CN1070686A

CN1070686A - 制备酰胺的方法

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Publication number: CN1070686A
Application number: CN92110448A
Authority: CN
Inventors: 森本裕纪; 宫坂清幸; 指田玲子; 寺西丰; 落合正则; 山田和德; 森哲子
Original assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Current assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Priority date: 1991-08-05
Filing date: 1992-08-05
Publication date: 1993-04-07
Also published as: EP0530522A3; AU2077392A; EP0530522A2

Abstract

一种由腈制备酰胺的方法，该方法利用的微生物属于克雷白杆菌属(klebsiella)、产气单孢菌属 (Aeromonas)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)、黄色杆菌属(Xanthobacter)，欧文菌属(Erwinia)、肠杆菌属(Enterobacter)或链霉菌属(Streptomyces)中的一属并有把腈转化为酰胺的能力。本方法能够得到工业上有用的、高纯度的酰胺。

Description

本发明涉及一种利用微生物水合作用把腈转化为相应酰胺的方法，尤其是，涉及一种以使用微生物为特征的生物法制备酰胺的方法。

在此以前，工业上已经利用化学方法如硫酸法或铜催化法来制备以相应的腈为起始物的酰胺。近来，也报导了一种利用微生物产生的酶来制备酰胺的方法。利用微生物方法的优点在于ⅰ）起始物质和终产物几乎不发生聚合作用，ⅱ）副产物比较少，ⅲ）反应设备可以比较小，等等，这些是因为使用了相对缓和的反应条件。具有酶活性的、能够在水存在下由腈产生酰胺的微生物包括革兰氏阳性菌[日本专利公开号21，519/1987（Kokoku）]，尤其是棒杆状的细菌[例如：节杆菌（Arthrobacter）、红色杆菌（Rhodococcus）、和棒状杆菌（Corynebacterium），日本专利公开号17，918/1981（Kokoku）、2，693/1984（Kokai）、162，193/1986（Kokai）和91，189/1987（Kokai）]和真菌[镰刀菌（Fusarium），日本专利公开号86，889/1989（Kokoku）]。在革兰氏阴性菌中，仅有假单孢菌（Pseudomonas）被报导是有酶活性的微生物[日本专利公开号37，951/1984（kokoku）]。

微生物大致分为真核生物（担子菌（Basidiomycetes）、丝状真菌、酵母等）和原核生物（细菌、蓝藻（Cyanophyceae）、放线菌（Actinomycetes）等）。按细胞壁的结构，细菌进一步分为革兰氏阳性菌（棒杆菌、芽孢杆菌（Bacillus）、葡萄球菌（Staphylococcus）、乳酸菌、醋酸菌、放线菌（Actinomycetes）等）和革兰氏阴性菌（肠杆菌（Enterobacter）、假单胞菌（Pseudomonas）、弧菌（Vibrio）等），人们认为，它们是相互完全不同的分类。

人们进一步认识到在原核微生物中，放线菌（Actinomycetes）形成独特的一类而不同于其它菌，这是因为ⅰ）尽管未成熟，但它们在形态上已发展成气生菌丝和基体菌丝，并且，细胞组织的差异，如孢子细胞的形态差异也能被观察到;ⅱ）作为化学和分类上的特征，大多数放线菌的DNA中GC含量为62-79%，此值高于其它菌;ⅲ）基于5SrRNA碱基顺序的系统发育位置位于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌间的中部[Zukai Biseibutu Hand Book，Maruzen（1990）;Japan Actinomycetes Society Bulletin（1985）]。按Bergey's Manual of Systematic Bacteriology，Vol.4（1984）的记载，放线菌有五十多个属，它们以气生菌丝、基体菌丝和孢子形式为特征来进行分类。

本发明根据广泛地筛选土壤中的微生物的结果证实，最近发现的属于克雷白杆菌、产气单孢菌、柠檬酸细菌、土壤杆菌、根瘤菌、黄色杆菌、欧文菌、肠杆菌或链霉菌各属的微生物具有把腈转化为酰胺的能力，由此建立了用所述微生物来制备酰胺的新方法。

因此本发明提供了靠微生物作用而从腈制备酰胺的方法，其特征在于所述的微生物属于克雷白杆菌、产气单孢菌、柠檬酸细菌、土壤杆菌、根瘤菌、黄色杆菌、欧文菌、肠杆菌或链霉菌各属中一种微生物并且具有转化腈为酰胺的能力。

根据以下的描述，本发明方法通过利用属于克雷白杆菌、产气单孢菌、柠檬酸细菌、土壤杆菌、根瘤菌、黄色杆菌、欧文菌、肠杆菌或链霉菌各属中的一种微生物，能够从腈获得在工业上有用的、高纯度的酰胺。

本发明中用作起始物质的腈包括：

-简单的腈，例如乙腈、丙腈、正-丁腈和异丁腈;

-α-氨基腈，例如 α-氨基丙腈，α-氨甲基硫腈、α-氨基丁腈和氨基乙腈;

-α-羟基腈，例如乳腈、羟基乙腈和α-羟基-γ-甲硫基丁腈;

-β-氨基腈，例如氨基-3-丙腈;

-二腈，例如丙二腈、琥珀腈和己二腈;

-α-不饱和腈，例如丙烯腈和甲基丙烯腈;

-α-苯腈，例如高藜芦腈和苯腈;

