CN105316263A - 一种氰类化合物降解菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种氰类化合物降解菌及其应用，该降解菌为根癌农杆菌(Agrobacterium？sp.)TQH6菌株，以保藏号CCTCC？M2015613保藏。本发明的氰类化合物降解菌能够高效降解氰类化合物，对氰类化合物的耐受力强，适合应用于含氰焦化废水的生物处理。

Description

一种氰类化合物降解菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种氰类化合物降解菌及其应用。

背景技术

氰化物是一种剧毒物质，人体摄入0.18g的氰化物就会死亡，氰化钾的致死量为0.12g。含氰废水主要来源于电镀、煤气、焦化、冶金、金属加工、化纤、朔料、农药、化工等行业，这些废水对环境照成极大的污染。基于氰化物的特殊性，许多国家的环保部门制定了严格的水体氰化物排放标准，如美国环保署(USEPA)提议饮用水和生态水体中氰化物的最高质量浓度分别为0.05mg/L和0.2mg/L。我国环境保护部和国家质量监督检验检疫总局于2012年6月27日颁布的《炼焦化学工业污染物排放标准》规定独立焦化企业废水总排放口或钢铁联合企业焦化分厂废水排放口的氰化物出水排放标准为0.2mg/L，而且监测的氰化物不只是简单的无机氰化物，0.2mg/L的排放标准指的是总氰化物。

鉴于此，克服以上现有技术中的缺陷，提供一种新的氰类化合物降解方法成为本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的上述缺陷，提供一种氰类化合物降解菌、以及上述降解菌的应用。

本发明的目的可通过以下的技术措施来实现：

本发明第一方面提供了一种氰类化合物降解菌，与现有技术相比，其不同之处在于，该降解菌为根癌农杆菌(Agrobacteriumsp.)TQH6菌株，以保藏号CCTCCNO:M2015613保藏。

优选地，所述降解菌的16SrRNA基因序列为SEQIDNo.1。

优选地，所述氰类化合物为无机氰CN^-、铁氰化物或乙腈。

本发明第二方面还提供了上述的保藏号为CCTCCNO:M2015613的氰类化合物降解菌的生物学纯培养物。

本发明第三方面还提供了一种氰类化合物的降解方法，使上述的降解菌与氰类化合物接触，降解氰类化合物。

优选地，所述降解菌与氰类化合物的接触在28～35℃的范围内进行。

优选地，所述降解菌与氰类化合物的接触在pH7.0～8.0的范围内进行。

优选地，所述降解菌与氰类化合物的接触在以氰类化合物为唯一氮源的培养基中进行。

优选地，所述降解菌与氰类化合物的接触在含氰焦化废水中进行。

本发明第四方面还提供了上述的降解菌或上述的纯培养物在氰类化合物降解中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于，本发明的氰类化合物降解菌能够高效降解氰类化合物，对氰类化合物的耐受力强，适合应用于含氰焦化废水的生物处理。

附图说明

图1是本发明实施例2中TQH6菌株对氰化钾的降解变化图。

图2是本发明实施例3中TQH6菌株对铁氰化钾的降解变化图。

图3是本发明实施例4中TQH6菌株对乙腈的降解变化图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供了一种氰类化合物降解菌，该降解菌为根癌农杆菌(Agrobacteriumsp.)TQH6菌株，所述菌株的保藏号为CCTCCNO:M2015613，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2015年10月19日。

进一步地，所述菌株鉴定特征如下：细胞呈杆状，菌落乳白色、隆起、边缘光滑齐整，菌株的最适生长条件为：pH7.0，温度30℃。

所述氰类化合物为无机氰CN^-、铁氰化物或乙腈。

本发明实施例提供的细菌的纯培养物为上述菌株的纯培养物或培养物浓缩物或发酵液，可以是上述菌株在固体培养基表面形成纯培养物，例如：平板固体培养基或斜面固体培养基上形成的菌落，也可以是上述菌株在液体培养基(发酵培养液)中发酵培养后经过离心分离所得的细菌悬液，还可以是上述菌株在液体培养基(发酵培养液)中生长发酵形成的发酵液。

其中，术语“发酵培养液”是指液体培养基；术语“发酵液”是指菌株在液体培养基中发酵培养一段时间后所形成的液体(包括了培养液)；术语“细菌悬液”是发酵液经过离心处理后收集沉淀(菌株培养物或菌体)，将沉淀溶于水或缓冲液中，经过震荡或吹打使得沉淀状的菌株培养物悬浮起来所形成的均一的悬浊液。

