CN113980869B - 一株枯草芽孢杆菌gdutan13菌株及其应用 - Google Patents

一株枯草芽孢杆菌gdutan13菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株枯草芽孢杆菌GDUTAN13菌株及其应用。本发明所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GDUTAN13菌株于2021年8月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国武汉大学，菌株保藏编号为CCTCC NO：M 20211020。所述枯草芽孢杆菌GDUTAN13菌株具有良好的二甲基二硫醚降解能力，可用于降解二甲基二硫醚或制备用于降解二甲基二硫醚的试剂，用于修复由二甲基二硫醚引起的环境污染以及工业废气的净化治理中，极具实用价值。

Description

一株枯草芽孢杆菌GDUTAN13菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域。更具体地，涉及一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)GDUTAN13菌株及其应用。
背景技术
挥发性有机硫化物(volatile organic sulfides compounds，VOSCs)的排放严重影响了我国的环境空气质量。其中，二甲基二硫醚(Dimethyl Disulfide，DMDS)是一种典型的挥发性有机硫化污染物，其不仅可以产生让人不快的刺激性恶臭气味，高浓度的二甲基二硫醚还会使人的皮肤、眼睛和呼吸道受到强烈的刺激，长时间吸入后会对人体的消化系统、内分泌系统、血液循环系统、神经系统产生严重损害。二甲基二硫醚不但严重危害人类的身体健康，其进入大气硫循环还易形成酸雨、气溶胶等，改变全球气候。此外，二甲基二硫醚遇明火、高温、氧化剂易燃，遇酸或高热会分解成有毒的氧化硫气体，影响生产和生活安全。
在目前治理挥发性有机硫化污染物的方法中，生物法由于具有设备简单、投资少、易操作、反应剩余污泥少、不产生二次污染等优点而被广泛应用。而在生物法治理挥发性有机硫化污染物的过程中，离不开具有降解有机硫化物的菌。针对二甲基二硫醚的治理，研究人员发现并公开了多种具有二甲基二硫醚降解能力的细菌。例如，中国专利一种具有二甲基二硫醚降解能力的蜡状芽孢杆菌及其应用中，其所述蜡状芽孢杆菌在底物(二甲基二硫醚)浓度为5mg/L条件下降解72h时，对二甲基二硫醚的降解率为100.0％。而发掘更多种类的二甲基二硫醚降解菌，或降解效率更高的二甲基二硫醚降解菌，对于提高生物法治理二甲基二硫醚的效率具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GDUTAN13菌株及其应用。
本发明的第一个目的是提供一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GDUTAN13菌株。
本发明的第二个目的是提供所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GDUTAN13菌株或其菌液在降解二甲基二硫醚中的应用。
本发明的第三个目的是提供所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GDUTAN13菌株或其菌液在制备降解二甲基二硫醚的产品中的应用。
本发明的第四个目的是提供所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GDUTAN13菌株或其菌液在治理含二甲基二硫醚的工业废气中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种用于降解环境中的二甲基二硫醚的产品。
本发明的第六个目的是提供一种降解环境中的二甲基二硫醚的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明在对厨余垃圾处理厂垃圾发酵半成品中的微生物进行筛选、分离和纯化的过程中，发现了一株具有二甲基二硫醚降解能力的菌株。对该菌株的二甲基二硫醚降解能力进行实验发现其不仅具有降解二甲基二硫醚的能力，且降解效率高，在120h对20mg/L二甲基二硫醚的降解率为95.0％，对15mg/L二甲基二硫醚的降解率为100％。对该菌株进行生理生化和分子鉴定确认其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，故将其命名为枯草芽孢杆菌GDUTAN13菌株。
本发明提供了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GDUTAN13菌株，所述菌株于2021年8月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国武汉大学，菌株保藏编号为CCTCC NO：M 20211020。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GDUTAN13菌株的16rDNA的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