-杂环腈，例如烟酰腈和异烟酰腈。

在这些腈中，优选碳原子数为2到4的腈，如乙腈、丙腈、丙烯腈、甲基丙烯腈、正-丁腈、和异丁腈，特别优选的是丙烯腈。

由上述腈形成的酰胺是和该腈相对应的，例如，乙腈形成乙酰胺，丙腈形成丙酰胺、丙烯腈形成丙烯酰胺。

以下描述的是用于本发明中的微生物。

如果属于一个属，该属选自由克雷白杆菌、产气单孢菌、柠檬酸细菌、土壤杆菌、根瘤菌、黄色杆菌、欧文菌、肠杆菌和链霉菌各属构成的种群，如果该属具有能水合腈并转化其为酰胺的能力，那么用于本发明的微生物不限于特定的菌。这些微生物的例子为克雷白杆菌种MCI 2609（以后可简写为“MCI 2609菌株”）;产气单孢菌种MCI 2614（后面可简称为“MCI 2614菌株”）;弗氏柠檬酸菌MCI 2615（后面可简称为“MCI 2615菌株”）;根瘤菌种MCI 2610（后面可简称为“MCI 2610菌株”）;根瘤菌种MCI 2643（后面可简称为“MCI 2643菌株”）;发根病土壤杆菌IAM 13570（后面可简称为“IAM 13570菌株”）;根癌病土壤杆菌IAM 13129（后面可简称为“IAM 13129菌株”）;根瘤菌种IAM 13588（后面可简称为“IAM 13588菌株”）;豌豆根瘤菌IAM 12609（后面可简称为“IAM 12609菌株”）;苜蓿根瘤菌IAM 12611（后面可简称为“IAM 12611 菌株”）;黄色菌（Xanthobacter flavus）JCM 1204（后面可简称为“JCM 1204 菌株”）;Erwinianigrifluens MAFF 03-01435（以后可简称为“MAFF 03-01435菌株”）;肠杆菌 MCI 2707（以后可简称为“MCI 2707菌株”）;链霉菌MCI 2691（以后可简称为“MCI 2691菌株”）。按布达斯条约这些菌株存放在发酵研究所，工业科学和技术公司，1-3，Higashi 1 Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305.日本，见下表。

菌株登记号贮存日期

克雷白杆菌种

MCI 2609 FERM BP-

产气单孢菌种

MCI 2614 FERM BP-

弗氏柠檬酸菌

MCI 2615 FERM BP-

根瘤菌种

MCI 2610 FERM BP-

根瘤菌种

MCI 2643 FERM BP-

发根病土壤杆菌

IAM 13570 FERM BP-

根癌病土壤杆菌

IAM 13129 FERM BP-

Rhizobium loti

IAM 13588 FERM BP-

豌豆根瘤菌

IAM 12609 FERM BP-

菌株登记号贮存日期

苜蓿根瘤菌

IAM 12611 FERM BP-

Xanthobacter flavus

JCM 1204 FERM BP-

Erwinia nigrifluens

MAFF 03-01435 FERM BP-

肠杆菌种

MCI 2707 FERM BP-

链霉菌种

MCI 2691 FERM BP-

在上述菌株中，MCI 2609、MCI 2614、MCI 2615、MCI 2610、MCI 2643、MCI 2707和MCI 2691是由本发明者从自然土壤中分离出来的菌株，下面是这些菌株细菌学上的特征。

A.克雷白杆菌种MCI 2609

a）形态上的特征

在热浸琼脂介质、30℃下培养三天。

1）细胞的形状和大小：杆状

2）细胞的多形性：无

3）运动性：无

4）孢子形成：无

5）革兰氏染色：阴性

6）耐酸性染色：阴性

b）培养特征

在热浸琼脂介质、30℃下培养三天后的菌落特征列在下面。

1）形状：圆形

2）纵剖面：凸形

3）表面：平滑

4）光泽：有光泽

5）颜色：灰黄色

6）光学特征：不透明

7）边缘：边缘完整

c）生理特征

1）好气生长：+

2）厌氧生长：+

3）过氧化氢酶：+

4）氧化酶;-

5）O-F试验;F

6）明胶的水解：-

7）石蕊牛乳：酸性，凝结的

8）硝酸盐的还原：+

9）反硝化作用：+

10）甲基红试验：-

11）VP试验：+

12）吲哚的形成：-

13）H₂S的形成：-

14）淀粉水解：-

15）柠檬酸盐的利用：+

（霞磷石英介质）

16）无机氮源的利用：

NH₄：+

NO₃：+

17）尿酶：+

18）赖氨酸的脱羧作用：+

19）乌氨酸的脱羧作用：-

20）脱氧核糖核酸酶：-

21）IPA反应：-

22）色素的形成：-

23）生长温度范围：10-45℃

24）生长PH范围：4-10

25）来自一种碳源的酸和气体的形成：

碳源酸气体

1 L-阿拉伯糖 + +

2 D-木糖 + +

3 D-葡萄糖 + +

4 D-甘露糖 + +

5 D-果糖 + +

6 D-半乳糖 + +

7 麦芽糖 + +

8 蔗糖 + +

9 乳糖 + +

10 海藻糖 + +

11 D-山梨醇 + +

12 D-甘露糖醇 + +

13 甘油 + +

14 淀粉 + +

d）化学分类

DNA中GC含量：59%

e）分类学研究

1）科级鉴定

MCI 2609菌株的特征ⅰ）革兰氏阴性杆菌，ⅱ）兼性厌氧，ⅲ）利用葡萄糖，ⅳ）氧化酶阴性等，因此该菌株属于兼性厌氧革兰氏阴性杆菌类型中的肠杆菌科（Enterobacteriacae），其记载在Bergey's Manual of Systematic Bacteriology，VoL.1，和Cowan与Steel的Manual for the Identification of Medical Bacteria，第二版（1974）。

2）属和种级鉴定

MCI 2609菌株和属于肠杆菌科的其它菌[医药细菌鉴定手册（Manual for the Identification of Medical Bacteria），第二版]比较显示出该菌株有下列特征：ⅴ）无运动性;ⅵ）VP试验显阳性;ⅶ）利用柠檬酸盐并且是尿酶阳性;ⅷ）未脱碳酸气的乌氨酸;ⅸ）未脱碳酸气的赖氨酸;ⅹ）能利用肌醇等。结果发现该菌株属于克雷白杆菌属。

