CN113151054B - 一株伯克霍尔德菌gdutan9及其应用 - Google Patents

一株伯克霍尔德菌gdutan9及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明首次分离出一株伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)GDUTAN9，于2021年1月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2021093。本发明通过在含有苯系物的无机盐培养基中接种伯克霍尔德菌GDUTAN9研究其降解性能，结果表明，伯克霍尔德菌GDUTAN9对苯系物的降解能力良好，该菌株在不同浓度的邻二甲苯溶液中的降解率均高达98.8％及以上，其中，在浓度为5mg/L的邻二甲苯溶液中，伯克霍尔德菌GDUTAN9对邻二甲苯的降解率高达100％。因此，菌株GDUTAN9在苯系物污染的环境修复方面十分具备应用潜力。

Description

一株伯克霍尔德菌GDUTAN9及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种伯克霍尔德菌GDUTAN9及其应用。
背景技术
由于工业排放、车辆燃油燃烧和石油产业的增加，环境中挥发性有机芳香族化合物(主要是苯系物)含量与日俱增。尤其是在石油勘探以及与此类活动相关等产业泄漏和天然气燃烧中排放的苯系物是导致生态环境严重恶化的主要原因。大量研究已经表明，苯系物及其烷基化衍生物具有致突变性和致癌性，苯系物暴露会导致人急性中毒症状和中枢神经系统麻醉，严重时会导致中毒者抽搐、昏迷，对公众健康构成严重威胁。因此非常有必要净化环境中的废气以保障人们的身心健康。
生物法是一种科学、合理、高效、环境友好型的苯系物处理方法，该处理措施得到了环境科学工作者的关注。其中，伯克霍尔德菌作为一种广泛存在于水、土壤、植物和人体中的革兰氏阴性非发酵需氧细菌，在多个领域都具有生物应用价值，但迄今为止，很少关于使用伯克霍尔德菌降解苯系物的相关报道。目前，在现有技术中仅有公布号为CN106244507 A的中国专利公开了吡咯伯克霍尔德氏菌的应用及其降解邻苯二甲酸2-乙基己酯的方法，具体降解方法为是在酵母提取物存在的条件下，吡咯伯克霍尔德氏菌B1213与邻苯二甲酸2-乙基己酯接触。然而，该吡咯伯克霍尔德氏菌B1213对邻苯二甲酸2-乙基己酯降解72h的降解率仅能达到73.49％。因此，筛选降解苯系物能力良好、降解效率高的伯克霍尔德菌具有十分重要的应用意义。
发明内容
本发明的第一目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一株伯克霍尔德菌GDUTAN9。
本发明的第二个目的在于提供上述伯克霍尔德菌GDUTAN9在制备降解苯系物的微生物制剂中的应用。
本发明的第三个目的在于提供一种包含上述伯克霍尔德菌GDUTAN9的微生物制剂。
本发明的第四个目的在于提供上述伯克霍尔德菌GDUTAN9或微生物制剂在降解大气、水体或土壤的苯系物中的应用。
本发明的第五个目的在于提供一种利用伯克霍尔德菌GDUTAN9降解苯系物的方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一株伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)GDUTAN9，其特征在于，所述伯克霍尔德菌GDUTAN9于2021年1月18日保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO：M 2021093，保藏地址为中国武汉武汉大学。
本发明提供的洋葱伯克霍尔德菌GDUTAN9的16S rDNA基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。
本发明还提供了上述伯克霍尔德菌GDUTAN9在制备降解苯系物的微生物制剂中的应用。
本发明还提供了一种微生物制剂，包含上述伯克霍尔德菌GDUTAN9。
本发明提供了上述伯克霍尔德菌GDUTAN9或微生物制剂在降解大气、水体或土壤的苯系物中的应用。
优选地，上述苯系物为邻二甲苯。
本发明还提供了一种降解苯系物的方法，包括将上述伯克霍尔德菌 GDUTAN9接种在含有苯系物的无机盐培养基中。
优选地，所述方法具体包括以下步骤：将伯克霍尔德菌GDUTAN9种子液在肉汤培养基中培养12～15h，离心收集菌体，洗涤，然后接种于苯系物无机盐培养基中培养，进行苯系物的降解。
更优选地，所述伯克霍尔德菌GDUTAN9在含有苯系物的无机盐培养基中的接种量为10％～12％。
更优选地，所述苯系物在无机盐培养基中的浓度为1～30mg/L。
更优选地，所述降解时间为45～50h。
更优选地，所述培养的条件为：在37℃、振动频率200r/min摇床下培养。
