CN113930365B - 一株降解多环芳烃的铜绿假单胞菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株降解多环芳烃的铜绿假单胞菌及其应用，属于微生物技术领域。所述菌株为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)NJS‑1，已于2021年8月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.23312。本发明所述的铜绿假单胞菌NJS‑1具有高效的降解多环芳烃的能力，可用于生物修复多环芳烃污染土壤和污染地下水，且具有绿色、高效、无污染、普适性好等优点。

Description

一株降解多环芳烃的铜绿假单胞菌及应用

技术领域

本发明属于微生物及生物技术领域，具体涉及一株可以降解多环芳烃的铜绿假单胞菌及其应用。

背景技术

土壤和地下水是人类赖以生存的物质基础，是不可再生的自然资源。但随着工业生产规模的不断扩大，大量有毒有害的有机物被排放到土壤和地下水中，造成了严重的污染。尤其是多环芳烃类物质(例如：菲、萘、蒽等)，大多难以降解，不仅严重影响生态环境，更对人体健康造成严重的危害。由于高污染，大量污染的工业场地或周边土壤无法直接用作居住、学校或公共设施用地，严重地制约了社会经济的发展。

传统的修复工艺包括：物理法、化学法和生物法。物理修复法包括：热脱附、气相抽提、电动修复等；化学修复方法是利用化学作用将土壤或地下水中的有机污染物分解成小分子或洗脱下来，一般适用于高浓度污染场地的处理，主要包括：化学氧化和土壤淋洗技术等。虽然物理修复技术和化学修复技术较为成熟，但存在处理成本高(>1000元/立方)、能耗大、工序复杂，污染物残留量高和严重的二次污染等问题，已经无法满足日益严格的环保处理要求，而高昂的处理成本也不符合我国国情。生物修复技术由于处理成本低、消耗能源少、操作简单，无二次污染等优点，被认为是最具潜力的土壤修复技术。然而，微生物修复所需作用周期往往较长，难以满足当前对土壤修复的迫切需求，也极大程度地限制该技术的大规模应用，这与缺乏高效的降解菌株有关。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一株用于降解多环芳烃的铜绿假单胞菌，该菌株可应用于生物修复多环芳烃污染的土壤和地下水，以弥补现有技术的不足，具有良好的市场前景。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明所提供的铜绿假单胞菌，为Pseudomonas aeruginosa NJS-1，保藏编号为CGMCC No.23312，已于2021年8月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明的目的还在于提供上述铜绿假单胞菌NJS-1在降解多环芳烃中的应用，所述多环芳烃为菲、萘、蒽或荧蒽；具体步骤如下：

(1)将铜绿假单胞菌NJS-1接种到灭菌后的种子培养基中，30～40℃摇床震荡培养形成种子培养液，按0.5-5％体积比的接种量将种子培养液接种到液体培养基中；

(2)取被多环芳烃污染的土壤或者地下水，加入步骤(1)所述的液体培养基，将混合后的泥-水溶液，置于35℃摇床中进行培养5天以上。

更佳的，种子培养基为LB培养基，配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0.。

更佳的，液体培养基组成为：KNO₃ 1～5g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 1～4g/L，NaH₂PO₄ 1～4g/L，NaCl 0.5～2g/L，pH＝6.0～8.0。

更佳的，污染土壤与步骤(1)所述的培养基的比例为1：0.5～2g/ml，污染土壤中多环芳烃的含量为10-5000mg/kg。

更佳的，污染地下水与步骤(1)所述的培养基的比例为1：0.5～2(v/v)，污染地下水中多环芳烃的含量为10-5000mg/L。

与现有技术相比，本发明的优点是：对多环芳烃的降解效率高，耐受多环芳烃的能力强，可高效快速的降解土壤和水中的多环芳烃。

具体实施方式

本发明所述的铜绿假单胞菌NJS-1是从被多环芳烃污染的土壤中分离获得的，该菌株于35℃在LB固体培养基上平板上生长，菌落为米黄色，菌落表面湿润。对筛选分离后得到的纯种菌株进行了16sRNA测序，该菌株的16sRNA基因序列见序列表。经过与Genbank的对比确定是属于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的新型菌株，命名为铜绿假单胞菌NJS-1。

