JPH01171479A

JPH01171479A - ロドコッカス属細菌の培養方法

Info

Publication number: JPH01171479A
Application number: JP62328445A
Authority: JP
Inventors: Kiyoshi Kawakami; 川上　潔
Original assignee: Research Association for Utilization of Light Oil
Current assignee: Research Association for Utilization of Light Oil
Priority date: 1987-12-26
Filing date: 1987-12-26
Publication date: 1989-07-06
Also published as: JPH0469993B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、ニトリルヒドラターゼ酵素活性の高いロドコ
ッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属菌体を高収率で生
産する方法に関する。

ニトリルヒドラターゼは、ニトリル類を水和して対応す
るアミド類を生成させる酵素として知られており、その
産業への利用としては、アクリロニトリルもしくはメタ
クリロニトリルから、それぞれ対応するアミドへの生成
反応が重要であり、例えば、特開昭６２−９１１８９号
公報に記載がある。

（従来の技術）ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属し、二
トリルヒドラターゼを産生ずる能力を有する細菌を培養
して、ニトリルヒドラターゼ酵素活性を有する細菌菌体
を製造するに当り、特開昭６１−１６２１９３号公報に
は、例えば、ロドコッカスｓｐ、　Ｓ　−６株の場合に
、グルコース、ペプトン、酵母エキス、肉エキスから成
る通常の栄養培地で培養し、活性な菌体を取得していた
。

一方、特開昭６２−９１１８９号公報には、例えば、ロ
ドコッカスｓｐ、ＡＫ３２株の場合には、グルコース、
ペプトン、肉エキスなどから成る通常の栄養培地に、ニ
トリルを添加した培地を用いて培養し、より高活性な菌
体を取得しており、ニトリル類がロドコッカスｓｐ、Ａ
Ｋ３２株の酵素誘導物質であることが示されていた。

（発明が解決しようとする問題点）ニトリルヒドラターゼ酵素活性を有するロドコッカス（
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌の中で、特開昭６２−
９１１８９号公報に記載のＡＫ３２株、ＡＫ３３株、Ａ
Ｋ３１３２株は、いずれも誘導酵素を有しており、高い
酵素活性を発現させるためには、さらに簡便で、かつ有
効な酵素誘導物質の開発が望まれていた。

（問題点を解決するための手段）本発明者は、このように、ロドコッカス属細菌の中で、
誘導酵素としてニトリルヒドラターゼを有している細菌
のより高い酵素活性を発現させるため、酵素誘導物質お
よびその使用条件について鋭意研究を行なった結果、ア
ミド化合物を培地に添加して培養することにより、極め
て強力なニトリルヒドラターゼ活性を有するロドコッカ
ス属細菌を取得することができることを見出し、本発明
を完成するに至った。

すなわち、本発明は、ロドコッカス属に属し、ニトリル
ヒドラターゼを産生ずる能力を有する細菌を培養して、
ニトリルヒドラターゼ酵素活性を有する細菌菌体を製造
するに当り、アミド化合物を培地に添加することを特徴
とするロドコッカス属細菌の培養方法に関するものであ
る。

以下、本発明方法は詳細に説明する。

本発明の一般的実施態様としては、ニトリルヒドラター
ゼを産生ずる能力を有する細菌を、炭素源、例えば、グ
ルコース、フラクトース、シェークロースおよびアルド
ースなど、窒素源、例えば、硫酸アンモニウム、硝酸ア
ンモニウム、アンモニアおよび尿素など、有機栄養源、
例えば、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキスおよびペプ
トンなど、無機栄養源、例えば、リン酸塩、ナトリウム
、カリウム、鉄、マグネシウム、マンガン、亜鉛などを
適宜含有した培地に、酵素誘導物質として、イソブチル
アミド、ｎ−ブチルアミド、プロピオンアミド、アセト
アミド、メタクリルアミド、クロトノ、アミド、アクリ
ルアミドなどのアミド化合物の中の少なくとも一種を添
加し培養を行なう、また、上記酵素誘導物質としてのア
ミド化合物を唯一の炭素源としたものに、必要に応じ、
上記の窒素源、無機栄養源および有機栄養源を添加した
培地で培養してもよい。

