JPH04197189A

JPH04197189A - アミドの生物学的製造方法

Info

Publication number: JPH04197189A
Application number: JP32548290A
Authority: JP
Inventors: Shogo Yoshida; 省吾吉田
Original assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Current assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Priority date: 1990-11-29
Filing date: 1990-11-29
Publication date: 1992-07-16

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、アミドの生物学的製造方法に関する。さらに
詳しくは、炭素数２〜４のニトリルをキサントバクタ−
（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）属菌の作用による水和反
応に供し、対応するアミドを生成さしめるアミドの生物
学的製造法に関する。産業上重要とされるアミドとして
、たとえばアクリルアミドか挙げられる。アクリルアミ
ドは、アクリロニトリルの水和によって製造されるか、
高分子凝集剤、紙力増強剤および繊維改良剤として広く
利用されている。

〔従来の技術、発明か解決しようとする課題〕近年微生
物の有するニトリル水和酵素であるニトリルヒドラター
ゼ（あるいはニトリラーゼ）の作用を利用したニトリル
からアミドの製造方法が幾つか提案されている。たとえ
ば特公昭６１−２１５１９公報にはバチルス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ）属、バクテリウムーム（Ｂａｃｔｅｒｉｄｉ
ｕｍ　）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ）属の細菌を、特公昭５６−１７９１８公報
にはコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ　）属、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属の細菌
を、特公昭５９−３７９５１公報にはシュードモナス（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の細菌を、特開昭６１−１
６２１９３公報にはロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃ
ｕｓ　）属、アルスロバクタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔ
ｅｒ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃ　ｔ
　ｅｒ　ｉ　ｕｍ）属の細菌を、特開昭６４−８６８８
９公報にはフサリウム（Ｆｕｓａｒ　ｉｕｍ）属の糸状
菌を用いる方法か提案されている。

しかし、これらの微生物を用いる何れの場合も、触媒と
しての菌体の実用的製造法として、たとえばグルコース
、デキストリンのような天然炭素源、ペプトン、肉エキ
ス、コーンステイープリカーのような天然栄養源を用い
て培養を行う必要があった。これらの天然炭素源、天然
栄養源を用いて培養する場合、これらの成分が工業原料
として高価であること、また培養の際混入した雑菌が増
殖しやすいため培養工程において厳重な雑菌混入防止の
手段を講じる必要があることから、菌体製造のコストを
工業的に十分なまでに低減させることができなかった。

〔課題を解決するための手段、作用〕

本発明者らは、工業的に満足し得る反応活性、選択率を
もって炭素数２〜４のニトリルを水和して対応するアミ
ドを生成し、かつ、工業原料として安価な化合物を主炭
素源として生育てきる微生物の探索を目的に鋭意研究を
行った結果、メタノール資化性細菌として公知であるキ
サントバクタ−（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）属菌の中
に高イニトＩＪ　ル水和活性を有する微生物を見いたし
、本発明を完成す・　るに至った。すなわち、本発明に
よれば、炭素数２〜４のニトリルを微生物の作用により
水和して、対応するアミドを製造するに際し、微生物と
してキサントバクタ−（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）属
菌を用いることを特徴とする、アミドの生物学的製造方
法か提供される。

本発明で使用される微生物はキサントバクタ−属に属す
る微生物で炭素数２〜４のニトリルを水和する能力を有
する微生物であればよく、菌株によって限定されること
はない。キサントバクタ−属については、Ｂｅｒｇｅｙ
’ｓ　ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　　ｖｏｌ　　１．　　Ｗｉｌ
ｌｉａｍｓ　　ａｎｄ　　Ｗｉｌｋｉｎｓ。

１９８４に記載かあり、本属にはＸａｎｔｈｏｂａｃｔ
ｅｒ　ａｕｔｏ−ｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、　Ｘａｎｔｈｏ
ｂａｃｔｅｒ　ｆｌａｖｕｓの２種か存在し、具体的な
菌株の例を挙げれば、たとえばキサントバクタ−・オー
トトロフィカス（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒａｕｔｏｔ
ｒｏｐｈｉｃｕｓ）　　ＴＫ　０５１９（＝ＪＣＭ　７
８６４　＝ＤＳＭ　５９７）かある。この菌株は公知で
あり、Ｊ　ＣＭ　（ＪａｐａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　
　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）より入手可能で
ある。