实施例1:新型铜绿假单胞菌NJS-1分离筛选及鉴定

1、菌株富集

将5g取自被多环芳烃污染的土壤放入含60mL无菌蒸馏水的摇瓶中，至于35℃恒温摇床上培养30分钟，取2mL上清液接入60mL LB液体培养基，然后培养24小时，获得可以在多环芳烃污染土壤中生存的富集菌株。LB液体培养基(g/L)的组成为：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH＝7.0。

2、可降解多环芳烃菌株的筛选

1)以多环芳烃(菲)作为唯一碳源对菌株进行筛选：

以菲为唯一碳源进行菌株的筛选。取2mL的菌株富集液，加入到60mL含5000mg/L菲的液体培养基中，然后在35℃恒温摇床进行培养，该液体培养基的组成为：KNO₃ 3g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 3g/L，NaH₂PO₄ 2g/L，NaCl 1g/L，pH＝7.0。

培养48小时后，将培养液进行梯度稀释，并涂于筛选培养基中，在35℃的培养箱中培养24小时，得到约30个单菌落，筛选培养基为LB固体培养基(g/L)的组成为：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，琼脂粉15，pH＝7.0。挑选生长旺盛的单菌落，在相同的培养条件下反复进行筛选培养，由此可以获得纯种菌株，命名为铜绿假单胞菌NJS-1。

2)以菲作为唯一碳源对菌株进行检测：

将上述获得的纯种菌株在60mL LB液体培养基中进行富集培养后，取2mL扩大培养后的液体放入60mL以菲为唯一碳源的液体培养基中，在35℃恒温摇床进行培养，液体培养基的组成为：菲2g/L，KNO₃ 3g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 3g/L，NaH₂PO₄ 2g/L，NaCl 1g/L，pH＝7.0；

培养72小时后，对培养基内液体进行表面张力测定与接菌前的培养基内液体的表面张力进行比较，发现接入NJS-1菌后的培养基液体表面张力降低，说明该菌有可能产生生物表面活性剂，对接菌后的培养基测定菲含量，发现培养基内菲含量有所降低，因此该菌具有降解菲的能力。

3、菌株的分类学鉴定

采用分子生物学的方法对筛选得到的菌株进行鉴定，测得其16S rRNA序列，在GenBank核酸数据库中进行比对，通过序列比对确认为空气芽孢杆菌，命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)NJS-1，并于2021年8月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.23312。

实施例2：铜绿假单胞菌NJS-1降解多环芳烃能力的测定

将分离的铜绿假单胞菌NJS-1接种至不同多环芳烃(菲)(0.5、1、2、3、5g/L)含量的培养基中，置于35度摇床中培养7天，然后分析培养基中残留的菲含量，并计算降解率。培养基的组成为：KNO₃ 3g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 3g/L，NaH₂PO₄ 2g/L，NaCl 1g/L，pH＝7.0.

初始菲含量[g/L]	菲的降解率(％)
		0.1	93.2
0.5	84.6
		1	80.3
2	59.7

实施例3：铜绿假单胞菌NJS-1处理多环芳烃污染土壤

将铜绿假单胞菌NJS-1接种到灭菌后的LB培养基中，35℃摇床(240rpm)震荡培养形成种子培养液，按3％体积比的接种量将种子培养液接种到液体培养基(KNO₃ 3g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 3g/L，NaH₂PO₄ 2g/L，NaCl 1g/L，pH＝7.0)中；

取被多环芳烃污染的土壤(以下简称污染土壤)10g，加入10ml的液体培养基。其中污染土壤中的多环芳烃含量为128mg/kg，将混合后的泥水溶液，置于35℃摇床(240rpm)中进行培养，5天后分析油泥中残留的多环芳烃含量。结果表明：污染土壤中残留量为4.5mg/kg，降解率为96.48％。