培地中の該酵素誘導物質の濃度は、通常０．１ｇ／Ｉ１
以上、５０ｇ／ｆｆｉ未満であるが、好ましくは０．５
ｇ／ｊ！以上、２０　ｇ／ｌ未満となるように調整する
。この濃度が５０ｇ／ｌ以上になると、菌体増殖に著し
い阻害が見られると共に、取得した菌体の活性低下が見
られる。一方、０．１ｇ／ｌ未満では、十分に酵素活性
を誘導できず、菌体の活性は低い。培地のｐｏは、通常
５〜９、好ましくは６〜８、温度は、通常２０〜３５℃
、好ましくは２７〜３２℃で、１〜５日間好気的に培養
を行なう。

（発明の効果）本発明にしたがえば、ニトリルヒドラターゼを産生ずる
能力を有するロドコッカス属細菌に、強力にニトリルヒ
ドラターゼ酵素活性を発現させることができるため、ニ
トリルからアミドを酵素法により製造する際、細菌菌体
当りのアミド生産量を増大させると共に、アミド生産速
度を上げることが可能となり、設備の小型化およびコス
トの低減といった面からの生産性の向上に寄与するとこ
ろが大である。

（実施例）次に、本発明を実施例により、さらに詳細に説明するが
、本発明の範囲は実施例に限定されるものではない。

実施例１グルコース２重量％、肉エキス０．１重量％、ペプトン
０．１重量％、食塩０．１！Ｉ％、リン酸第−カリウム
０．１重量％、硫酸マグネシウム０．０５５重量、硫酸
第一鉄０．００５重量％、硫酸マンガン０、０　Ｏ５重
量％、硫酸アンモニウム０．１重量％、硝酸カリウム０
．１重量％を含んだ培地（以後、Ｚ培地と呼ぶ）に、イ
ソブチルアミドを０．２５重量％添加した後、水酸化カ
リウムでｐｉを７．０に調整したものを、１２１℃で３
０分間滅菌し、室温まで冷却後、ロドコッカス（Ｒｈｏ
ｄｏｃｏｃｃｕｓ）　ｓｐ、　Ａ　Ｋ２Ｓ株（微工研菌
寄第１０４７号）をスラントより一白金耳植菌し、３０
℃で３８時間培養した。

次に、得られた培養液から４℃で遠心分離により集菌し
、０．０５Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７，０）で洗浄し
たものを反応に供した。すなわち、乾燥菌体量として０
．２重量％、メタクリロニトリル２．０重量％、０．０
５Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７，０）９７．８重量％の
反応液を調合し、３０℃で反応を開始した。反応開始１
０分後に、反応液をガスクロマトグラフにより分析した
ところ、２．５重量％のメタクリルアミドを含み、未反
応のメタクリロニトリル、メタクリル酸およびその他の
副生物は全く含まれず、反応はほぼ定量的に進行し完結
していた。

実施例２〜８実施例１で用いた２培地に、種々のアミド化合物を０．
２５５重量添加した後、水酸化カリウムでｐｉを７．０
に調整したものを、１２１℃で３０分間滅菌し、室温ま
で冷却後、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）　
ｓｐ、　Ａ　Ｋ　３２株（微工研菌寄第１０４６号）を
スラントより一白金耳植菌し、３０℃で３８時間培養し
た。次に、得られた培養液からの集菌、菌体の洗浄およ
びメタクリロニトリルとの水和反応は、実施例１と同一
の方法で行ない、反応時間５分後のメタクリルアミド収
率を比較した。なお、分析にはガスクロマトグラフィー
を用い、得られた結果は第１表に示した。

第　　　１　　　表実施例９〜１３実施例１で用いたＺ培地に、イソブチルアミドを種々の
濃度で添加した後、実施例１と同様な方法で、ロドコッ
カスｓｐ、ＡＫ３２株を植菌し、３０℃で培養を行なっ
た。菌体の増殖が見られたものについては、実施例１と
同一条件で反応を行ない、反応時間５分後のメタクリル
アミド収率を測定した。得られた結果を第２表に示した
。

