CN111154687A - 一种枯草芽孢杆菌及其在降解环氧乙烷中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一枯草芽孢杆菌及其在降解环氧乙烷中的应用。属于生物降解技术领域。所述枯草芽孢杆菌命名为EO‑03，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18433。该菌株可用于环氧乙烷的降解。与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：筛选驯化出一株环氧乙烷降解菌EO‑03，能耐受高浓度环氧乙烷降解菌，同时可将环氧乙烷作为唯一碳源加以利用，对环氧乙烷的降解率达到72.96％。

Description

一种枯草芽孢杆菌及其在降解环氧乙烷中的应用

技术领域

本发明涉及生物降解技术领域，更具体的说是涉及一种枯草芽孢杆菌及其在降解环氧乙烷中的应用。

背景技术

环氧乙烷是现代化工领域重要石化产品之一。由于环氧乙烷分子量小、穿透性高且能与DNA、蛋白质等生物大分子发生偶联化合反应，决定了它在医学灭菌行业有着无法替代的地位。另外，环氧乙烷灭菌成本低，能进行工业级大规模灭菌处理，是至今为止最重要的低温灭菌剂之一。

但是环氧乙烷在应用过程中会产生残留和污染，目前，处理环氧乙烷的方法主要有两种：一种是利用硫酸作为反应底物进行中和反应，该方法的弊端是吸收饱和度较小，并且会产生难以处理的副产物增大处理成本。另外一种是利用氧化反应炉进行氧化反应，这种方法对技术参数控制要求非常高，而且处理过程容易发生爆炸。故由于环氧乙烷性质极其活泼，易燃易爆，增大了环氧乙烷的应用难度。

利用微生物降解处理污染物是目前常采用的方法，但是环氧乙烷会抑制微生物的生长，常规发酵菌不能耐受高浓度环氧乙烷环境，并且对环氧乙烷的降解作用非常有限。

综上，提供一种耐受高浓度环氧乙烷环境、对环氧乙烷降解率高的菌株是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌及其在降解环氧乙烷中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种枯草芽孢杆菌，命名为EO-03，2019年8月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18433，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。EO-03菌株的分类学命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。

EO-03菌株的筛选驯化过程如下：

(1)从污水处理厂或化工厂排污口处采集泥土、淤泥、污水样本，经过低浓度环氧乙烷耐受富集、提纯筛选出降解环氧乙烷潜力菌；

(2)环氧乙烷耐受力驯化：将降解环氧乙烷潜力菌依次传代划线于含有不同环氧乙烷浓度(100mg/L-800mg/L)的环氧乙烷耐受力驯化培养基平板上，置于37℃恒温箱培养24-48h。在最终含500-800mg/L环氧乙烷耐受力驯化培养基平板上挑选菌落半径最大的单菌落，得到环氧乙烷耐受菌；

(3)环氧乙烷降解力驯化：将环氧乙烷耐受菌依次传代划线于含500-800mg/L环氧乙烷且含不同比例碳源(50％、30％、10％、0％)进行环氧乙烷降解能力驯化。在500-800mg/L，0％的碳源的环氧乙烷降解能力驯化培养基平板上，挑选菌落半径最大的单菌落进行保存，获得EO-03。

环氧乙烷可杀灭各种微生物，主要是烷基化作用，作用的位点是蛋白质和核酸分子中的巯基、氨基、羟基和羧基，环氧乙烷可使这些基团发生烷基化反应，使微生物中这些大分子失去活性；同时，环氧乙烷能抑制微生物各种酶的活性，阻碍了微生物正常代谢过程。综上，常规发酵菌并不能耐受高浓度环氧乙烷环境。本发明克服了现有技术上的难题，筛选驯化出一株环氧乙烷降解菌EO-03，能耐受高浓度环氧乙烷降解菌，同时可将环氧乙烷作为唯一碳源加以利用，对环氧乙烷的降解率达到72.96％。