实施例4：铜绿假单胞菌NJS-1处理多环芳烃污染的地下水

将铜绿假单胞菌NJS-1接种到灭菌后的LB种子培养基中，35℃摇床(240rpm)震荡培养形成种子培养液，按3％体积比的接种量将种子培养液接种到液体培养基(KNO₃ 3g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 3g/L，NaH₂PO₄ 2g/L，NaCl 1g/L，pH＝7.0)中；

取被芳烃(甲苯、二甲苯、菲)污染的水20ml，加入30ml的培养基。其中污染水体中的多环芳烃含量为87mg/L，将混合后的水溶液置于35℃摇床(240rpm)中进行培养，5天后分析水中残留的多环芳烃含量。结果表明：降解后水中的多环芳烃残留量为5.5mg/L，降解率为93.68％。

以上所述，仅为本发明专利的较佳示例而已，并非用于限定本发明专利的保护范围。除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变化形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

序列表

<110> 南京尚土生态环境有限公司

<120> 一株降解多环芳烃的铜绿假单胞菌及应用

<130> 2021.10.19

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1108

<212> DNA

<213> Pseudomonas aeruginosa NJS-1

<220>

<221> misc_feature

<222> (1077)..(1077)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 1

tggtaccgtc ccccttgcgg ttagactagc tacttctgga gcaacccact cccatggtgt 60

gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgt gacattctga ttcacgatta 120

ctagcgattc cgacttcacg cagtcgagtt gcagactgcg atccggacta cgatcggttt 180

tatgggatta gctccacctc gcggcttggc aaccctttgt accgaccatt gtagcacgtg 240

tgtagccctg gccgtaaggg ccatgatgac ttgacgtcat ccccaccttc ctccggtttg 300

tcaccggcag tctccttaga gtgcccaccc gaggtgctgg taactaagga caagggttgc 360

gctcgttacg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacagc catgcagcac 420

ctgtgtctga gttcccgaag gcaccaatcc atctctggaa agttctcagc atgtcaaggc 480

caggtaaggt tcttcgcgtt gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct tgtgcgggcc 540

cccgtcaatt catttgagtt ttaaccttgc ggccgtactc cccaggcggt cgacttatcg 600

cgttagctgc gccactaaga tctcaaggat cccaacggct agtcgacatc gtttacggcg 660

tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc tccccacgct ttcgcacctc agtgtcagta 720

tcagtccagg tggtcgcctt cgccactggt gttccttcct atatctacgc atttcaccgc 780

tacacaggaa attccaccac cctctaccgt actctagctc agtagttttg gatgcagttc 840

ccaggttgag cccggggatt tcacatccaa cttgctgaac cacctacgcg cgctttacgc 900

ccagtaattc cgattaacgc ttgcaccctt cgtattaccg cggctgctgg cacgaagtta 960

gccggtgctt attctgttgg taacgtcaaa acagcaaggt attaacttac tgccctttcc 1020

tcccaactta aagtgcttta caatccgaag accttcttca cacacgcgat ggctggntca 1080

ggctttcgcc catgtccaat atccccac 1108

Claims (6)

1.一种铜绿假单胞菌在降解多环芳烃中的应用，其特征在于，所述多环芳烃为菲，所述铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)NJS-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22312。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，具体步骤如下：

(1)将铜绿假单胞菌NJS-1接种到灭菌后的种子培养基中，30～40℃摇床震荡培养形成种子培养液，按0.5-5％的接种量将种子培养液接种到液体培养基中；

(2)取多环芳烃污染的土壤或地下水，加入步骤(1)所述的培养基，将混合后的油泥水溶液，置于35℃摇床中进行培养5天以上。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述种子培养基为LB培养基，组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述液体培养基组成为：KNO₃ 1～5g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 1～4g/L，NaH₂PO₄ 1～4g/L，NaCl0.5～2g/L，pH＝6.0～8.0。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述土壤与步骤(1)所述的液体培养基的比例为1：0.5～2g/ml，所述土壤中的多环芳烃含量为10-5000mg/kg。

6.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述地下水与步骤(1)所述的液体培养基的比例为1：0.5～2(v/v)，所述地下水中的多环芳烃含量为10-5000mg/L。