更优选地，所述无机盐培养基中包括无机盐溶液和微量元素溶液，无机盐溶液和微量元素溶液的体积比为1000：1，所述无机盐溶液中的无机盐为：K2HPO4·3H2O 1.2g/L，KH2PO41.2g/L，NH4Cl 0.4g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L， FeSO4·7H2O 0.01g/L；所述微量元素溶液中的微量元素为：CaCl2·2H2O 0.2g/L， MnSO4·4H2O 0.2g/L，CuSO4·2H2O 0.01g/L，ZnSO4·7H2O 0.2g/L，CoCl2·6H2O 0.09g/L，Na2MoO4·2H2O 0.12g/L，H3BO3 0.006g/L。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首次分离出一株伯克霍尔德菌GDUTAN9，于2021年1月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021093，保藏地址为中国武汉武汉大学。伯克霍尔德菌GDUTAN9对苯系物的降解能力良好，该菌株在不同浓度的邻二甲苯溶液中的降解率均高达98.8％及以上，其中，在浓度为5mg/L的邻二甲苯溶液中，伯克霍尔德菌GDUTAN9对邻二甲苯的降解率高达100％。因此，菌株GDUTAN9在大气、水体或土壤的苯系物降解领域十分具备应用潜力。
附图说明
图1为伯克霍尔德菌GDUTAN9在扫描电镜下的形态图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明实施例中的培养基配方如下：
无机盐培养基中包括无机盐溶液和微量元素溶液，无机盐溶液和微量元素溶液的体积比为1000：1，所述无机盐溶液中的无机盐为：K2HPO4·3H2O 1.2g/L， KH2PO41.2g/L，NH4Cl 0.4g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L；所述微量元素溶液中的微量元素为：CaCl2·2H2O 0.2g/L，MnSO4·4H2O 0.2g/L， CuSO4·2H2O 0.01g/L，ZnSO4·7H2O0.2g/L，CoCl2·6H2O 0.09g/L，Na2MoO4·2H2O 0.12g/L，H3BO3 0.006g/L。
实施例1伯克霍尔德菌GDUTAN9的分离与鉴定
本发明所述的具有苯系物降解能力的伯克霍尔德菌Burkholderia sp. GDUTAN9是从广东省广州市兴丰垃圾填埋场垃圾渗滤液中筛选分离、纯化而得。采用的无机盐培养基分离纯化；以苯系物为碳源和能源物质时驯化，驯化底物浓度依次为1mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L。首先取10mL垃圾渗滤液加入含1mg/L邻二甲苯的无机盐培养基，37℃驯化5天后，以10％接种量接种至下一浓度驯化，逐步提高邻二甲苯浓度进行驯化。接着取0.2mL稀释至10-1～10-7倍的菌液均匀涂布在以邻二甲苯为碳源的固体培养基中，挑选生长状态良好、边缘整齐的单菌落富集培养后进行的降解实验，将具有降解效果最好的菌落进行保存并做菌种鉴定。鉴定结果如下：
(1)菌体的形态特性：
a.根据《伯杰氏细菌鉴定手册》的生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，所筛选的伯克霍尔德菌Burkholderia sp.GDUTAN9为革兰氏阴性菌；其细菌形态为杆状，菌体大小为(0.2～0.4)×(0.8～1.2)μm，有鞭毛，其在SEM下的形貌如图1所示；
b.在LB固体培养基培养24h后菌落的形态特性：菌落形态为圆形，乳白色，不透明，菌落直径为2.0～4.0mm；
c.菌株GDUTAN9主要的生理生化特征如表1：
表1检测菌体的生理生化特征
Figure BDA0002977414490000041
注：反应状态分为阳性和阴性，阳性形状编码为“+”，阴性形状编码为“-”
(2)采用DNA提取试剂盒提取伯克霍尔德菌Burkholderia sp.GDUTAN9总 DNA。采用细菌的16S rDNA通用引物：
上游引物：27F(5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3')
下游引物：1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')
其16S rDNA基因测序结果如下(SEQ ID:No.1)：
agatgattctaccgtggtgaccgtcctccttgcggttagactagccacttctggtaaaacccactcccatggtgtgacgggcg gtgtgtacaagacccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcatgcactcgagtt gcagagtgcaatccggactacgatcggttttctgggattagctccccctcgcgggttggcaaccctctgttccgaccattgta tgacgtgtgaagccctacccataagggccatgaggacttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtctcct tagagtgctcttgcgtagcaactaaggacaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctga cgacagccatgcagcacctgtgcgccggttctctttcgagcactcccgaatctcttcaggattccgaccatgtcaagggtag gtaaggtttttcgcgttgcatcgaattaatccacatcatccaccgcttgtgcgggtccccgtcaattcctttgagttttaatcttgc gaccgtactccccaggcggtcaacttcacgcgttagctacgttactaaggaaatgaatccccaacaactagttgacatcgttt agggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgtgcatgagcgtcagtattggcccagggggctg ccttcgccatcggtattcctccacatctctacgcatttcactgctacacgtggaattctacccccctctgccatactctagcctg ccagtcacaaatgcagttcccaggttgagcccggggatttcacatctgtcttaacaaaccgcctgcgcacgctttacgccca gtaattccgattaacgctcgcaccctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccggtgcttattcttccggtaccgtc atccccccagggtattaacccagaggttttctttccggacaaaagtgctttacaacccgaaggccttcttcacacacgcggca ttgctggatcaggctttcgcccattgtccaaaattccccactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagt gtggctggtcgtcctctcagaccagctactgatcgtcgccttggtaggcctttaccccaccaactagctaatcagccatcggc caaccctatagcgcgaggcccgaaggtcccccgctttcatccttggatcgtatgcggtattaatccggctttcgccgggctat cccccactacaggacatgttccgatgtattactcacccgttcgccactcgccaccaggtgcaagcacccgtgctgccgttcgactgcaggtaagcatcgc
将长度为1429bp的16S rRNA基因序列与Genbank中已登录的基因序列进行比对分析发现菌种与Burkholderia sp.LYS-2-3最相似，相似度为99％。综合上述的生理生化特性、16S rRNA基因序列结果，本发明所筛选的细菌应归属于伯克霍尔德菌属，命名为伯克霍尔德菌Burkholderia sp.GDUTAN9，于2021年 1月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021093，保藏地址为中国武汉武汉大学。
实施例2伯克霍尔德菌GDUTAN9对苯系物的降解性能测定
将实施例1筛选的伯克霍尔德菌GDUTAN9在营养肉汤培养基(牛肉膏3.0 g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 5.0g/L)中富集增菌培养12h后，离心收集菌体，并用磷酸盐缓冲液洗涤三次，然后以10％接种量悬浮在100mL含有浓度分别为 5mg/L、8mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L邻二甲苯的无机盐培养基(提前在121℃高压灭菌30min)的顶空瓶中，加盖密封，在37℃、200r/min 下培养进行降解实验，48小时后顶空取样，测定顶空中邻二甲苯的浓度，并利用亨利定律来检测其在液相中的降解率。检测条件为：含氢焰离子化检测器(FID)GC9800气相色谱仪(AT.SE-54毛细管柱，30m×0.25mm×0.25μm)，检测器温度200℃，进样口气化室温度150℃，柱炉温度120℃，不分流模式。采用 Agilent 500μL气密针进样，进样量为500μL。结果如表2所示：
表2伯克霍尔德菌GDUTAN9对不同初始浓度的邻二甲苯的降解率
邻二甲苯浓度 降解率
5mg/L 100％
8mg/L 99.6％
10mg/L 99.4％
15mg/L 98.8％
20mg/L 98.8％
25mg/L 98.8％
从表2中可以看出，本发明筛选得到伯克霍尔德菌GDUTAN9在48h对邻二甲苯的降解能力最高可达100％，其对苯系物具有良好的降解效果，可以应用于大气、水体或土壤中的苯系物降解领域。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广东工业大学
<120> 一株伯克霍尔德菌GDUTAN9及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1429
<212> DNA
<213> 伯克霍尔德菌GDUTAN9(Burkholderia sp. GDUTAN9)
<400> 1
agatgattct accgtggtga ccgtcctcct tgcggttaga ctagccactt ctggtaaaac 60
