的某些隔离群已经表明减少污染土壤内铅的生物利用率的能力。土壤中的铅污染物可以作为许多活动包括采矿、基于铅的油漆的存在、来自射击范围的军火、来自气油和石油添加剂的污染、铅蓄电池再循环中心、和基于铅的炸药的残留的结果而发生。铅的暴露与人神经和生殖系统的许多病症有关。铅通常通过吸入或含铅粉末的摄取而进入身体。
已知含铅的土壤可以使用土壤改良剂治疗以减少铅的生物利用率。一些这样的改良剂包括磷灰石、HR、及其它含有磷酸钙的材料。已知磷灰石与土壤内的铅及其它金属结合并因此减少铅移动的趋势。结合相互作用也减少铅的生物利用率。选择的表面活性剂也可以用于减少铅的生物利用率，如通过隔离群3所表明。
进行隔离群1皮氏产碱菌(Alcaligenes piechaudii)和隔离群3恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的评价，以便了解是否可以通过将产生生物表面活性剂的隔离群连同其它的土壤改良剂在含有铅的土壤中结合而获得铅的生物利用率的有利减少。从小型武器射击范围获得铅污染土壤，在那里铅弹已经在土壤中积累了许多年。将50gm污染土壤样品与3种不同的磷酸钙改良剂混合。磷酸钙改良剂包括来自北卡罗来纳(美国)的天然产生的磷酸钙岩石，以下指定为NCA，来自佛罗里达(美国)的天然产生的磷酸钙岩石，以下指定为FA，和从底栖鱼骨获得的生物磷灰石，以下指定为BA。将10重量％和5重量％的NCA、SA、和BA加入到铅污染土壤的各自样品。另外，将某些改良的土样通过引入5ml隔离群1号样品皮氏产碱菌(Alcaligenes piechaudii)在1％PTYG营养肉汤中进一步处理。所述隔离群的密度是3.11E+08细胞/ml。附加样品也利用类似的5ml添加的样品用3号隔离群恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)处理并且用于微生物改良的含有3.43E+08细胞/ml的密度的样品包括1％PTYG的无菌培养基。将污染土壤样品和多种改良剂和培养物在密封容器中混合在一起，将其通过管子连接到Micro-Oxymax Respirometer(Columbus Instruments，Columbus，OH)用于测定包括氧消耗和CO2演变的代谢速度。通过常规平板培养技术获得微生物密度用于确定菌落和样品密度。
如图1中陈述的结果所示，如通过利用美国环保署方法6010中所确定规程的毒性特征淋洗程序(TCLP)测量，隔离群3的添加实现铅生物利用率的显著减少。当与5％NCA或BA的土壤改良剂使用时，微生物改良造成铅的生物利用率明显减少。给出了BA产物的低成本和生物磷灰石的一致性，相信与隔离群3结合使用生物磷灰石，或其组合，在土壤内提供优异的铅生物利用率的减少。
生物磷灰石与天然产生的来自隔离群3细菌生物表面活性剂的组合对于污染土壤样品产生其它注意到的改善。注意到，如通过氧消耗和二氧化碳生成测量的代谢速度的增加随着总微生物密度增加。如参考图2所示，以1％和5％结合水平利用恶臭假单胞菌隔离群与生物磷灰石，在样品的114小时温育期后，总有机物质显著增加。总有机物质的增加反映总微生物群体的增加，可归因于生物表面活性剂的养分供应的增加。增加的微量营养物的可利用性导致增强的生物活性，产生有机物质的增加。虽然用生物磷灰石与恶臭假单胞菌隔离群菌株的结合可以看到最显著的结果，但是其它磷灰石的多种组合认为一种或多种隔离群可以用于增加总微生物活性。
虽然不单独报道，注意到如图2中表明的有机物质的增加与土壤pH、O2消耗、CO2产生的显著增加以及如图1表明的铅生物利用率的减少相关。
相信上面描述的隔离群的使用产生铅的生物利用率减少，至少部分由于所述隔离群产生表面活性剂的性质。对于递增的代谢速度、养分有效性和pH的有利增加以及铅生物利用率的降低，认为所述生物表面活性剂加强了磷灰石的固有倾向。如上所述，所述生物表面活性剂引起有利的土壤条件，所述土壤条件改善养分条件和对于微生物的微量营养物的可利用性。认为土壤中生物活性和有关生物量的增加进一步减少铅的生物利用率。降低土壤的铅生物利用率的恶臭假单胞菌活性与5％浓度的BA是协同作用的。呼吸速率、微生物密度和生物量增加的指数增长是活性与特定生物活性有关的明显证据。
如图1所表明，当应用于用作无机添加剂的任何特定磷灰石时，不同的表面活性剂具有不同的结果。通过常规实验，关于给定的土壤条件、选择的磷灰石和/或整治程序中使用的其它添加剂，可以评价多种隔离群以确定提供所需的铅生物利用率的改善的组合。可以选择添加剂和隔离群的最有用的组合以产生所需的铅生物利用率的减少。