本发明所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GDUTAN13菌株不仅具有降解二甲基二硫醚的能力，且降解效率高，其在120h对20mg/L二甲基二硫醚的降解率为95.0％，对15mg/L二甲基二硫醚的降解率为100％。因此，本发明申请保护所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GDUTAN13菌株或其菌液的以下应用：
本发明申请保护枯草芽孢杆菌GDUTAN13菌株或其菌液在降解二甲基二硫醚中的应用。
本发明还申请保护枯草芽孢杆菌GDUTAN13菌株或其菌液在制备降解二甲基二硫醚的产品中的应用。
具体地，所述应用为枯草芽孢杆菌GDUTAN13菌株或其菌液在降解环境中的二甲基二硫醚或制备降解环境中的二甲基二硫醚的产品中的应用。
具体地，所述环境为大气、水体或土壤。
本发明还申请保护枯草芽孢杆菌GDUTAN13菌株或其菌液在治理含二甲基二硫醚的工业废气中的应用。
本发明还提供了一种用于降解环境中的二甲基二硫醚的产品，所述产品中含有枯草芽孢杆菌GDUTAN13菌株或其菌液。
本发明还提供了一种降解环境中的二甲基二硫醚的方法，将枯草芽孢杆菌GDUTAN13菌株或其菌液施加到含有二甲基二硫醚的环境中进行降解。
具体地，所述环境为大气、水体或土壤。
本发明具有以下有益效果：
本发明在对厨余垃圾处理厂垃圾发酵半成品中的微生物进行筛选、分离和纯化的过程中，发现了一株具有二甲基二硫醚降解能力的菌株。对该菌株进行生理生化和分子鉴定确认其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，故将其命名为枯草芽孢杆菌GDUTAN13菌株并保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏时间为2021年08月13日，保藏地址为中国武汉大学，菌株保藏编号为CCTCC NO：M 20211020。本发明所述枯草芽孢杆菌GDUTAN13菌株不仅具有降解二甲基二硫醚的能力，且降解效率高，在120h对20mg/L二甲基二硫醚的降解率为95.0％，对15mg/L二甲基二硫醚的降解率为100％，可用于降解二甲基二硫醚或制备用于降解二甲基二硫醚的试剂，用于修复由二甲基二硫醚引起的环境污染以及工业废气的净化治理中，极具实用价值。
附图说明
图1为本发明所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GDUTAN13菌株的菌体形态图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1菌株的筛选、分离和纯化
本发明以二甲基二硫醚为碳源和能源物质，从厨余垃圾处理场垃圾发酵半成品中筛选、分离纯化得到了一株具有二甲基二硫醚降解能力的菌株。
具体过程如下：
1、配制无机盐培养基，在无机盐培养基中添加二甲基二硫醚，使终浓度分别为5mg/L、8mg/L、10mg/L、15mg/L和20mg/L，用以筛选具有二甲基二硫醚降解能力的菌株。
2、取10mL厨余垃圾处理厂垃圾发酵半成品，加入含终浓度为5mg/L的二甲基二硫醚的100mL无机盐培养基中，37℃驯化培养5天后，以10％的接种量移入下一浓度(8mg/L)的含二甲基二硫醚的无机盐培养基中，接着于37℃驯化培养5天，以此类推，逐步提高二甲基二硫醚的浓度进行驯化培养。具体地，驯化培养所用二甲基二硫醚的浓度依次为5mg/L、8mg/L、10mg/L、15mg/L和20mg/L。驯化培养结束后，将最终培养的菌液依倍数稀释10-1～10-7倍，分别选取稀释度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7的稀释菌液，各取0.2mL稀释菌液均匀涂布在以二甲基二硫醚为碳源的固体培养基中，挑选生长状态良好的单菌落进行富集培养后再进行降解实验，选取二甲基二硫醚降解效果最好的单菌落进行保存，进一步对其二甲基二硫醚降解效率进行实验。
实施例2二甲基二硫醚降解率测定
本发明对实施例1中筛选、分离、纯化得到的菌株的二甲基二硫醚降解率进行了测定，具体测定方法如下：
(1)将筛选所得枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GDUTAN13菌株在营养肉汤培养基(含3.0g/L的牛肉粉、10.0g/L的蛋白胨、5.0g/L的NaCl)中富集增菌培养24h后，离心收集菌体，并用磷酸盐缓冲液洗涤三次；
(2)以10％接种量将培养的菌株悬浮在上述装有100mL无机盐培养基的血清瓶中，加入二甲基二硫醚溶液，使其在培养基中的终浓度分别为5mg/L、8mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L；