枯草芽孢杆菌在降解环氧乙烷中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：筛选驯化出一株环氧乙烷降解菌EO-03，能耐受高浓度环氧乙烷降解菌，同时可将环氧乙烷作为唯一碳源加以利用，对环氧乙烷的降解率达到72.96％。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明实施例1中降解环氧乙烷潜力菌的革兰氏染色图；

图2附图为本发明实施例1中降解环氧乙烷潜力菌的生长菌落；

图3附图为本发明实施例1中降解环氧乙烷潜力菌的发育进化树；

图4附图为本发明实施例3中菌株在沙氏液体诱导培养基生长情况，其中图a为实验组1菌株EO-03在沙氏液体诱导培养基生长情况，图b为实验组2降解环氧乙烷潜力菌在沙氏液体诱导培养基生长情况。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1降解环氧乙烷潜力菌的富集、筛选与鉴定

(一)富集、筛选

①样品来源：本实施例样品取自广东省广州市郊污水处理厂排污口污泥混合物。

②富集增菌培养基A的制作：葡萄糖40g、酪蛋白胰酶消化物5g、动物组织胃蛋白酶消化物5g，调节pH 5.4-5.8，加蒸馏水至1000mL，分装至500mL锥形瓶，每个锥形瓶250mL。之后121℃灭菌20min，冷却至室温。将环氧乙烷试剂放置于冰盒上，用密封注射器吸取28μL环氧乙烷液体注入已灭菌的培养基中(培养基中环氧乙烷浓度为100mg/L，符合国家排放标准)，得到富集增菌培养基A。

③筛选纯化培养基的制作：葡萄糖40g、酪蛋白胰酶消化物5g、动物组织胃蛋白酶消化物5g、琼脂15g，pH 5.4，加蒸馏水至1000mL，分装至500mL锥形瓶，每个锥形瓶250mL。121℃灭菌20min，待培养基温度降至50-56℃时，用密封注射器吸取28μL环氧乙烷液体注入已灭菌的培养基中，得到筛选纯化培养基。

④富集增菌培养基B的制作：葡萄糖40g、酪蛋白胰酶消化物5g、动物组织胃蛋白酶消化物5g，调节pH 5.4-5.8，加蒸馏水至1000mL，分装至500mL锥形瓶，每个锥形瓶250mL。之后121℃灭菌20min，冷却至室温，得到富集增菌培养基B。

⑤称取步骤①中样品10.0g，加入100mL 0.03mol/L的磷酸盐缓冲液，混匀静置澄清120min，除去大颗粒泥沙，得混悬液。取1mL混悬液加入10mL富集增菌培养基A，置于摇床进行耗氧富集培养，转速为200r/min，37℃培养24-48h观察生长情况。

⑥通过平板划线法，将富集增菌培养基A中的优势菌种在筛选纯化培养基上进行划线分离，分离出环氧乙烷优势菌种。

⑦挑取环氧乙烷优势菌种在富集增菌培养基B中培养24h，得到降解环氧乙烷潜力菌，采用甘油保藏法(培养液与50％甘油比例1:1，-80℃下保存)保存。

通过上述实验步骤分离出一株降解环氧乙烷潜力菌，其菌落形态为灰白色或淡黄色，不透明，表面粗糙，边缘不整齐，粘性较大，菌落直径为4.0-5.0mm左右，无色素。

(二)降解环氧乙烷潜力菌的鉴定：

鉴定内容及方法：

a.形态特征鉴定：菌落形态观察、菌体显微形态观察、培养特征及革兰氏染色鉴定；

b.生理生化特性鉴定：理化特性包括营养类型、氮碳源利用能力及生化试验等；

c.分子生物学鉴定：依次进行菌体培养、细菌DNA提取、PCR扩增、16s基因测序和序列比对分析。

上游引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；SEQ ID NO.1；

下游引物1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；SEQ ID NO.2；

鉴定结果如下：

降解环氧乙烷潜力菌菌落形态为灰白色或淡黄色，不透明，表面粗糙，边缘不整齐，粘性较大，菌落直径为4.0-5.0mm，无色素(如图2所示)。菌体呈椭圆，会产生芽孢。细菌经革兰氏染色，显微镜镜检显示菌体为紫色，(如图1所示)，降解环氧乙烷潜力菌为革兰氏阳性菌。属于需氧菌，有极强的抗逆性。生长速度快，对营养要求比较低，能高效分泌许多蛋白及代谢产物，且不会产生毒素。