具体地，本发明所提供的根癌农杆菌TQH6菌株的培养方法包括：将根癌农杆菌TQH6菌株置于培养基中，

TQH6菌株的培养基成分为(g/L)：10g葡萄糖、0.9gKH₂PO₄、6.5gNa₂HPO₄·12H₂O、铁氰化钾(总氰浓度10mg/L)每1L培养基加入1mL微量元素溶液(微量元素溶液配制：1gFeSO₄·7H₂O，1gMnSO₄·H₂O，0.25gNa₂MoO₄·2H₂O，0.1gH₃BO₄，0.25gCuCl₂·2H₂O，0.25gZnCl₂，0.25gCo(NO₃)₂·6H₂O，0.1gNiSO₄·6H₂O，溶解于900mL蒸馏水中，加5mL浓H₂SO₄，补蒸馏水至1000mL)；铁氰化钾过滤灭菌，待无机盐培养基高温高压灭菌后加入，终浓度按总氰计最初为10mg/L。

TQH6菌株可以高效降解氰化物，在纯培养基中以氰化钾作为唯一氮源时(按总氰浓度计5mg/L)，TQH6菌株在36h内降解率可以达到93％；若以铁氰化钾作为唯一氮源时(总氰浓度20mg/L)，TQH6菌株在36h内降解率为97.75％；若以乙腈为唯一氮源(总氰浓度为10mg/L)，TQH6菌株在36h内降解率为96.4％。

本发明实施例提供的氰类化合物的降解方法，使上述的降解菌与氰类化合物接触，降解氰类化合物。

在一个优选实施方式中，所述降解菌与氰类化合物的接触在28～35℃的范围内进行；所述降解菌与氰类化合物的接触在pH7.0～8.0的范围内进行。

在另一个优选实施方式中，所述降解菌与氰类化合物的接触在以氰类化合物为唯一氮源的培养基中进行。

进一步地，上述的TQH6菌株可以接种于含氰焦化废水中，与含氰焦化废水中氰类化合物接触，降解含氰焦化废水中氰类化合物。

本发明的根癌农杆菌TQH6菌株或其纯培养物可以在氰类化合物降解中应用。

例如，本发明的根癌农杆菌TQH6菌株在含氰焦化废水中应用，具体应用方法为将TQH6菌株在LB培养基中，30℃，180R培养12h后将菌体离心，用无菌水将菌体稀释回原来的体积，以体积百分比5％的接种量将菌悬液接入到焦化废水中，30℃，180R培养36h，投加TQH6菌株后，总氰去除效果同比增效55.63％。

实施例1：

TQH6菌株的分离和鉴定

1.TQH6菌株的分离和纯化

TQH6菌株是采用富集培养法从辽宁某焦化厂生化好氧池活性污泥中分离得到。具体步骤如下：用250mL三角瓶，装100mL分离培养基(g/L)10葡萄糖0.9KH₂PO₄，6.5Na₂HPO₄·12H₂O，铁氰化钾(总氰浓度10mg/L)每1L培养基加入1mL微量元素溶液，铁氰化钾过滤灭菌，(待培养基高压灭菌后加入)。微量元素溶液配方(g/L)：1gFeSO₄·7H₂O，1gMnSO₄·H₂O，0.25gNa₂MoO₄·2H₂O，0.1gH₃BO₄，0.25gCuCl₂·2H₂O，0.25gZnCl₂，0.25gCo(NO₃)₂·6H₂O，0.1gNiSO₄·6H₂O，溶解于900mL蒸馏水中，补蒸馏水至1000mL。向培养基中接入5mL从辽宁省某焦化厂采集的生化好氧池活性污泥，于30℃、转速为180r/min的摇床中振荡培养7d，取5mL菌液接种到100mL新培养基中，重复转接4次。总氰初始浓度为10mg/L，以后每次转接浓度增加10mg/L，直到50mg/L为止。

驯化培养好的菌液按10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和10^-7稀释，取0.1mL10^-5稀释液涂在含有50mg/L总氰化物的TQH6分离培养基平板上，30℃倒置培养7d，挑取单菌落，进行3次划线分离纯化，得到纯化的菌株TQH6。

2.TQH6菌株的鉴定

采用16SrRNA基因测序法对TQH6菌株进行分类鉴定，具体步骤如下：

(1)细菌总DNA的制备：用天根公司基因组提取试剂盒提取TQH6菌株的基因组DNA，作为PCR反应的模板。

(2)16SrRNA基因的PCR扩增：扩增引物如下：

第一引物27F：5’—AGAGTTTGATCMTGGCTCAG—3’[M＝C,A](SEQIDNo.2或SEQIDNo.3)；

第二引物1492R：5’—CGGYTACCTTGTTACGACTT—3’[Y＝T,C](SEQIDNo.4或SEQIDNo.5)。

PCR反应体系如表1所示。

表1PCR反应体系

PCR反应条件如下：

(3)PCR产物的纯化、克隆、测序和分析：PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后与pMD18—T载体连接，转化到大肠杆菌DH5α，然后提取重组质粒，测定16SrRNA基因序列(SEQIDNo.1)，将基因序列登录美国国立生物技术信息中心网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，进行核苷酸序列Blast比对，得到与相关菌株的16SrRNA基因序列同源的若干核苷酸序列，结果表明TQH6菌株与根癌农干菌(Agrobacteriumsp)的16SrRNA基因序列的同源性在99％以上，所以分离菌株被鉴定为根癌农干菌(Agrobacteriumsp)。

