JPH0530983A - アミド類の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 エアロモナス属に属し、ニトリル類を分解す
る能力を有する微生物を用いて、ニトリル類からアミド
類を製造する方法。 【効果】 本発明の方法によれば新規なエアロモナス属
に属する微生物を用いて工業的に有用な純度の高いアミ
ド類が得られる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ニトリル類を微生物の
作用により水和して対応するアミド類に変換させる方法
に関し、さらに具体的には、本発明は使用する微生物に
特徴を有するアミド類の生物学的製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】従来
ニトリル類を原料として、対応するアミド類を生産する
方法としては、硫酸法、銅触媒法などによる化学法が広
く工業化されてきたが、近年微生物に由来する酵素を用
いた方法も報告されるようになった。微生物を用いた方
法の利点としては、反応条件が温和なため原料、生産物
の重合反応が起きにくい、副生物が少ない、反応装置が
小さくて済むなどがあげられる。ニトリル類に水を添加
してアミド類を生成する酵素活性を持った微生物として
は、グラム染色陽性の細菌（特公昭６２−２１５１９号
公報）、特にコリネ型細菌（アルスロバクター、ロドコ
ッカス、コリネバクテリウムなど：特公昭５６−１７９
１８号公報、特開昭５９−２６９３号公報、特開昭６１
−１６２１９３号公報、特開昭６２−９１１８９号公
報）や、真菌類（フザリウム：特開昭６４−８６８８９
号公報）などが報告され、グラム染色陰性の細菌として
は唯一シュードモナスが報告されている（特公昭５９−
３７９５１号公報）だけである。

【０００３】微生物は大きく分類すると真核細胞に分類
されるもの（担子菌、糸状菌、酵母など）と原核細胞に
分類されるもの（細菌、藍藻、放線菌など）に大別され
る。細菌は更に細胞壁の構成により、グラム染色陽性の
もの（コリネ型細菌、枯草菌、ブドウ状球菌、乳酸菌、
酢酸菌、放線菌など）と、陰性のもの（腸内細菌、緑膿
菌、ビブリオ菌など）に分けられ、それぞれ分類学的に
は大きく異なるものとされている。

【０００４】

【課題を解決ための手段】発明者らは土壌からの微生物
のスクリーニングを広く行った結果、以下に示すように
従来全く知られていなかったエアロモナス属に属する微
生物がニトリル類からアミド類への変換能を有すること
を見出して、アミド類の新たな製造法を確立した。即ち
本発明の要旨は、ニトリル類からアミド類を微生物の作
用により製造する方法において、該微生物がエアロモナ
ス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属に属し、ニトリル類を分解
する能力を有する微生物であることを特徴とするアミド
類の製造法に存する。

【０００５】以下、本発明につき詳細に説明する。本発
明におい反応原料となるニトリル類としては、 ○ アセトニトリル、プロピオノニトリル、ｎ−ブチ
ロニトリル、イソブチロニトリルのような単純なニトリ
ル類； ○ α−アミノプロピオニトリル、α−アミノ−メチ
ルチオブチロニトリル、α−アミノブチロニトリル、ア
ミノアセトニトリルのようなα−アミノニトリル類； ○ ラクトニトリル、ヒドロキシアセトニトリル、α
−ヒドロキシ−γ−メチルチオブチロニトリルのような
α−ヒドロキシルニトリル類； ○ アミノ−３−プロピオニトリルのようなβ−アミ
ノニトリル類； ○ マロニトリル、スクシノニトリル、アジポニトリ
ルのようなジニトリル類； ○ アクリロニトリル、メタクリロニトリルのような
α−不飽和ニトリル類； ○ ホモベラトリンニトリル、ベンゾニトリルのよう
なα−ベンゼンニトリル類； ○ ニコチノニトリル、イソニコチノニトリルのよう
な複素環式ニトリル類等が挙げられ、中でもアセトニト
リル、プロピオノニトリル、アクリロニトリル、メタク
リロニトリル、ｎ−ブチロニトリル、イソブチロニトリ
ル等の炭素数２〜４のニトリル類が好ましい。特に好ま
しいのはアクリロニトリルである。また上記のニトリル
類から生成されるアミド類は、上記の各ニトリル類に対
応するアミド類である。即ちアセトニトリルからはアセ
トアミドが、プロピオノニトリルからはプロピオンアミ
ドが、アクリロニトリルからはアクリルアミドが生成す
る。