测序结果如SEQ ID NO.3所示，将该16S rRNA序列进行核苷酸序列BLAST比对，与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)16S rRNA的同源性在99％，如图3所示。

通过降解环氧乙烷潜力菌的形态特征鉴定、生理生化特性鉴定和分子生物学鉴定，经筛选纯化获得的降解环氧乙烷潜力菌菌株为一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌。

实施例2降解环氧乙烷潜力菌环氧乙烷诱导驯化

(1)环氧乙烷耐受力诱导驯化：

①环氧乙烷耐受力驯化培养基配置方案：蛋白胨10g、葡萄糖40g、琼脂15g，调节pH5.4-5.8，加蒸馏水至1000mL。分装成250mL规格，121℃灭菌20min。使用前加热融化培养基，待培养基温度降至50-56℃时，分别用密封注射器加入环氧乙烷25mg、50mg、125mg和200mg，制作成四种含不同环氧乙烷浓度(100mg/L、200mg/L、500mg/L和800mg/L)的环氧乙烷耐受力培养基平板，命名为环氧乙烷耐受力驯化培养基A、环氧乙烷耐受力驯化培养基B、环氧乙烷耐受力驯化培养基C、环氧乙烷耐受力驯化培养基D。

②利用划线方法，接种降解环氧乙烷潜力菌在环氧乙烷耐受力驯化培养基A，37℃恒温培养48h；选择菌落半径最大的单菌落，传代培养至环氧乙烷耐受力驯化培养基B，37℃恒温培养48h；选择菌落半径最大的单菌落，传代培养至环氧乙烷耐受力驯化培养基C，37℃恒温培养48h；选择菌落半径最大的单菌落，传代培养至环氧乙烷耐受力驯化培养基D，37℃恒温培养48h，获得环氧乙烷耐受菌。

(2)环氧乙烷降解能力驯化：

①环氧乙烷耐降解能力驯化培养基配置方案：配置含以下成分的培养基：

1)蛋白胨10g、葡萄糖20g、琼脂15g，调节pH 5.4-5.8，加蒸馏水至1000mL。

2)蛋白胨10g、葡萄糖12g、琼脂15g，调节pH 5.4-5.8，加蒸馏水至1000mL。

3)蛋白胨10g、葡萄糖4g、琼脂15g，调节pH 5.4-5.8，加蒸馏水至1000mL。

4)蛋白胨10g、琼脂15g，调节pH 5.4-5.8，加蒸馏水至1000mL。

分装成250mL规格，121℃灭菌20min，使用前加热融化培养基，待培养基温度降至50-56℃时，用密封注射器加入环氧乙烷200mg，制作成四种含不同碳源(50％、30％、10％、0％)的环氧乙烷降解能力驯化培养基，命名为环氧乙烷降解能力驯化培养基A、环氧乙烷降解能力驯化培养基B、环氧乙烷降解能力驯化培养基C、环氧乙烷降解能力驯化培养基D。

②利用划线方法，接种环氧乙烷耐受菌在环氧乙烷降解能力驯化培养基A，37℃恒温培养48h；选择菌落半径最大的单菌落，传代培养至环氧乙烷降解能力驯化培养基B，37℃恒温培养48h；选择菌落半径最大的单菌落，传代培养至环氧乙烷降解能力驯化培养基C，37℃恒温培养48h；选择菌落半径最大的单菌落，传代培养至环氧乙烷降解能力驯化培养基D，37℃恒温培养48h；选择半径最大的单菌落，保存于环氧乙烷降解能力驯化培养基D对应营养成分的琼脂培养基所制斜面，获得具有环氧乙烷降解能力的菌株EO-03，进行菌种保藏，保藏编号为CGMCC No.18433。

