JPH0822221B2 - シュードモナス属細菌の培養法 - Google Patents

シュードモナス属細菌の培養法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 技術分野 本発明は、ニトリルヒドラターゼ活性の高いシュード
モナス（Pseudomonas）属細菌を高収率且つ大量に生産
する方法に関するものである。
近年、微生物、酵素またはそれらを固定化して種々の
単位化学反応や複合化学反応の触媒として利用しようと
する動きが、盛んになってきている。ニトリルヒドラタ
ーゼは、ニトリル類を水和して相当するアミド類を生成
させる酵素として知られており〔Agric.Biol.Chem.46 1
165（1982）参照〕、その具体的利用例としてニトリル
ヒドラターゼを有する細菌を用いて炭素数２〜４のニト
リルから対応するアミドを生成させることが提案されて
いる〔特公昭59−37951号公報、Agric.Biol.Chem.46 11
83（1982）参照〕。また、これらの菌の培養方法として
幾つかの方法が提案されている〔特公昭61−43996、同6
1−43997、同61−43998、同61−43999号公報参照〕。
問題点 このような活性を有する細菌を工業的規模で利用する
ためには、細菌を大量に生産しなければならず、そのた
め培養槽をビーカースケールのものから適宜スケールア
ップをする必要がある。
しかしながら、シュードモナス属に属しニトリルヒド
ラターゼを産生する能力を有する本細菌は、菌体増殖お
よび活性発現のために通気撹拌等により好気的条件下
（酸素供給速度3.5kg−O2/m3・hr程度）で培養をしなく
てはならないが、その培養に容量の大きな培養槽を使用
したところ、所定培養時間での菌濃度、比活性が共に低
下し、培養槽のスケールアップが満足に行えず、ニトリ
ルヒドラターゼ活性の発現が不充分であった。
このような現象が何に起因するのかは定かではない
が、培養中上記酸素供給速度を維持するに際し、培養槽
のスケールアップに伴う撹拌翼による剪断力の増大が直
接あるいは間接的に菌の生育に何らかの影響を与えてい
るものと考えられる。いずれにせよ、この点が解決され
なければ本細菌の培養を工業的に実施することはできな
い。
発明の概要 要 旨 本発明は上記の点に解決を与えることを目的とし、培
養槽の装置的な改造を伴わず、培地に微量の水溶性銅化
合物を添加するという極めて容易且つ実用的な手段によ
って、この目的を達成しようとするものである。
すなわち、本発明は、シュードモナス（Pseudomona
s）属に属しニトリルヒドラターゼを産生する能力を有
する細菌を剪断力印加条件下に培養してニトリルヒドラ
ターゼ酵素活性を有する細菌菌体を製造するに際し、培
地中に水溶性銅化合物を存在させることを特徴とするシ
ュードモナス属細菌の培養法である。
効 果 本発明においては、特に、撹拌翼による培養系の撹拌
を伴う容量の大きな培養槽、例えば500以上の槽で本
細菌の培養を行うに際して、培地に銅イオンを存在させ
ると培養成績が著しく向上する。後記実施例に示すよう
に、700の培養槽を使用した例においては水溶性銅化
合物を添加すると、無添加の場合に比較して、培養48時
間後に単位培養液当りのニトリルヒドラターゼ活性は、
驚くべきことに実に2.35倍に向上した。その水溶性銅化
合物添加による単位培養液当りのニトリルヒドラターゼ
活性の増大は菌体の濃度の増大および菌体自体の活性の
増大に因るものであが、このような水溶性銅化合物の添
加効果は、フラスコ振盪培養等のビーカースケールでの
培養結果からは全く予想し難い特異的なものである。
発明の具体的説明 シュードモナス属細菌 本発明において使用する細菌は、ニトリルヒドラター
ゼ活性を有し、ニトリル、特にアクリロニトリルを水和
して対応アミド、特にアクリルアミドを生成することが
できるシュードモナス属の細菌である、具体的には、例
えば前記特公昭59−37951号公報に記載のシュードモナ