实施例2：

以氰化钾作为唯一氮源时TQH6菌株对总氰化物的降解实验

在pH8.0，温度30℃，氰化钾充当的总氰浓度分别为1mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L，10mg/L将TQH6菌株的培养物接种于100mL上述以氰化钾作为唯一氮源的培养基中，180r/min振荡培养每隔6h取一次样，用国标法(HJ484-2009)测定培养基中总氰浓度，数据见图1。由图1可见，TQH6在总氰初始浓度低于10mg/L(含10mg/L)时可以有效的将其降解，降解率大于99％。初始浓度为11mg/L时TQH6失去对其的降解能力。由图1的数据可以看出，TQH6由氰化钾充当的总氰最大耐受浓度为10mg/L，其中当初始浓度为5mg/L时，TQH6可以在36h对其降解率达到93％，复合实际废水的处理时间。

实施例3：

以铁氰化钾作为唯一氮源时TQH6菌株对总氰化物的降解实验

在pH7.0，温度30℃，铁氰化钾充当的总氰浓度分别为10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L将TQH6菌株的培养物接种于100mL上述以铁氰化钾作为唯一氮源的培养基中，180r/min振荡培养每隔6h取一次样，用国标法(HJ484-2009)测定培养基中总氰浓度，数据见图2。由图2可见，TQH6在总氰初始浓度低于50mg/L(含50mg/L)时可以有效的将其降解，降解率大于99％。初始浓度为60mg/L时TQH6失去对其的降解能力。由图2的数据可以看出，TQH6由铁氰化钾充当的总氰最大耐受浓度为50mg/L，其中当初始浓度为20mg/L时，TQH6可以在36h对其降解率达到97.75％，复合实际废水的处理时间。

实施例4：

以乙腈作为唯一氮源时TQH6菌株对总氰化物的降解实验

在pH7.0，温度30℃，乙腈充当的总氰浓度分别为5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L将TQH6菌株的培养物接种于100mL上述以乙腈作为唯一氮源的培养基中，180r/min振荡培养每隔6h取一次样，用国标法(HJ484-2009)测定培养基中总氰浓度，数据见图3。由图3可见，TQH6在总氰初始浓度低于25mg/L(含25mg/L)时可以有效的将其降解，降解率大于99％。初始浓度为30mg/L时TQH6失去对其的降解能力。由图3的数据可以看出，TQH6由乙腈充当的总氰最大耐受浓度为25mg/L，其中当初始浓度为10mg/L时，TQH6可以在36h对其降解率达到96.4％，复合实际废水的处理时间。

实施例5：

TQH6菌株对含氰焦化废水中氰类化合物的降解实验

将TQH6用LB培养基活化12h后，将其菌体离心用无菌水稀释回原来倍数，作为菌悬液。利用辽宁某焦化厂的生化系统中耗氧池活性污泥，及厌氧池出水进行实际水模拟实验。将取回的生化池泥水混合物混均后取100mL装进250mL三角瓶中，30℃，180R培养36h。一共培养6组3个空白对照处理组；3个投加TQH6处理组。培养36h后取出污泥在用厌氧出水培养，每36h换一次水，总氰数据如表2所示，从表中数据可以看出，投加TQH6菌后，总氰去除效果同比增效55.63％

表2总氰浓度变化表

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种氰类化合物降解菌，其特征在于，该降解菌为根癌农杆菌(Agrobacteriumsp.)TQH6菌株，以保藏号CCTCCM2015613保藏。

2.根据权利要求1所述的氰类化合物降解菌，其特征在于，所述降解菌的16SrRNA基因序列为SEQIDNo.1。

3.根据权利要求1所述的氰类化合物降解菌，其特征在于，所述氰类化合物为无机氰CN^-、铁氰化物或乙腈。

4.权利要求1所述的保藏号为CCTCCM2015613的氰类化合物降解菌的生物学纯培养物。

5.一种氰类化合物的降解方法，其特征在于，使权利要求1或2所述的降解菌与氰类化合物接触，降解氰类化合物。

6.根据权利要求5所述的氰类化合物的降解方法，其特征在于，所述降解菌与氰类化合物的接触在28～35℃的范围内进行。

7.根据权利要求5所述的氰类化合物的降解方法，其特征在于，所述降解菌与氰类化合物的接触在pH7.0～8.0的范围内进行。

8.根据权利要求5至7任一项所述的氰类化合物的降解方法，其特征在于，所述降解菌与氰类化合物的接触在以氰类化合物为唯一氮源的培养基中进行。

9.根据权利要求5至7任一项所述的氰类化合物的降解方法，其特征在于，所述降解菌与氰类化合物的接触在含氰焦化废水中进行。

10.权利要求1至3任一项所述的降解菌或权利要求4所述的纯培养物在氰类化合物降解中的用途。