而且，该菌株DNA中GC含量为59%，此值和克雷白杆菌的含量（53-59%）相一致。

B.产气单孢菌种MCI 2614

a）形态特征

在热浸琼脂介质、30℃下培养三天。

1）细胞形状和大小：杆状

2）细胞的多形性：无

3）运动性：可运动，极生鞭毛

4）孢子形成：无

5）革兰氏染色：阴性

6）耐酸性染色：阴性

b）培养特征

在热浸琼脂介质、30℃下培养三天后的菌落特征列在下面。

1）形状：圆形

2）纵剖面：凸形

3）表面：平滑

4）光泽：有光泽

5）颜色：黄偏灰

6）光学特性：不透明

7）边缘：边缘完整

c）生理特征

1）好气生长：+

2）厌气生长：+

3）过氧化氢酶：+

4）氧化酶：+

5）O-F试验：F

6）明胶的水解：+

7）石蕊乳：酸性，凝结的并胨化

8）硝酸盐的还原：+

9）反硝化作用：+

10）甲基红试验：-

11）VP试验：+

12）吲哚的形成：+

13）H₂S的形成：-

14）淀粉水解：+

15）利用柠檬酸盐（Christensen介质）：+

16）无机氮源的利用 NH₄：+

NO₃：±

17）尿酶：+

18）赖氨酸的脱羧作用：-

19）乌氨酸的脱羧作用：-

20）脱氧核糖核酸酶：+

21）IPA反应：-

22）色素的形成：-

23）生长温度范围：4-40℃

24）生长PH范围：5-10

25）来自一种碳源的酸和气体的形成：

碳源酸气体

1 L-阿拉伯糖 + -

2 D-木糖 - -

3 D-葡萄糖 + +

4 D-甘露糖 + -

5 D-果糖 + ±

6 D-半乳糖 + +

7 麦芽糖 + -

8 蔗糖 + -

9 乳糖 - -

10 海藻糖 + -

11 D-山梨醇 ± -

12 D-甘露糖醇 + -

13 甘油 + -

14 淀粉 + -

d）化学分类

DNA中GC含量：62%

e）分类学研究

1）科级鉴定

MCI 2614菌株的特征为ⅰ）革兰氏阴性杆菌;ⅱ）兼性厌氧;ⅲ）利用葡萄糖;ⅳ）氧化酶阳性;ⅴ）有极生鞭毛等;因此该菌株属于于兼性厌氧革兰氏阴性杆菌群的弧菌科（Vibrionacae），其记载在Bergey's Manual of Systematic Bacteriology第一卷和Cowan与Steel的Manual for the Identification of Medical Bacteria第二版（1974）。

2）属和种级鉴定

MCI 2614菌株和属于弧菌科中产气单孢菌属、Plesiomonas和弧菌属的其它菌[T.Itoh，Medical Technology第十二卷，P799（1984）]相比较。如下表所显示的，该菌株的特征和产气单孢菌属的特征一致，因此，该菌株鉴定为产气单孢菌种。

而且该菌株DNA中GC含量为62%，此值和产气单孢菌的该含量（58-62%）相一致。

MCI 2614 亲水产气 Aeromonas Plesiomonas 霍乱

单孢菌 sorbria shiqelloides 弧菌

TSI 琼脂

LIM 琼脂

斜面培养黄色黄色黄色红色黄色

(红色) (红色) (红色)

穿刺黄色黄色黄色黄色黄色

气体 + + + - -

硫化氢 - - - - -

赖氨酸 - - - + +

吲哚 + d d + +

运动性 + + + + +

氧化酶 + + + + +

肌醇 - - - + -

甘露糖醇 + + + - +

VP 试验 + + d - d

乌氨酸脱羧作用 - - - d +

精氨酸水解 + d d + -

DNA 中 GC 含量 62% 58-62% 58-60% 51% 47-49%

d 表示利用能力在种与种之间是不同的。

c.弗氏柠檬酸菌MCI 2615

a）形态特征

在热浸琼脂介质30℃下培养三天。

1）细胞的形状和大小：杆状

2）细胞的多形性：无

3）运动性：可运动的，周生鞭毛

4）孢子形成：无

5）革兰氏染色：阴性

6）耐酸性染色：阴性

b）培养特征

在热浸琼脂介质、30℃下培养三天后菌落的特征列在下面。

1）形状：圆形

2）纵剖面：凸形

3）表面：平滑

4）光泽：有光泽

5）颜色：黄偏灰

6）光学特征：不透明

7）边缘：波状的

c）生理特征

1）好氧生长：+

2）厌氧生长：+

3）过氧化氢酶：+

4）氧化酶：-

5）O-F试验：F

6）明胶水解：-

7）石蕊乳：酸性

8）硝酸盐的还原：+

9）反硝化作用：+

10）甲基红试验：-

11）VP试验：-

12）吲哚的形成：-

13）H₂S的形成：+

14）淀粉水解：-

15）柠檬酸盐的利用：+

（Christensen介质）

16）无机氮源的利用：

NH₄：+

NO₃：-

17）尿酶：+

18）赖氨酸的脱羧作用：-

19）乌氨酸的脱羧作用：-

20）脱氧核糖核酸酶：-

21）IPA反应：-

22）色素的形成：-

23）生长温度范围：10-45℃

24）生长PH范围：4-10

25）来自一种碳源的酸和气体的形成：

碳源酸气体

1 L-阿拉伯糖 + +

2 D-木糖 + +

3 D-葡萄糖 + +

4 D-甘露糖 + +

5 D-果糖 + +

6 D-半乳糖 + -

7 麦芽糖 + +

8 蔗糖 + +

9 乳糖 + +

10 海藻糖 + +

11 D-山梨醇 + +

12 D-甘露糖醇 + +

13 甘油 + +

14 淀粉 ± -

d）化学分类

DNA中GC含量：52%

e）分类学研究

1）科级鉴定

MCI 2615菌株的特征为ⅰ）革兰氏阴性杆菌，ⅱ）兼性厌氧，ⅲ）利用葡萄糖，ⅳ）氧化酶阴性等，因此该菌株属于兼性厌氧革兰氏阴性杆菌群中的肠杆菌科（Enterobacteriacae），其记载在Bergey's Manual of Systematic Bacteriology第1卷和Cowan与Steel的Manual for the Identification of Medical Bacteria第二版（1974）。