第　　　２　　　表実施例１４リン酸第−カリウム０．１重量％、硫酸マグネシウム０
．０５重量％、硫酸第一鉄０．００５重量％、硫酸マン
ガンｏ、　ｏ　ｏ　ｓ重量％、硫酸アンモニウム０、１
重量％、硝酸カリウム０．１重量％を含んだ培地（以後
Ｂ培地と呼ぶ）にイソブチルアミドを０．２５重量％添
加した後、実施例１と同様な方法で、ロドコッカスｓｐ
、ＡＫ３２株を植菌し、３０℃で９６時間培養した。次
に、得られた培養液から集菌、菌体の洗浄およびメタク
リロニトリルとの水和反応は、実施例１と同一の方法で
行ない、反応時間１５分後に、反応液を分析したところ
、１．２重量％のメタクリルアミドが生成し、１．１重
量％のメタクリロニトリルが検出された。

実施例１５グルコース１重量％、肉エキス１重量％、ペプトン１重
量％、食塩０．１重量％を含んだ培地（ｐＨ７，０）を
、１２１℃で３０分間滅菌し、室温まで冷却後、ロドコ
フカスｓｐ、ＡＫ３３株をスラントより一白金耳植菌し
、３０℃で４０時間培養した。

、　　次に、得られた培養液から菌体を４℃で遠心分離
により集菌し、生理食塩水で洗浄後、実施例１４に示し
たＢ培地にイソブチルアミドを０．２５５重量添加し、
水酸化カリウムでｐＨ７，０に調整した液に洗浄菌体を
投入し、３０℃で８時間攪拌した。

次に、この菌体浸漬液から菌体を分離し、メタクリロニ
トリルとの水和反応を実施例１と同一の方法で行ない、
反応時間１５分後に反応液を分析したところ、２．１重
量％のメタクリルアミドが生成し、０．３重量％のメタ
クリロニトリルが検出された。

実施例１６反応基質をメタクリロニトリルからアクリロニトリルに
変更した以外は、実施例４と同一条件でアクリロニトリ
ルの水和反応を行ない、反応開始１５分後に、反応液を
ガスクロマトグラフィーにより分析したところ、２．６
重量％のアクリルアミドを含み、未反応のアクリロニト
リル、アクリル酸およびその他の副生物は全く含まれず
、反応はほぼ定量的に進行し完結していた。

実施例１７反応基質をメタクリロニトリルからアクリロニトリルに
変更した以外は、実施例５と同一条件でアクリロニトリ
ルの水和反応を行ない、反応開始１５分後に、反応液を
分析したところ、２．５重量％のアクリルアミドが生成
し、０．１重量％のアクリロニトリルが検出された。

実施例１８菌株をロドコッカスｓｐ、ＡＫ　３１３２株とし、培養
時間を１２０時間とした以外は、実施例１４と同一条件
で培養した。菌体は、得られた培養液から実施例１と同
様の方法で取得し、反応に供した。すなわち、乾燥菌体
量として１．０重量％、メタクリロストリル１．０重量
％、０．０５Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７，０）　９８
．０重量％の反応液を調合し、３０℃で反応を開始した
。反応開始１時間後に、反応液を分析したところ、０．
４重量％のメタクリルアミドが生成し、０．７重量％の
メタクリロニトリルが検出された。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属
し、ニトリルヒドラターゼを産生する能力を有する細菌
を培養して、ニトリルヒドラターゼ酵素活性を有する細
菌菌体を製造するに当り、アミド化合物を培地に添加す
ることを特徴とするロドコッカス属細菌の培養方法。
（２）アミド化合物がイソブチルアミド、ｎ−ブチルア
ミド、プロピオンアミド、アセトアミド、メタクリルア
ミド、クロトノアミド、アクリルアミドからなるもので
ある特許請求の範囲第１項記載の培養方法。
（３）培地中の該アミド化合物の濃度が０．１ｇ／ｌ以
上、５０ｇ／ｌ未満である特許請求の範囲第１項記載の
培養方法。
（４）ロドコッカス属に属し、ニトリルヒドラターゼを
産生する能力を有する細菌がロドコッカスｓｐ．ＡＫ３
２（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＡＫ３２）微工研
菌寄第１０４６号、ロドコッカスｓｐ．ＡＫ３３（Ｒｈ
ｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＡＫ３３）微工研菌寄第１
０４７号またはロドコッカス・エリスロポリスＡＫ３１
３２（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌ
ｉｓ　ＡＫ３１３２）微工研菌寄第１０４０号である特
許請求の範囲第１項記載の培養方法。