【０００６】次に本発明において使用される微生物につ
いて説明する。本発明において使用される微生物として
はエアロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属に属し、ニト
リル類を分解してアミド類に変換させる能力を有するも
のであれば特に制限はされない。かかる微生物としては
エアロモナス・エスピ−（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓ
ｐ．）ＭＣＩ２６１４（以下「本菌株」または「ＭＣＩ
２６１４号菌」と略記する）が挙げられ、本菌株は工業
技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１２３８９
号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２３８９）として寄託されてい
る。ＭＣＩ２６１４号菌は本発明者等により、天然土壌
から分離された細菌であり、その菌学的性状は次の通り
である。

【０００７】ａ）形態的性状 ハートインフュージョン寒天培地上、３０°Ｃ、３日間
培養 １）細胞の大きさ、形 稈状 ２）細胞の多形性の有無 ： なし ３）運動性 ： あり 極毛 ４）胞子形成 ： なし ５）グラム染色 ： 陰性 ６）抗酸性 ： 陰性

【０００８】ｂ）生育状態 １）ハートインフュージョン寒天培地上、３０°Ｃ ３日間培養のコロニーの特徴 １外形 ： 円形 ２表面の隆起 ： 半レンズ状 ３表面の形状 ： 平滑 ４光沢 ： あり ５色調 ： 黄味灰色 ６透明度 ： 不透明 ７周縁 ： 全縁

【０００９】ｃ）生理的性質 １）空気中での生育 ： ＋ ２）嫌気条件下での生育 ： ＋ ３）カタラーゼ ： ＋ ４）オキシダーゼ ： ＋ ５）Ｏ−Ｆテスト ： Ｆ ６）ゼラチンの加水分解 ： ＋ ７）リトマス・ミルク ： 酸性 凝固、ペプトン化 ８）硝酸塩の還元 ： ＋ ９）脱窒反応 ： ＋ １０）メチルレッドテスト ： − １１）ＶＰテスト ： ＋ １２）インドールの生成 ： ＋ １３）硫化水素の生成 ： − １４）デンプンの加水分解 ： ＋ １５）クエン酸の利用 ： ＋ （クリステンセン培地上） １６）無機窒素源の利用ＮＨ_{4 :} ＋ ＮＯ_{3 :} ± １７）ウレアーゼ ： ＋ １８）リジンの脱炭酸 ： − １９）オルニチンの脱炭酸 ： − ２０）ＤＮａｓｅ ： ＋ ２１）ＩＰＡ反応 ： − ２２）色素の生成 ： −

【００１０】ｃ）生理的性質 ２３）生育温度域 ： ４〜４０°Ｃ ２４）生育ｐＨ ： ｐＨ５〜１０ ２５）唯一炭素源より酸及びガスの生成 炭 素 源 ＭＣＩ ２６１４号菌 酸 ガス １ Ｌ−アラビノース ＋ − ２ Ｄ−キシロース − − ３ Ｄ−グルコース ＋ ＋ ４ Ｄ−マンノース ＋ − ５ Ｄ−フラクトース ＋ ± ６ Ｄ−ガラクトース ＋ ＋ ７ マルトース ＋ − ８ シュクロース ＋ − ９ ラクトース − − １０ トレハロース ＋ − １１ Ｄ−ソルビット ± − １２ Ｄ−マンニット ＋ − １３ グリセリン ＋ − １４ デンプン ＋ − ｄ）化学分類学的性質 ＤＮＡ中のＧＣ含量６２％

【００１１】ｅ）分類学的考察 ○科レベルの同定 ＭＣＩ２６１４号菌は、１）グラム陰性稈菌、２）通性
嫌気性を示す、３）グルコースを発酵する、４）オキシ
ダーゼ陽性、５）極鞭毛などの性質から、Ｂｅｒｇｅ
ｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｒｏｇｙ第１巻及びＣｏｗａｎとＳｔ
ｅｅｌのＭａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅＩｄｅｎｔｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂａｃｔｅｒ
ｉａ 第２版（１９７４年）に記載されているＦａｃｕ
ｌｔ− ａｔｉｖｅｌｙ Ａｎａｅｒｏｂｉｃ Ｇｒａ
ｍ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｒｏｄｓ 群のＶｉｂｒｉｏｎ
ａｃａｅ科に属することが判明した。