2）属和种级鉴定

MCI 2615菌株和属于肠杆菌科并能形成硫化氢的其它菌进行比较[Cowan和Steel，Manual for the Identification of Medical Bacteria第二版（1974）以及The Prokaryotes第2卷]。如下表所示，除了利用肌醇，该菌株的特征显示出与弗氏柠檬酸菌属的特征相当的一致。利用肌醇的区别被认为是因为种内的变化，因此，该菌株鉴定为弗氏柠檬酸菌属。

另外，该菌株DNA中GC含量为52%，此值与弗氏柠檬酸菌的值（50-53%）相一致。

MCI 2615 弗氏柠沙门氏变形

檬酸菌杆菌属杆菌属

硫化氢 + + + +

吲哚 - - - d

乌氨酸的脱羧作用 - - + d

赖氨酸的脱羧作用 - - + -

尿酶 + d - +

明胶的液化 - - - +

利用柠檬酸盐 + + d d

乳糖 + + - -

D-甘露糖醇 + + + -

D-甘露糖 + + + -

L-鼠李糖 + + + -

肌醇 + - - -

DNA 中 GC 含量 52% 50-53% 50-53% 38-41%

d 表明该利用能力在种间不同。

D.根瘤菌种MCI 2610和MCI 2643

a）形态特征

在普通琼脂介质、30℃下培养三天。

MCI 2610 MCI 2643

1)细胞的形状和大小 : 杆状杆状

2)细胞的多形性 : 无无

3)运动性 : 可运动, 可运动,

周生鞭毛周生鞭毛

4)孢子形成 : 无无

5)革兰氏染色 : 阴性阴性

6)耐酸性染色 : 阴性阴性

b）培养特征

在普通琼脂介质、30℃下培养三天后菌落的特征列于下表。

MCI 2610 MCI 2643

1)形状 : 圆形圆形

2)纵剖面 : 凸形凸形

3)表面 : 平滑平滑

4)光泽 : 有光泽有光泽

5)颜色 : 黄偏白黄偏白

6)光学特性 : 不透明不透明

7)边缘 : 边缘完整边缘完整

8)粘性 : 有点粘粘

c）生理特征

MCI 2610 MCI 2643

1)好气生长 : + +

2)厌气生长 : - -

3)过氧化氢酶 : + +

4)氧化酶 : + +

5)O-F 试验 : 0 0

6)明胶水解 : - -

7)石蕊乳 : 不变不变

8)硝酸盐的还原 : + +

9)反硝化作用 : ± +

10)甲基红试验 : - +

11)VP 试验 : - -

12)吲哚的形成 : - -

13)H₂S的形成 : - -

14)淀粉水解 : - -

15)利用柠檬酸盐 : - -

(Christensen介质)

16)无机氮源的利用 :

NH₄: + +

NO₃: - +

17)尿酶 : + +

18)赖氨酸的脱羧作用 : ± ±

19)乌氨酸的脱羧作用 : + +

20)精氨酸的脱羧作用 : - -

21)脱氧核糖核酸酶 : - -

22)磷酸酯酶 : + +

23)酪氨酸的分解 : + +

24)几丁质的分解 : - -

25)吐温80的分解 : - -

26)3-内缩乳糖的形成 : - -

27)色素的形成 : 棕色色素 -

28)生长温度范围 : 10-40℃ 10-40℃

29)生长PH范围 : 5-10 5-10

30)耐NaCl性 : 在2%生长在2%生长

31)来自一种碳源的(培养二星期)酸的形成:

碳源 MCI 2610 MCI 2643

1 L-阿拉伯糖 + +

2 D-木糖 + +

3 D-葡萄糖 + +

4 D-甘露糖 + +

5 D-果糖 + +

6 D-半乳糖 + +

7 麦芽糖 + +

8 蔗糖 + +

9 乳糖 - +

10 海藻糖 + +

11 D-山梨醇 + +

12 D-甘露糖醇 + +

13 甘油 + +

14 淀粉 - -

15 纤维二糖 + ±

16 L-鼠李糖 + +

17 棉子糖 - -

18 松三糖 - -

19 核糖醇 - ±

20 半乳糖醇 - -

21 赤藓醇 + +

22 水杨苷 + -

23 乙醇 - +

32)利用有机酸(培养两星期):

有机酸 MCI 2610 MCI 2643

1 醋酸 + -

2 苯甲酸 - -

3 柠檬酸 +late +

4 丙二酸 - +

5 丙酸 - -

6 丙酮酸 + +

7 L-琥珀酸 - +

8 苹果酸 - +

9 葡萄糖酸 - -

10 己二酸 - -

d)化学分类

MCI 2610 MCI 2643

1) DNA 中 GC 含量 : 66% 63%

2) 辅酶Q : 0-10 0-10

3) 在细胞体中的脂肪酸: C_18:1C_18:1

30H-C_14:030H-C_14:0

30H-C_16:030H-C_16:0

30H-C_18:030H-C_18:0

e）MCI 2610菌株的分类学研究

1）科级鉴定

MCI 2610菌株为好气、革兰氏阴性杆菌，在细胞中缺少内生孢子，有少量周生鞭毛，能利用许多糖，可产生细胞外多糖。

化学分类的结果揭示了该菌株有（66%的）高GC含量并有辅酶Q-10的醌体系。因此，该菌株在直链中富含脂肪酸组分并且是C_18∶1的脂肪酸，作为羟基脂肪酸其主要含有30H-C_14∶00脂肪酸，而且不含2-羟基脂肪酸。根据MCI 2610菌株的这些细菌学特征，证明该菌株属于根瘤菌科，其记载在Bergey's Manual of Systematic Bacteriology第一版，P 234（1984）。

2）属级鉴定

按照Bergey's Manual of Systematic Bacteriology第一版，P234-256（1984）中的记载，根瘤菌科含有四个属：根瘤菌属、Bradyrhizobium、土壤杆菌属和Phyllobacterium，这些属由下列特征进行鉴定：