本発明において水和反応の対象となるニトリルは炭素数
２〜４のニトリルてあり、具体例をあげれば、たとえば
、アセトニトリル、プロピオニトリル、ｎ−ブチロニト
リル、ｉ−ブチロニトリル、アクリロニトリル、メタク
リロニトリル等がある。本発明に使用される微生物の培
養には、例えばメタノール、エタノール、プロパツール
、ｎ−ブタノール等の低級アルコール、ギ酸、酢酸、プ
ロピオン酸、ｎ−酪酸等の低級脂肪酸、グルコース等の
炭水化物などが炭素源として、Ｃ２〜Ｃ４のニトリル、
アミドが窒素源または窒素源および炭素源として、酵母
エキス、麦芽エキス等が有機栄養源として、さらにリン
酸塩、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、亜鉛
、マンガン等が無機栄養源として用いられ、これら成分
を適宜含有した培地を用いることか適当である。また、
キサントバクタ−属菌は水素ガスをエネルギー源、二酸
化炭素を炭素源として酸素存在下で生育することが公知
てあり、このような場合においても、窒素源または窒素
源および炭素源としてＣ２〜Ｃ４のニトリルまたは／お
よびアミドを添加して培養することにより同様の菌体を
得ることが可能である。

培養のｐＨは通常５〜９、好ましくは６〜８、培養温度
はｌＯ°Ｃ〜４０℃、好ましくはシ５°Ｃ〜３５℃であ
り、この条件て好気的に培養を行う。

また、上記の培養において、ニトリル、アミドの代わり
に、窒素源として例えば、硫酸アンモニウム、硝酸ナト
リウム等の無機窒素源を用いた場合には、ニトリル水和
活性かほとんど無いか、極めて低い菌体が得られる。こ
のような菌体を、水性媒体中においてＣ２〜Ｃ４のニト
リルおよび／またはアミドと接触させることで菌体に水
和酵素を誘導させることによっても、同様に水和活性の
高い菌体を得ることができる。この場合の「水性媒体中
においてニトリルおよび／またはアミ下と接触させる」
とは、具体的には、たとえば、培養終了後の培養物にニ
トリルおよび／またはアミドを添加する、培養終了後の
菌体を遠心分離等によって培養液から分離し、ニトリル
および／またはアミドを溶解した緩衝液に縣濁する、な
どの方法によって実施される。誘導のｐＨは通常５〜９
、好ましくは６〜８、温度はｌＯ℃〜４０℃、好ましく
は２５℃〜３５℃である。

本発明に言う「ニトリルを微生物の作用により水和して
対応するニトリルを製造する」とは、微生物の生産する
ニトリル水和酵素にトリルヒドラターゼ）を水性媒体中
においてニトリル水和反応の触媒として用いることか可
能なあらゆる場合を含むものとし、たとえば、水和すべ
きニトリルの存在下に微生物を培養する場合、培養終了
後の培養物を直接用いる場合、培養物から分離した菌体
を用いる場合、菌体の処理物（固定化菌体、菌体破砕物
、菌体より分離抽出した酵素およびその固定化物、等）
を用いる場合、その他、がある。

本発明を実施するにおいては、ｐＨか５〜９、好ましく
は６〜８、温度か氷点〜５０°Ｃ１好ましくは１６℃〜
４０℃であり、触媒として用いられる該微生物菌体また
は菌体処理物を、たとえば、０．０１〜１０重量％含む
水性媒体中に、水和すべきニトリルを共存させればよい
。一般にニトリル化合物は菌体および酵素に対する毒性
か高いため、水和すべく用いられるニトリルは、０．０
１〜２重量％の濃度範囲で存在させることか好ましい。

後記実施例にある如く、水和すべきニトリルがアセトニ
トリル、プロピオニトリル、ｎ−ブチロニトリル、ｉ−
ブチロニトリルである場合は、該微生物か、水和反応に
よってそれぞれ生成された対応するアミドをさらに対応
する有機酸に加水分解する能力を有するため、水和反応
は、合目的的、可及的速やかに終了させることが好まし
い。

また、水和すべきニトリルかアクリロニトリル、メタク
リロニトリルである場合は、該微生物は、それぞれ生成
したアクリルアミド、メタクリルアミドを加水分解する
能力をほとんともたないため、はぼ１００　％の収率て
反応を進行させることか可能である。