【００１２】○属及び種レベルの同定 ＭＣＩ２６１４号菌の同定 本菌株とＶｉｂｒｉｏｎａｃａｅ科に属するＡｅｒｏｍ
ｏｎａｓ属、Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ属及びＶｉｂｒｉ
ｏ属との比較を行った。（伊藤武著Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１２ ｐ７９９（１９８
４）記載）下表に示すように本菌株はＡｅｒｏｍｏｎａ
ｓ属の性状とよく一致したため、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ
ｓｐ．と同定した。また本菌株のＤＮＡ中のＧＣ含量は
６２％であり、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属の５８〜６２％の
範囲とも一致している。

【００１３】

【００１４】本発明によるニトリル類の微生物学的水和
反応は、使用する微生物が特定のものであるという点を
除けば、公知の方法と本質的には変わらない。従って、
本発明で「ニトリル類を微生物の作用により水和して対
応するアミド類に変換させる」ということはニトリルの
存在下に微生物を培養する場合、ならびに微生物培養後
の培養液、菌体またはこれらの処理物とニトリル類を接
触させる場合のいずれをも包含するものとする。また。
微生物菌体、またはこの微生物が菌体内もしくは菌体外
に産生する酵素を固定化して反応に利用する場合をも含
むものである。

【００１５】本発明で使用される微生物の培養は定法通
りに行うことができる。使用する培地としてはグルコー
ス、グリセロール、水飴、澱粉などの炭素源、硫酸アン
モニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源、大豆
粉、酵母エキス、ペプトン、尿素などの有機窒素源、お
よび燐酸塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウムなど
の無機塩類を適当な割合で含有する通常の培地が使用さ
れる。また目的の酵素を誘導するために培地中にアセト
ニトリルなどのニトリル類、アクリルアミドなどのアミ
ド類や酵素活性に必要な無機塩類、例えば鉄イオン、コ
バルトイオンを添加することも望ましい。これらの培地
のｐＨは５〜１０とし温度は２０〜３７°Ｃで１〜５日
間培養を行う。

【００１６】ニトリル類からアミド類への変換は、当該
微生物を水和を目的とするニトリルの存在下で培養して
行うことも可能であるが、好ましくは以下の方法によ
る。当該微生物を前述の方法で培養しその培養液から菌
体を遠心分離により集め、これを水、生理食塩水、リン
酸やトリスなどのｐＨ４〜１１の緩衝液中に懸濁し、こ
れに目的とするニトリル例えばアクリロニトリルを加
え、適当な温度条件の下、たとえば氷点以上４０°Ｃ以
下で共存させれば良い。その場合目的とするニトリル類
を反応の進行と共に遂次添加していくことも可能であ
る。

【００１７】上記のように培養した微生物菌体または培
養上清から、破砕、硫安沈殿、イオン交換、ゲル濾過、
疎水性担体などのカラムクロマトグラフィーの手段によ
り酵素を精製し、得られた酵素を用いて上記のような反
応を行わせることも可能である。また上記の方法で得ら
れた微生物菌体または酵素を、ポリアクリルアミド、光
架橋性樹脂、寒天、カラギーナンなどのゲルで包括固定
化し、上記に示したと同様適当なｐＨ、温度条件下で撹
拌型反応槽内でニトリル類と反応させ、またはカラムに
充填しニトリル類を含有する液を流通させることにより
反応させることも可能である。

【００１８】反応後得られたアミド類はそのまま水溶液
として、または膜濃縮やスプレイドライ濃縮などの方法
により濃縮し粉末として利用することができる。場合に
よっは活性炭、イオン交換樹脂、イオン交換膜などの方
法によりさらに純度を上げることも可能である。

【００１９】

【実施例】以下、本発明につき実施例を挙げて具体的に
説明するが、その要旨を超えない限り以下に限定される
ものではない。なお、ニトリル類およびアミド類の分析
は、高速液体クロマトグラフィーにより行った。 実施例 エアロモナスＭＣＩ２６１４号菌をグリセロール０．４
％、酵母エキス０．２％、ポリペプトン０．５％、Ｆｅ
ＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．００１％、ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ０．
００１％、ＮａＣ１０．２％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．
０４％、Ｋ₂ＨＰＯ₄０．０２５％、アクリルアミド０．
２５％を含む培地により、３０°Ｃで３日間好気的に培
養した。終了後遠心により菌体を分離した後生理食塩で
洗浄し、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０、０．１Ｍ）に懸濁
した。この内の０．８ｍｌをサンプリングし、７％アク
リロニトリル水溶液０．２ｍｌ混和し、３０°Ｃで１時
間反応させた。その結果、反応液中にアクリルアミドが
検出された。