根瘤菌属 Bradyrhi 土壤杆菌属 Phyllobac MCI 2610

zobium terium

鞭毛的位置极生或周生极生周生极生周生

根瘤的形成 + + - - /

叶上没食子

的形成 - - - + /

固氮酶 + + - - /

宿主营养过度 - - + - /

3-内缩乳糖 - - ± -

在YMA上快速生长 + - + + +

糖的碱化 - + - - -

H₂S的形成 ± - - / -

生物素的需求 + + - / -

细胞外多糖β-2-

束缚葡聚糖 + + + / /

GC含量

(mol%) 59-64 61-65 57-63 60-61 66

MCI 2610菌株的特征和四个属的特征相比较显示出该菌株接近于根瘤菌属、土壤杆菌属或Bradyrhizobium。但是，正如下面所描述的，和MCI 2610菌株特征最一致的属并不在根瘤菌科的属中。MCI 2610菌株有66%高的GC含量，此值不同于根瘤菌属（59-64%）和土壤杆菌属（57-63%）的含量，而更接近于Bradyrhizobium（61-65%）的含量。但因本菌株有周生鞭毛并且是能在不述的YMA培养基中快速生长的菌，所以该菌株是不同于属于Bradyrhizobium的菌。Bradyrhizobium的菌有极生鞭毛并有在YMA培养基中生长缓慢的特征。

接下来进行的是在细胞体中为一组脂肪酸的羟基脂肪酸的比较。羟基脂肪酸被认为是分类和鉴定革兰氏阴性菌特别有效的指示剂。按照发酵研究所，Osaka Research Communication 15卷，PP.57-75（1991）的记载，属于根瘤菌科的菌表现出种或亚种的羟基脂肪酸的特征性结构，除了它们普遍存在30H-C_14∶0脂肪酸外，基于羟基脂肪酸的组成，它们被分成九个组。下表所示的就是本菌株的脂肪酸结构与该九组的比较。从比较发现本菌株有以下特征：ⅰ）不含2-羟基脂肪酸，ⅱ）含少量的30H-C_18∶0和30H-C_16∶0脂肪酸。因此，本菌株的结构近似于苜蓿根瘤细菌（R.meliloti）、R.fredii和R.galegae，而不同于土壤杆菌的结构。

上述结果表示，有理由认为本MCI 2610菌株属于根瘤菌属，由此，本菌株鉴定为根瘤菌种。

根瘤菌科中种的不同特征组属或种 3-内缩乳 2-OH 3-OH 3-OH 3-OH 3-OH 3-OH 3-OH

糖的形成脂肪酸 12:00 i- i- ai- 16:0 18:0

13:0 15:0 15:0

1 Bradyrhizobium - - + - - - - -

2 R.lequminosarum - - - - - + + +

3 R.meliloti and

R.fredii - - - - - - ± +

4 R.galegae - - - - - - + +

5 R.loti - - + + - - + +

6 Agrobacterium

biovar 1 + - - - - - + -

7 Agrobacterium

biovar 2 - + - - + - + +

8 Agrobacterium

biovar 3 - + - - - - + +

9 A.rubi - - - - - - + -

MCI 2610 - - - - - - + +

f）MCI 2643菌株的分类研究

1）科级鉴定

MCI 2643菌株是好气的革兰氏阴性杆菌，细胞中缺少内生孢子并有少量周生鞭毛，能利用许多糖，并产生细胞外多糖。

化学分类揭示该菌株有63%的高GC含量和辅酶Q-10的醌体系，而且该菌株在真链中富含脂肪酸组分和C_18∶1的脂肪酸，作为羟基脂肪酸主要含有30H-C_14∶00脂肪酸，并不含2-羟基脂肪酸。从MCI 2643菌株的细胞学特征发现，该菌株和MCI 2610菌株一样属于根瘤菌科。

2）属级鉴定

下面进行在细胞体中为一组脂肪酸的羟基脂肪酸的比较。羟基脂肪酸被认为是分类和鉴定革兰氏阴性菌特别有效的指示剂。按照发酵研究所（Institute for fermentation），Osaka Research Communication 15卷，PP.57-75（1991）的记载，属于根瘤菌科的菌显示出种或亚种的羟基脂肪酸特征性结构，除了普遍存在30H-C_14∶0脂肪酸，基于羟基脂肪酸的组成，它们分成九个组。因此下表表示的是本菌株的脂肪酸结构与九个组的比较。从比较中发现，本菌株有下列特征：ⅰ）不含2-羟基脂肪酸，ⅱ）含少量的30H-C_18∶0和30H-C_16∶0脂肪酸。因此，本菌株的结构近似苜蓿根瘤细菌（R.meliloti）、R.fredii和R.galegae，而不同于土壤杆菌。