反応の結果得られるアミドは、反応終了後合目的的な公
知の方法によって精製、回収することができる。すなわ
ち、たとえば、遠心分離、膜分離等によって反応液から
菌体を分離した後、活性炭処理等によって不純物、着色
物質を除き、減圧濃縮、晶出等によって目的のアミド結
晶を得ることができる。

〔実施例〕

以下に本発明の実施例を示す。使用した微生物はすべて
キサントバクタ−オートトロフィカス（Ｘａｎｔｈｏｂ
ａｃｔｅｒ　ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）　ＴＫ　０
５１９である実施例１ａ、培養以下に示す組成からなる培地を用い、３０℃で２日間培
養した。

メタノール　　　　　　　　０．５　　％ＫＨ２ＰＯ４
０，１４％Ｎａ２ＨＰＯ４０，３９６ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０２％イーストエキス　　　　　　ｏ、ｏ２　ｏ６イソブチロ
ニトリル　　　　０．２９６ＮａＣ１Ｏ，０２％ＣａＣｌ２　・２Ｈ２００，０１％クエン酸第二鉄ｎ水和物（含有鉄１６〜２０％）　　　ｌ　　　ｐｐｍＺｎＳＯ
４・７Ｈ２０６ｐｐｍＭｎＣｌ２　・４Ｈ２０３ｐｐｍＣｕＳＯ４・５Ｈ２００，１ｐｐｍＫＩ　　　　　　　　　　　　Ｏ，３ｐｐｍ（ＮＨ４）
６　Ｍｏ０２４・４Ｈ２００，３ｐｐｍＨ３ＢＯ３０，６ｐｐｍＣｏＣｌ２−６Ｈ２００，３ｐｐｍｂ、ニトリル水和反応得られた培養液から菌体を遠心により分離し、ｐＨ７，
０のリン酸カリウム・ナトリウムバッファーで洗浄の後
、同バッファーに乾燥菌体重量として約０．２％の濃度
となるように分散させて菌体分散液を得た。この分散液
１部と、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、アセ
トニトリル、プロピオニトリル、ｎ−ブチロニトリル、
ｉ−ブチロニトリルを０．３重量％それぞれ含む上記バ
ッファー９部を、それぞれ混合し、３０°Ｃに、おいて
３０分間反応させた後、菌体をポアーサイズ０．４５μ
ｍのアセチルセルロースフィルターで反応液から分離さ
せることで反応を停止し、それぞれのる液中の生成され
たアミドおよび未反応のニトリルをガスクロマトグラフ
ィーで分析した。

得られた結果を、乾燥菌体重量あたりのアミド生成比活
性（ｇ−アミド／ｇ−菌体／ｈ）て表１に示す。

表　　　１供試ニトリル　　　　　　　比活性（ｇ−了ミド／ｇ−菌体／ｈ）上記の何れの場合も、供試ニトリルに対応するアミド以
外の不純物の生成は認められず、反応の選択率はほぼ１
００％であった。

実施例２ａ、培養実施例１と同様である。

ｂ、ニトリル水和反応反応時間を２４時間とした以外は、全て実施例１と同様
に行った。

何れのニトリルを用いた場合も、反応終了後ニトリルは
は残存していなかった。供試ニトリルか、アクリロニト
リルおよびメタクリロニトリルである場合、はぼ１００
％のモル収率て対応するアミド、アクリルアミドおよび
メタクリルアミドか生成され、残存していた。供試ニト
リルがアセトニトリル、プロピオニトリル、ｎ−ブチロ
ニトリル、ｉ−ブチロニトリルである何れの場合も、添
加したニトリルの約５０モル％の対応するアミド、約４
０モル％の対応する有機酸か残存していた実施例３ａ、培養メタノールをエタノール、あるいはｎ−ブタノールとし
た以外は、実施例１および２の場合と同様である。

ｂ、ニトリル水和反応実施例１の場合と同様にして行った。結果を乾燥菌体重
量あたりのアミド生成活性（ｇ−アミド／ｇ−菌体／ｈ
）て表２に示す。

〔発明の効果〕

本発明によれば、メタノールを主炭素源として培養菌体
を得ることか出来るため、目的物であるアミドの製造コ
ストを低減することが出来る。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）炭素数２〜４のニトリルを微生物の作用により水
和して対応するアミドを製造するに際し、使用する微生
物がキサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）属
菌であることを特徴とする、アミドの生物学的製造方法
。
（２）メタノールを主炭素源として培養した微生物菌体
および／または該処理物を用いる特許請求範囲第１項記
載の方法