(3)加盖密封，37℃，150r/min振荡培养，定期取样测定气相中二甲基二硫醚的浓度，并利用亨利定律来检测其在液相中的降解率。
检测条件为：含氢焰离子化检测器(FID)GC9800气相色谱仪(AT.SE-54毛细管柱，30m×0.25mm×0.25μm)，检测器温度200℃，进样口气化室温度150℃，柱炉温度120℃。采用Agilent 500μL气密针进样，进样量为500μL，不分流模式。
降解率检测结果如表1所示：
表1不同初始浓度的二甲基二硫醚的降解率
二甲基二硫醚浓度 降解率
5mg/L 100％
8mg/L 100％
10mg/L 100％
15mg/L 97.5％
20mg/L 95.0％
从表1中可知，筛选、分离、纯化所得菌株在120h对20mg/L二甲基二硫醚的降解率为95.0％，对15mg/L二甲基二硫醚的降解率为97.5％。上述结果表明该菌株不仅具有二甲基二硫醚降解效果，且降解率高，降解效果好，可将其用于降解二甲基二硫醚或制备用于降解二甲基二硫醚的试剂，用于修复由二甲基二硫醚引起的环境污染以及工业废气的净化治理中，极具实用价值。
实施例3菌株的生物学鉴定及分子鉴定
本发明筛选、分离、纯化所得菌株的生物学鉴定及分子鉴定的过程和结果如下：
1、菌体形态观察
利用电子显微镜对筛选分离所得菌株的菌体形态进行观察发现，该菌形态为短杆状，有鞭毛，如图1所示。
2、菌落形态观察
固体培养基(含3.0g/L的牛肉粉、10.0g/L的蛋白胨、5.0g/L的NaCl)上培养24h后观察菌落形态，观察发现该菌的菌落为圆形，白色，不透明，边缘不整齐，菌落直径为3～5mm。
3、生理生化特征测定
本发明参照《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版，对所得菌株的生理生化指标进行了检测，结果如表2所示：
表2菌株的生理生化检测指标及检测结果
注：反应状态分为阳性和阴性，阳性形状编码为“+”，阴性形状编码为“-”。
由表2可知，本发明筛选所得菌株为革兰氏阳性厌氧菌。
4、分子鉴定
本发明以筛选、分离、纯化所得菌株的基因组DNA为模板，利用细菌的16S rDNA通用引物(27F/1492R)对所得菌株的16S rDNA进行了扩增及测序。菌株的16S rDNA序列如下(SEQ ID NO.1)所示：
CGTTACCTTCGGCGGCTGGCTCCTAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTTTGAACCATGCGGTTCAAACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTGCATTATAGCACCGCCAGT
将上述序列经NCBI比对发现，其与Genbank中已登录的菌种Bacillus subtilisstrain 384的16S rDNA序列最为相似，相似度为99.93％。将分子鉴定结合生物学及生理生化鉴定结果可知，本发明筛选、分离、纯化所得二甲基二硫醚降解菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，故将其命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GDUTAN13菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏时间为2021年08月13日，保藏地址为中国武汉大学，菌株保藏编号为CCTCC NO：M 20211020。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广东工业大学
<120> 一株枯草芽孢杆菌GDUTAN13菌株及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1444
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 1
cgttaccttc ggcggctggc tcctaaaagg ttacctcacc gacttcgggt gttacaaact 60
ctcgtggtgt gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc ggcatgctga 120
tccgcgatta ctagcgattc cagcttcacg cagtcgagtt gcagactgcg atccgaactg 180
agaacagatt tgtgggattg gcttaacctc gcggtttcgc tgccctttgt tctgtccatt 240
gtagcacgtg tgtagcccag gtcataaggg gcatgatgat ttgacgtcat ccccaccttc 300
ctccggtttg tcaccggcag tcaccttaga gtgcccaact gaatgctggc aactaagatc 360