上述结果表明，有理由认为该MCI 2643菌株属于根瘤菌属，由此，本菌株鉴定为根瘤菌种。

糖的形成脂肪酸 12:0 i- i- ai- 16:0 18:0

13:0 15:0 15:0

1 Bradyrhizobium - - + - - - - -

2 豌豆根瘤菌属 - - - - - + + +

3 苜蓿根瘤菌属和

R.fredii - - - - - - ± +

4 R.galegae - - - - - - + +

5 R.loti - - + + - - + +

6 肠杆菌属

biovar 1 + - - - - - + -

7 肠杆菌属

biovar 2 - + - - + - + +

8 肠杆菌属

biovar 3 - + - - - - + +

9 A.rubi - - - - - - + -

MCI 2643 - - - - - - + +

E.肠杆菌种MCI 2707

a）形态特征

在普遍琼脂介质、30℃下培养24小时

1）细胞的形态和大小：短杆状

2）细胞的多形性：无

3）运动性：可运动

周生鞭毛

4）孢子形成：无

5）革兰氏染色：阴性

6）耐酸性染色：阴性

b）培养特征

在普通琼脂介质、30℃下培养2天后菌落的特征列于下表。

1）形状：圆形

2）纵剖面：凸形

3）表面：平滑

4）光泽：有光泽

5）颜色：黄偏灰

6）光学特征：不透明

7）边缘：边缘完整

c）生理特征

1）好气生长：+

2）厌氧生长：+

3）过氧化氢酶：+

4）氧化酶：-

5）O-F试验：F

6）明胶水解：-

7）石蕊乳：酸性

不凝结

8）硝酸盐的还原：+

9）反硝化作用：+

10）甲基红试验：-

11）VP试验：+

12）吲哚的形成：-

13）H₂S的形成：-

14）淀粉水解：-

15）柠檬酸盐的利用：+

（Christensen介质）

16）无机氮源的利用：

NH₄：+

NO₃：-

17）尿酶：-

18）赖氨酸的脱羧作用：+

19）乌氨酸的脱羧作用：+

20）精氨酸的水解：-

21）色氨酸脱氨反应：-

22）脱氧核糖核酸酶：-

23）β-半乳糖苷酶：+

24）吐温80的分解：-

25）色素的形成：-

26）生长温度范围：9-45℃

27）生长PH范围：4-10

28）来自一种碳源酸和气体的形成：

碳源酸气体

1 L-阿拉伯糖 + +

2 D-木糖 + +

3 D-葡萄糖 + +

4 D-甘露糖 + +

5 D-果糖 + +

6 D-半乳糖 + +

7 麦芽糖 + +

8 蔗糖 + +

9 乳糖 + +

10 海藻糖 + +

11 D-山梨醇 + +

12 D-甘露糖醇 + +

13 肌醇 + +

14 甘油 + -

15 淀粉 ± -

16 鼠李糖 + +

17 棉子糖 + +

18 蜜二糖 + +

d)化学分类

1)类异戊二烯醌 : 0-8, MK-8

2)DNA 中 GC 含量 : 57 mole %

d）化学分类

1）类异戊二烯醌： 0－8， MK-8

2)DNA中GC 含量： 57 mole %

e）分类学研究

1）族级鉴定

MCI 2707菌株的特征为ⅰ）革兰氏阴性杆菌，ⅱ）兼性厌氧，ⅲ）利用葡萄糖，ⅳ）氧化酶阴性，ⅴ）有周生鞭毛等，因此发现该菌株属于在兼性厌氧革兰氏阴性杆菌群中的肠杆菌科，其记载在Bergey's Manual of Systematic Bacteriology第1卷。

2）属级鉴定

MCI 2707菌株和那些属于肠杆菌科其它属的菌（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology，第1卷）的比较揭示了该菌株有下列特征：ⅰ）可运动，ⅱ）VP试验为阳性，ⅲ）尿酶阴性，ⅳ）乌氨酸除去碳酸，ⅴ）脱氧核糖核酸酶阴性，ⅵ）产生一种来自山梨醇的酸等。结果发现该菌株属于肠杆菌属。

而且在该菌株DNA中的GC含量为57%，此值与肠杆菌属的值（52-60%）相一致。

3）种级鉴定

目前，Bergey's Manual of Systematic Bacteriology第1卷描述了肠杆菌属中的七个种。MCI 2707菌株和这些菌的比较说明该菌株是与Enterobacteraeroqenes更接近的种，结果如下表所示。但是，该菌株DNA中GC含量是57%，不同于E.aeroqenes的值（53-54%）约有3%。下表所示E.sakazakii和E.agglomerans是已知的GC含量为57%的种，但这些种的生理特征显然与本菌株不同，因此，MCI 2707菌株鉴定为肠杆菌种。

MCI 2707菌株和属于肠杆菌属的各菌种的比较数据呈现在下表中。表中的+表示完全阳性，（+）表示多于89%的阳性，d表示10-80%的阳性，-表示完全阴性。

E.clo E.saka E.aqqlo E.aero E.qerq E.inter E.amni MCI

acae zakii merans qenes oviae medium qenus 2707

尿酶 - - - - + - - -

明胶的液化 + (+) (+) d - - - -

氨基酸的脱羧作用

赖氨酸 - - - + + - - +

乌氨酸 + + - + + + + +

精氨酸 + + - - - - + -

酸的产生

山梨醇 + - d + - + d +

蔗糖 + + d + + d d +

棉子糖 (+) + d + + + + +

柠檬酸盐的利用 + + (+) + + + + +

吲哚的形成 - d d - - - - -

黄色素的形成 - + d - - - - -

DNA 中 GC 含量

(mole%) 52-54 57 53-58 53-54 60 60 57

F.链霉菌种MCI 2691

a）形态特征

利用淀粉-无机盐琼脂培养基和酵母浸膏-麦芽浸液琼脂培养基，在27℃时培养细胞14天以形成孢子，随后观察培养进展。菌落的颜色为灰白，基体菌丝延分支伸长，未观察到断裂菌丝。在气生菌丝上形成长链节孢子，大多数孢子链为直线型，也观察到在未端有稍弯曲的少数钩形孢子链。培养物表面为平滑的。

b）培养特征

在定义为ISP（International Streptomyces Project）各种培养基上，于27℃培养14天后MCI 2691菌株的生长特征如下所示。在下面的描述中，G表示生长，RC表示回复颜色，AM表示气生菌丝，SP表示可溶性色素，S表示孢子形成。