环氧乙烷降解能力诱导驯化结果见表1。

表1环氧乙烷降解能力诱导驯化结果

表1结果表明，EO-03菌株可在环氧乙烷为唯一碳源培养条件下正常生长，并且可以将环氧乙烷作为碳源进行利用。

通过EO-03菌株的形态特征鉴定、生理生化特性鉴定和分子生物学鉴定，鉴定方法同实施例1，结果表明，经筛选纯化获得的EO-03菌株为一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌。

实施例3EO-03菌株降解环氧乙烷效果鉴定

①沙氏液体培养基的制备:葡萄糖40g、酪蛋白胰酶消化物5g、动物组织胃蛋白酶消化物5g，调节pH 5.4-5.8，加蒸馏水至1000mL，分装至500mL锥形瓶，每个锥形瓶250mL。121℃灭菌20min，冷却至室温。

②沙氏液体诱导培养基的制备：蛋白胨10g加蒸馏水至1000mL，分装成400mL规格，121℃灭菌20min，冷却至室温保存。分别用密封注射器加入环氧乙烷160mg和320mg，制作成两种含不同环氧乙烷浓度(400mg/L和800mg/L)的沙氏液体诱导培养基。

③活化：取出降解环氧乙烷潜力菌和EO-03菌株，10μL接种于100mL沙氏液体培养基，37℃，200rpm，培养48h。培养菌液内菌体数量为10¹⁰-10¹²cfu/mL，得降解环氧乙烷潜力菌活化液和EO-03活化液。

④试验组：

实验组1：将5mL EO-03活化液接种于400mL沙氏液体诱导培养基中；

实验组2：接种实施例1筛选出的降解环氧乙烷潜力菌；

对照组组：不接种。

⑤置于37℃恒温箱静置培养48h。降解结果通过气相色谱检测。

检测方法依据GB 15979-2002。通过如下公式计算降解率：

降解率＝(对照组浓度-实验组浓度)/对照组浓度

结果如表2、图4所示所示。

表2环氧乙烷降解结果

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 中国环境科学研究院

侨康生物科技（广东）有限公司

<120> 一种枯草芽孢杆菌及其在降解环氧乙烷中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 1439

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctatacatgc aagtcgagcg gacagatggg agcttgctcc ctgatgttag cggcggacgg 60

gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa accggggcta 120

ataccggatg gttgtttgaa ccgcatggtt cagacataaa aggtggcttc ggctaccact 180

tacagatgga cccgcggcgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc aaggcgacga 240

tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc 300

tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg agcaacgccg 360

cgtgagtgat gaaggttttc ggatcgtaaa gctctgttgt tagggaagaa caagtgccgt 420

tcaaataggg cggcaccttg acggtaccta accagaaagc cacggctaac tacgtgccag 480

cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt aaagggctcg 540

caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc ccccggctca accggggagg gtcattggaa 600

actggggaac ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca cgtgtagcgg tgaaatgcgt 660

agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg cgactctctg gtctgtaact gacgctgagg 720

agcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg 780

agtgctaagt gttagggggt ttccgcccct tagtgctgca gctaacgcat taagcactcc 840

gcctggggag tacggtcgca agactgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc 900

ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct 960

ctgacaatcc tagagatagg acgtcccctt cgggggcaga gtgacaggtg gtgcatggtt 1020

gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgatc 1080

ttagttgcca gcattcagtt gggcactcta aggtgactgc cggtgacaaa ccggaggaag 1140

gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg 1200

ggcagaacaa agggcagcga aaccgcgagg ttaagccaat cccacaaatc tgttctcagt 1260

tcggatcgca gtctgcaact cgactgcgtg aagctggaat cgctagtaat cgcggatcag 1320

catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt 1380

tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt ttaggagcca gccgccgaag gttggacag 1439

Claims (2)

1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，命名为EO-03，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18433，EO-03菌株的分类学命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在降解环氧乙烷中的应用。

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