aagggttgcg ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacaacc 420
atgcaccacc tgtcactctg cccccgaagg ggacgtccta tctctaggat tgtcagagga 480
tgtcaagacc tggtaaggtt cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt 540
gtgcgggccc ccgtcaattc ctttgagttt cagtcttgcg accgtactcc ccaggcggag 600
tgcttaatgc gttagctgca gcactaaggg gcggaaaccc cctaacactt agcactcatc 660
gtttacggcg tggactacca gggtatctaa tcctgttcgc tccccacgct ttcgctcctc 720
agcgtcagtt acagaccaga gagtcgcctt cgccactggt gttcctccac atctctacgc 780
atttcaccgc tacacgtgga attccactct cctcttctgc actcaagttc cccagtttcc 840
aatgaccctc cccggttgag ccgggggctt tcacatcaga cttaagaaac cgcctgcgag 900
ccctttacgc ccaataattc cggacaacgc ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg 960
cacgtagtta gccgtggctt tctggttagg taccgtcaag gtaccgccct attcgaacgg 1020
tacttgttct tccctaacaa cagagcttta cgatccgaaa accttcatca ctcacgcggc 1080
gttgctccgt cagactttcg tccattgcgg aagattccct actgctgcct cccgtaggag 1140
tctgggccgt gtctcagtcc cagtgtggcc gatcaccctc tcaggtcggc tacgcatcgt 1200
tgccttggtg agccgttacc tcaccaacta gctaatgcgc cgcgggtcca tctgtaagtg 1260
gtagccgaag ccacctttta tgtttgaacc atgcggttca aacaaccatc cggtattagc 1320
cccggtttcc cggagttatc ccagtcttac aggcaggtta cccacgtgtt actcacccgt 1380
ccgccgctaa catcagggag caagctccca tctgtccgct cgactgcatt atagcaccgc 1440
cagt 1444

Claims (10)

1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GDUTAN13菌株，其特征在于，所述菌株于2021年8月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国武汉大学，菌株保藏编号为CCTCC NO：M 20211020。
2.根据权利要求1所述枯草芽孢杆菌GDUTAN13菌株，其特征在于，所述菌株的16rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1所述枯草芽孢杆菌GDUTAN13菌株或其菌液在降解二甲基二硫醚中的应用。
4.权利要求1所述枯草芽孢杆菌GDUTAN13菌株或其菌液在制备降解二甲基二硫醚的产品中的应用。
5.根据权利要求3或4所述应用，其特征在于，所述应用为枯草芽孢杆菌GDUTAN13菌株或其菌液在降解环境中的二甲基二硫醚或制备降解环境中的二甲基二硫醚的产品中的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述环境为大气、水体或土壤。
7.权利要求1所述枯草芽孢杆菌GDUTAN13菌株或其菌液在治理含二甲基二硫醚的工业废气中的应用。
8.一种用于降解环境中的二甲基二硫醚的产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1所述枯草芽孢杆菌GDUTAN13菌株或其菌液。
9.一种降解环境中的二甲基二硫醚的方法，其特征在于，将权利要求1所述枯草芽孢杆菌GDUTAN13菌株或其菌液施加到含有二甲基二硫醚的环境中进行降解。
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述环境为大气、水体或土壤。
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