1）蔗糖-硝酸盐琼脂介质

G：弱，灰白色

RC：黄白色

AM：弱，粉状，白色

SP：未形成

S：旺盛，直线或似钩状

2）葡萄糖-天门冬酰胺琼脂介质

G：好，灰色

RC：黄灰色

AM：多，粉状，白色

SP：未形成

S：旺盛，直线型

3）甘油-天门冬酰胺琼脂介质（ISP 5）

G：好，黄白色

RC：黄白-淡棕黄色

AM：温和，粉状

SP：未形成

S：未形成

4）淀粉-无机盐琼脂介质（ISP 4）

G：好，白-浅棕灰色

RC：淡棕黄色

AM：旺盛，柔软的，白色

SP：未形成

S：旺盛，直线型

5）酪氨酸琼脂介质（由Okanishi调节）

G：好，淡棕黄色

RC：淡棕黄色

AM：温和，粉状，白色

SP：棕色

S：未形成

6）普通琼脂介质

G：好，淡棕黄

RC：淡棕黄

AM：未形成

SP：未形成

S：未形成

7）酵母浸液-麦芽浸液琼脂介质（ISP 2）

G：好，灰色

RC：淡棕黄色

AM：多，粉状，灰色

SP：未形成

S：旺盛，直线或似钩

8）燕麦琼脂介质（ISP 8）

G：温和，灰色

RC：淡棕色

AM：温和，粉状，白色

SP：未形成

S：旺盛，直线型

9）贝奈特氏琼脂介质

G：好，灰白色

RC：淡棕黄色

AM：多，柔软粉状，白色

SP：未形成

S：温和，直线或似钩状

10）苹果酸钙琼脂介质

G：温和，灰白色

RC：黄白色

AM：温和，粉状，白色

SP：未形成

S：温和，直线型

利用苹果酸钙：阳性

c）生理特征

1）生长温度范围：9-40℃

2）生长PH范围：4-10

3）明胶的液化：+

4）淀粉的水解：+

5）脱脂乳的凝结：-

胨化作用：+

6）类黑色素的形成（在蛋白胨-酵母浸膏-铁琼脂介质，胰蛋白胨-酵母浸膏琼脂介质和酪氨酸琼脂介质）：+

7）硝酸盐的还原：+

8）耐NaCl性：生长在7%

9）碳源的利用：

（在没有添加任何碳源的介质中也观察到有少量生长）。

碳源利用

1 D-葡萄糖 +

2 L-阿拉伯糖 +

3 D-木糖 +

4 D-果糖 +

5 蔗糖 -

6 L-鼠李糖 -

7 棉子糖 -

8 肌醇 ±

9 D-甘露糖醇 -

+：利用、±：可疑性利用

-：不利用

d）细胞体中的组分

在MCI 2691菌株细胞壁中的氨基酸类型确定为细胞壁型Ⅰ，因为在全部细胞体的水解产物中检测出L，L-diaminopimeric酸。此外，在全部细胞体的水解产物中还检出葡萄糖和核糖，但在细胞壁糖组成中未观察到特征性结构。

e）分类学研究

从上述结果发现，该MCI 2691菌株属于链霉菌属。为鉴定其种，可参照ISP中记载的种，有人提出该菌株是近似于田无链霉菌（S.tanashiensis）、委内瑞拉链霉菌（S.Venezuelae）和S.showdoensis的种，其记载在Nonomura，J.Ferment.technol.，Vol.52，NO.2，PP.78-92（1974），E.B.Shirling和D.Gottlieb，Int.J.Syst.Bact，Vol.18，NO.4.PP.379-380（1968），Vol.19，NO.4，PP.491-492（1969），Vol.22，NO.4，PP.352-354和PP.374-375（1972）。但是，在培养和生理特征中观察到一些区别之处如下表所示。所以MCI 2691菌株鉴定为链霉菌种。

MCI 2691菌株和其它各菌株间的区别显示在下表中。

田无链委内瑞拉 S.zaomv S.showdo MCI 2691

霉菌链霉菌 cetjcus ensis

在各种介质中的孢子形成:

葡萄糖-天门冬

酰胺琼脂介质弱弱弱弱旺盛

甘油-天门冬

酰胺琼脂介质旺盛旺盛旺盛旺盛无

淀粉-无机盐

琼脂介质旺盛旺盛无旺盛旺盛

酵母浸膏-麦芽

浸液琼脂介质旺盛弱旺盛旺盛旺盛

在酪氨酸琼脂介质

中类黑色素的形成 - + + + +

耐NaCl性 4% ND ND 4% 7%

碳源的利用:

D-葡萄糖 + + + + +

L-阿拉伯糖 + + + ± +

D-木糖 + + + + +

D-果糖 ± + - + +

蔗糖 - - - ± -

L-鼠李糖 - + - - -

棉子糖 - - - - -

肌醇 - - - - ±

按照本发明腈类微生物的水合反应，除使用特定微生物外其与现有的方法基本相近。因此，本文中“利用微生物水合作用转变腈类为相应酰胺”这句话包括一个在腈类存在下培养微生物的方案;以及在微生物培养后，腈和培养过的介质、细胞体或处理过的物质相接触的方案。另外，本发明也包括这样的方案，即对微生物细胞体或由该微生物细胞内或细胞外产生的酶进行固定化并用于本发明反应中。

可以用普通的方法完成对本发明的微生物的培养。用于本发明的介质是普通的介质，其含有适当的配比，碳源如葡萄糖、甘油、小米凝胶或淀粉;无机氮源如硫酸铵或硝酸铵;有机氮源如大豆粉、酵母浸膏、蛋白胨或尿素，还有无机盐如磷酸盐、-钠、钾或镁。另外，利用腈类如乙腈或酰胺如丙烯酰胺以诱导所需求的酶，无机盐如铁、锌或钴离子对酶活性是必要的，这些都可以优选地加入培养介质中。培养过程在温度20-37℃、介质PH为5-10时培养1-5天。

尽管在上述将要水合的腈类存在下，通过培养微生物来把腈转化为酰胺是可行的，但下面的方法为优选。

因此，微生物按上面提到的方法进行培养，并通过离心分离从培养后的介质中收集细胞体。该细胞体悬浮于生理盐水或缓冲液中如磷酸盐或三羟甲基氨基甲烷缓冲液（PH4-11），所述的腈如丙烯腈加入到悬浮液中，保持在合适的温度条件下，例如在冷冻点加60℃。在本方案中，也可按照反应的进展分批添加腈。