【００２０】

【発明の効果】上記で示したように本発明の方法によれ
ば、新規なエアロモナス属に属する微生物を用いて、ニ
トリル類から工業的に有用な純度の高いアミド類が得ら
れる。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成４年８月２８日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００６

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００６】次に本発明において使用される微生物につ
いて説明する。本発明において使用される微生物として
はエアロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属に属し、ニト
リル類を分解してアミド類に変換させる能力を有するも
のであれば特に制限はされない。かかる微生物としては
エアロモナス・エスピ−（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓ
ｐ．）ＭＣＩ２６１４（以下「本菌株」または「ＭＣＩ
２６１４号菌」と略記する）が挙げられ、本菌株は工業
技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１２３８９
号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２３８９）として寄託され、１９
９２年７月２９日に同所に微工研条寄第３９５０号（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−３９５０）として移管された。ＭＣＩ２
６１４号菌は本発明者等により、天然土壌から分離され
た細菌であり、その菌学的性状は次の通りである。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１５】本発明で使用される微生物の培養は定法通
りに行うことができる。使用する培地としてはグルコー
ス、グリセロール、水飴、澱粉などの炭素源、硫酸アン
モニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源、大豆
粉、酵母エキス、ペプトン、尿素などの有機窒素源、お
よび燐酸塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウムなど
の無機塩類を適当な割合で含有する通常の培地が使用さ
れる。また目的の酵素を誘導するために培地中にアセト
ニトリルなどのニトリル類、アクリルアミドなどのアミ
ド類や酵素活性に必要な無機塩類、例えば鉄イオン、亜
鉛イオン、コバルトイオン等を添加することも望まし
い。これらの培地のｐＨは５〜１０とし温度は２０〜３
７°Ｃで１〜５日間培養を行う。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１６】ニトリル類からアミド類への変換は、当該
微生物を水和を目的とするニトリルの存在下で培養して
行うことも可能であるが、好ましくは以下の方法によ
る。当該微生物を前述の方法で培養しその培養液から菌
体を遠心分離により集め、これを水、生理食塩水、リン
酸やトリスなどのｐＨ４〜１１の緩衝液中に懸濁し、こ
れに目的とするニトリル例えばアクリロニトリルを加
え、適当な温度条件の下、たとえば氷点以上６０°Ｃ以
下で共存させれば良い。その場合目的とするニトリル類
を反応の進行と共に遂次添加していくことも可能であ
る。

【書類名】 受託番号変更届

【提出日】 平成４年８月５日

【旧寄託機関の名称】 工業技術院微生物工業研究所

【旧受託番号】 微工研菌寄第１２３８９号（ＦＥＲＭ
Ｐ−１２３８９）

【新寄託機関の名称】 通商産業省工業技術院微生物工
業技術研究所

【新受託番号】 微工研条寄第３９５０号（ＦＥＲＭＢ
Ｐ−３９５０）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 指田 玲子 神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地 三 菱化成株式会社総合研究所内 (72)発明者 森本 裕紀 神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地 三 菱化成株式会社総合研究所内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ニトリル類からアミド類を微生物の作
   用により製造する方法において、該微生物が、エアロモ
   ナス属に属し、ニトリル類を分解する能力を有する微生
   物であることを特徴とするアミド類の製造法。
2. 【請求項２】 微生物の培養液にニトリル類を添加し
   てこれを対応するアミド類に変換させることを特徴とす
   る請求項１に記載の製造法。
3. 【請求項３】 ニトリル類の添加を連続的または間欠
   的に行うことを特徴とする請求項１または２に記載の製
   造法。
4. 【請求項４】 ニトリル類がアクリロニトリルである
   ことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の製造
   法。
5. 【請求項５】 微生物がエアロモナス・エスピーＭＣ
   Ｉ２６１４号菌であることを特徴とする請求項１〜４の
   いずれかに記載の製造法。