ccactcccat ggtgtgacgg gcggtgtgta caagacccgg gaacgtattc accgcggcat 120
gctgatccgc gattactagc gattccagct tcatgcactc gagttgcaga gtgcaatccg 180
gactacgatc ggttttctgg gattagctcc ccctcgcggg ttggcaaccc tctgttccga 240
ccattgtatg acgtgtgaag ccctacccat aagggccatg aggacttgac gtcatcccca 300
ccttcctccg gtttgtcacc ggcagtctcc ttagagtgct cttgcgtagc aactaaggac 360
aagggttgcg ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacagcc 420
atgcagcacc tgtgcgccgg ttctctttcg agcactcccg aatctcttca ggattccgac 480
catgtcaagg gtaggtaagg tttttcgcgt tgcatcgaat taatccacat catccaccgc 540
ttgtgcgggt ccccgtcaat tcctttgagt tttaatcttg cgaccgtact ccccaggcgg 600
tcaacttcac gcgttagcta cgttactaag gaaatgaatc cccaacaact agttgacatc 660
gtttagggcg tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc tccccacgct ttcgtgcatg 720
agcgtcagta ttggcccagg gggctgcctt cgccatcggt attcctccac atctctacgc 780
atttcactgc tacacgtgga attctacccc cctctgccat actctagcct gccagtcaca 840
aatgcagttc ccaggttgag cccggggatt tcacatctgt cttaacaaac cgcctgcgca 900
cgctttacgc ccagtaattc cgattaacgc tcgcacccta cgtattaccg cggctgctgg 960
cacgtagtta gccggtgctt attcttccgg taccgtcatc cccccagggt attaacccag 1020
aggttttctt tccggacaaa agtgctttac aacccgaagg ccttcttcac acacgcggca 1080
ttgctggatc aggctttcgc ccattgtcca aaattcccca ctgctgcctc ccgtaggagt 1140
ctgggccgtg tctcagtccc agtgtggctg gtcgtcctct cagaccagct actgatcgtc 1200
gccttggtag gcctttaccc caccaactag ctaatcagcc atcggccaac cctatagcgc 1260
gaggcccgaa ggtcccccgc tttcatcctt ggatcgtatg cggtattaat ccggctttcg 1320
ccgggctatc ccccactaca ggacatgttc cgatgtatta ctcacccgtt cgccactcgc 1380
caccaggtgc aagcacccgt gctgccgttc gactgcaggt aagcatcgc 1429

Claims (7)

1.一株伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)GDUTAN9，其特征在于，所述伯克霍尔德菌GDUTAN9于2021年1月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2021093。
2.权利要求1所述伯克霍尔德菌GDUTAN9在制备降解邻二甲苯的微生物制剂中的应用。
3.一种微生物制剂，其特征在于，包含权利要求1所述伯克霍尔德菌GDUTAN9。
4.权利要求1所述伯克霍尔德菌GDUTAN9或权利要求3所述微生物制剂在降解大气、水体或土壤的邻二甲苯中的应用。
5.一种降解苯系物的方法，其特征在于，所述方法为：将权利要求1所述伯克霍尔德菌GDUTAN9种子液在肉汤培养基中培养12～15h，离心收集菌体，洗涤，然后接种于含有苯系物的无机盐培养基中培养，进行苯系物的降解；所述伯克霍尔德菌GDUTAN9在含有苯系物的无机盐培养基中的接种量为10％～12％；所述苯系物为邻二甲苯。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述苯系物在无机盐培养基中的浓度为1～30mg/L。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述降解时间为45～50h。
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