如该申请中之前所述，所述隔离群对于PAHs的减少以及促进来自污染土壤和底物的矿物离子的除去和/或分离是有用的。因此，对于具有多种污染物包括PAHs、金属离子及其它金属诸如铅的污染土壤和废液，一种或多种本隔离群包括产生生物表面活性剂的隔离群的使用可以在给定地点内有效处理多种污染物。虽然在高度污染土壤(900mg Pb/Kg土壤)整治的上下文中给出了以上实施例，但是相信单独隔离群或隔离群组合的应用不局限于土壤整治成果本身。例如，相信可以将产生生物表面活性剂的隔离群用作矿山或工业设备的废液处理方法的一部分，在所述矿山或工业设备那里产生重金属、金属离子、铅、铜、镉、锌、其它金属及其它污染物。许多地点(即，填埋场和褐色场(brownfields))具有仍然关于健康关系的低ppm浓度(1-10mg Pb/Kg土壤)的铅污染，原因在于潜在的毒物学影响和将来的土地利用。结合到初始废液并且包括一种或多种以上隔离群的接种物的使用可以引起所述废液内污染物的量减少并引入微生物菌丛群，其可以对于产生和/或储存的废物作为长期处理规程持续。例如，可以最初处理尾矿而在沉积到埋藏区上之前减少某些污染物。然后，尾矿内的隔离群存在可用于有利于进一步处理，将所述进一步处理设计成促进有用的生物活性以便引起存在于废液中的污染物的持续减少和/或稳定。
相信类似的结果可被用于多种工业废液，在那里所述隔离群可以用作生物处理过程的一部分以最初减少污染物的水平并且提供可以用作储存或沉积废液的长期处理的一部分的微生物群体。
虽然已经利用特定的术语、装置和方法描述了本发明的优选实施方案，但是这样的描述仅用于说明性的目的。使用的术语是描述而不是限制的术语。应当理解，本领域普通技术人员可以在不背离陈述在下列权利要求中的本发明实质和范围的情况下进行改变和变化。另外，应当理解，多种实施方案的方面可以是全部和部分互换。因此，后附权利要求的实质和范围不应该受限于包含在其中的优选方案的描述。

Claims (16)

1.用于石油烃生物整治的生物学纯菌株，所述菌株包含选自由ATCC序列号PTA-5570、PTA-5571、PTA-5572、PTA-5573、PTA-5574、PTA-5575、PTA-5576、PTA-5577、PTA-5578、PTA-5579、PTA-5580、PTA-5581及其组合组成的组的隔离群。
2.来自土壤环境的石油污染物的生物整治方法，所述方法包含下列步骤：
提供含有石油污染物的污染土壤供应；
将至少一种细菌隔离群引入到所述污染土壤供应中，所述细菌隔离群代谢石油污染物的组分并且还产生生物表面活性剂；和，
在处理时间内提供足够养分而足以使利用污染物的隔离群降解所述石油污染。
3.根据权利要求2的方法，其中在用至少一种细菌隔离群处理后，所述土壤之内的石油污染物的所述浓度小于约100ppm的总石油烃。
4.处理被重金属污染物和石油污染物污染的土壤废物的方法，所述方法包含下列步骤：
提供含有重金属污染物和石油污染物的污染土壤供应；
将至少一种细菌隔离群引入到所述污染土壤供应中，所述细菌隔离群代谢石油污染物的组分并且还产生生物表面活性剂；和，
定期从所述土壤供应除去一部分产生的生物表面活性剂，所述生物表面活性剂在其中含有或者一部分所述重金属或者所述石油污染物；和，
重复除去一部分所述表面活性剂的所述步骤直到所述重金属浓度减少至目标值。
5.根据权利要求2的方法，其中所述污染土壤供应还含有低水平的放射性废物。
6.根据权利要求2的方法，其中所述引入隔离群的步骤还包含添加选自由ATCC序列号PTA-5579、PTA-5580、和PTA-5581及其组合组成的组隔离群。
7.根据权利要求4的方法，其中所述引入至少一种细菌隔离群的步骤还包含添加选自由ATCC序列号PTA-5579、PTA-5580和PTA-5581及其组合组成的组的隔离群。
8.处理含有低水平放射性物质和石油烃的土壤的方法，所述方法包含下列步骤：
提供含有放射性废物和石油烃的污染土壤供应；
将至少一种细菌隔离群引入到所述污染土壤供应中，所述细菌隔离群代谢石油烃组分并且选自代谢石油烃组分的由ATCC序列号PTA-5570、PTA-5571、PTA-5572、PTA-5573、PTA-5574、PTA-5575、PTA-5576、PTA-5577、PTA-5578、PTA-5579、PTA-5580、PTA-5581及其组合组成的组；和，
处理所述污染土壤供应直到所述石油污染物的处理浓度小于约100ppm总石油烃。
9.根据权利要求8的方法，其中所述至少一种细菌隔离群还包含选自由ATCC序列号PTA-5579、PTA-5580、和PTA-5581及其组合组成的组的隔离群。
10.根据权利要求2的方法，其中所述石油污染物包括聚芳烃。
11.根据权利要求10的方法，其中所述聚芳烃还包括选自由2-环、3-环、和4-环聚芳烃及其组合组成的组的聚芳烃。
12.根据权利要求8的方法，其中所述至少一种细菌隔离群还在生物整治条件期间产生表面活性剂。
13.根据权利要求12的方法，所述方法还包含定期除去一部分来自所述污染土壤供应产生的表面活性剂的另外步骤。
14.根据权利要求4的方法，其中所述石油污染物还包括聚芳烃。
15.根据权利要求14的方法，其中所述聚芳烃还包括选自由2-环、3-环、和4-环聚芳烃及其组合组成的组的聚芳烃。
16.处理铅污染土壤以便减少铅的生物利用率的方法，所述方法包含：
提供铅污染土壤供应；
提供约1％至约5％或更大的的生物磷灰石形式的土壤改良剂；
还将选自由ATCC序列号PTA-5580、PTA-5581及其组合组成的组的接种物加入到所述污染土壤；
其中所述污染土壤此后具有更低的铅生物利用率。
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