从上述培养的培养物或其上清液的细胞体中可以纯化酶，该纯化可利用破损，硫酸铵沉淀，离子交换色谱、凝胶过滤色谱、疏水色谱等方法。接着，该产物酶可用于完成上述反应。

另外，由上述方法获得的细胞体或酶可以在凝胶如聚丙酰胺、光致交联树脂、琼脂或角叉菜聚糖中进行成对地固化，并可在上述合适的PH和温度条件下，在备有搅拌设备的反应器中和腈进行反应。另一种方法是把凝胶装填在柱中，通过让含腈的溶液流经柱子而达到凝胶与腈的反应。

由本反应得到的酰胺可以以水溶液的形式在不用任何后处理情况下使用，或通过浓缩以粉末的形式使用，所用的方法例如有膜浓缩或喷雾干燥浓缩。也可以利用活性炭、离子交换树脂、离子交换膜等方法进一步提高其纯度。

本发明通过下面的实施例进行进一步的阐述，但不应当认为是对本发明的限制。只要不脱离本发明的精神，实施例的改变都包括在本发明的范畴中。在下列实施例中，通过高性能液相色谱完成对腈和酰胺的定量分析。

实施例1

克雷白杆菌（Klebsiella SP.）MCI 2609菌株在有氧条件下、30℃下培养3天，其培养基含0.4%甘油、0.2%酵母浸膏、0.05%聚蛋白胨、0.001%FeSO₄·7H₂O、0.001%CoCl₂·6H₂O、0.2%NaCl、0.04%MgSO₄·7H₂O、0.25%K₂HPO₄、和0.025%丙烯酰胺。培养后，细胞体通过离心分离从培养物中分离出来，再用生理盐水洗涤并悬浮在磷酸缓冲液（PH7.0，0.1M）中。等分量的该悬浮液（0.8ml）与7%的丙烯腈水溶液（0.2ml）混合，并在30℃时反应1小时。反应混合物中丙烯腈完全转化为丙烯酰胺，其产率为1.88%。

实施例2-12

使用类似的方法重复实施例1的反应，除了使用下列菌株以代替实施例1中的MCI 2609菌株：产气单孢菌种（Aeromonas SP.）MCI 2614（实施例2）、弗氏柠檬酸菌（Citrobacter freundii）MCI 2615（实施例3）、根瘤菌种（Rhizobium SP.）MCI 2610（实施例4）、根瘤菌种（Rhizobium SP.）MCI 2643（实施例5）、发根病土壤杆菌（Agrobacterium rhizogenes）IAM 1357。（实施例6）、根癌病土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）IAM 13129（实施例7）、Rhizobium Loti IAM 13588（实施例8）、豌豆根瘤菌（Rhizobium Legminosarum）IAM 12609（实施例9）、苜蓿根瘤菌（Rhizobium melioti）IAM 12611（实施例10）、肠杆菌种（Enterobacter SP.）MCI 2707（实施例11）或链霉菌种（Streptomyces SP.）MCI 2691（实施例12）。在反应混合物中丙烯酰胺产量的确定就一切情况而论。

实施例13

Xanthobacter flavus JCM 1204菌株在有氧条件、30℃下培养二天，培养基含0.4%甘油、0.2%酵母浸膏、0.05%聚蛋白胨、0.001%FeSO₄·7H₂O、0.001%CoCl₂·6H₂O、0.2%NaCl、0.04% MgSO₄·7H₂O、0.25%K₂HPO₄和0.1%丁烯酰胺。培养物（2ml）离心分离出细胞体，然后用生理盐水清洗并悬浮于磷酸盐缓冲液中（PH 7.0，0.1M）（0.32ml）。向悬浮液添加7%的丙烯腈水溶液（0.08ml），该混合物在30℃下反应1小时。结果发现，反应混合物中的丙烯腈全部转化为丙烯酰胺。

实施例14

用类似的方法重复实施例13的反应，除了用Erwinia nigrifluens MAFF 03-01435代替例13中的JCM 1204菌株。结果发现，反应混合物中的丙烯腈全部转化为丙烯酰胺。

Claims

1、一种利用微生物作用由腈制备酰胺的方法，其特征在于所述的微生物属于克雷白杆菌属(Klebsiella)、产生单孢菌属(Aeromonas)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)、黄色杆菌属(Xanthobctre)、欧文菌属(Erwinia)、肠杆菌属(Enterobacter)或链霉菌属(Streptomyces)中的属并具有把腈转化为酰胺的能力。

2、按照权利要求1的方法，其中所述的腈加到所述微生物培养介质中。

3、按照权利要求2的方法，其中所述的腈连续或间歇地加入。

4、按照权利要求1的方法，其中所述的腈为丙烯腈。

5、按照权利要求1的方法，其中所述的微生物是克雷白杆菌种（Klebsiella SP.）MCI 2609、产气单孢菌种（Aeromonas SP.）MCI 2614、弗氏柠檬酸细菌（Citrobacter freundii）MCI 2610、根瘤菌种（Rhizobium SP.）MCI 2643、发根病土壤杆菌（Agrobacterium rhizogenes）IAM 13570、根癌病土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）IAM 13129、Rhizobium loti IAM 13588、豌豆根瘤菌（Rhizobium legminosarum）IAM 12609、苜蓿根瘤细菌（Rhizobium melioti）IAM 12611、Xantho bacter flavus JCM 1204、Erwinia nigrifluens MAFF 03-01435、肠杆菌种（Entcrobacter SP.）MCI 2707或链霉菌种（Streptomyces SP.）MCI 2691。

6、克雷白杆菌种（Klebsiella SP.）MCI 2609（FERM BP-）。

7、产气单孢菌种（Aeromonas SP.）MCI 2614（FERM BP-）。

8、弗氏柠檬酸细菌（Citrobacter freundii）MCI 2615（FERM BP-）。

9、根瘤菌种（Rhizobium SP.）MCI 2610（FERM BP-）。

10、根瘤菌种（Rhizobium SP.）MCI 2643（FERM BP-）。

11、肠杆菌种（Enterobacter SP.）MCI 2707（FERM BP-）。

12、链霉菌种（Streptomyces SP.）MCI 2691（FERM BP-）。