ス・クロロラフィスB23（Pseudomonas chlororaphis B2
3）〔微工研条寄第187号およびシュードモナスsp.PS1
（Pseudomonas sp.PS1）〔微工研条寄第188号〕などを
挙げることができる。これら両菌の詳細は同公報に記載
されている。
水溶性銅化合物 本発明において使用する水溶性銅化合物としては、銅
の無機塩、有機酸塩、錯塩等が代表的なものであり、具
体的には、塩化銅、硫酸銅、硝酸銅、酢酸銅、酒石酸
銅、銅（II）アセチルアセトナート、銅（II）EDTA等が
挙げられる。これらは単独にあるいは混合して使用して
もよく、培地中に銅換算で0.5〜5mg/程度、好ましく
は１〜3mg/程度存在させればよい。
培養 本発明の培養は、通常500以上の培養槽を用い、ニ
トリルヒドラターゼ活性を有するシュードモナス属細菌
をグルコース、フラクトース、シュークロース、デキス
トリン、グリセリン、エタノール、コハク酸などの炭素
源、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、尿素などの窒素源、酵母エキ
ス、肉エキス、麦芽エキス、カゼイン分解物、ペプトン
などの有機栄養源、リン酸塩、マグネシウム塩、カリウ
ム塩、鉄塩、その他の微量金属塩などの無機栄養源、さ
らに酵素誘導剤としてアクリルアミド、メタクリルアミ
ド、クロトンアミド、ｎ−ブチルアミド、プロピオニト
リル、イソブチロニトリル、プロピオンアミドおよびイ
ソブチルアミドなどを含有する培地に接種し、水溶性銅
化合物の存在下に好気的条件にて行う。
培地のpHは６〜９程度、好ましくは７〜８程度、培養
温度は20〜37℃程度、好ましくは25〜30℃程度、通気条
件は0.5〜1.0vvm程度、培養時間は１〜３日程度で充分
である。
なお、培養系に与えられる剪断力に関し、該剪断力は
培養槽の容量の増大、これに伴う撹拌翼径の増大により
大きくなるが、これは一般的に撹拌翼先端の周速度を指
標として表すことができる。該周速度は撹拌翼の回転速
度その他形状、大きさ等にもよるが、例えば500槽の
場合、約2.5〜3.0m/sec.、1000槽の場合、約3.0〜4.0
m/sec.である。本発明においては、撹拌翼先端の周速度
が約2.5m/sec.以上となるような系において特に有効で
ある。
培養終了後の菌体の回収ないし利用、あるいはニトリ
ルヒドラターゼの回収ないし利用は、前記特公昭59−37
951号公報の記載、あるいは後記実施例の記載に従って
行うことができる。
実験例 実施例 下記の前培養条件で生育させたシュードモナス・クロ
ロラフィスＢ−23〔微工研条寄第187号〕菌の培養液4.3
リットルを下記本培養条件で培養してニトリルヒドラタ
ーゼ活性を調べた。
（１）菌の培養 前培養条件 培地組成：ペプトン5g/、酵母エキス3g/ 麦芽エキス3g/、グルコース5g/、pH7.2 培養温度:25℃ 通気、撹拌:1vvm、200rpm 培養時間:24時間 培養槽容量:20（245φ×450L） 培養仕込液量:13 撹拌翼:6枚ディスクタービン付平型撹拌翼（115φ）１
段 本培養条件 培地組成：シュークロス30g/、味液20g/ メタアクリルアミド9.5g/ MgSO4・7H2O1g/、FeSO4・7H2O0.05g/、K2HPO41g/ KH2PO41g/ CuSO4・5H2O5mg/ pH7.8 保養温度:25℃ 通気、撹拌:0.75vvm、220rpm（周速度3.0m/sec.） 培養時間:48時間 培養槽容量:700（800φ×1560L） 培養仕込液量:500 撹拌翼:6枚ディスクタービン付平型撹拌翼（260φ）２
段 （２）ニトリルヒドラターゼ活性の測定 培養液0.1mlと1/20Mリン酸緩衝液（pH7.7）4.90mlと
を混合し、これにさらに5.0重量％のアクリロニトリル
を含む1/20Mリン酸緩衝液（pH7.7）5mlを加えて、10℃
で10分間反応させ、菌体を濾別してからガスクロマトグ
ラフィーで生成したアクリルアミド（AA）を定量するこ
とにより行った。
活性は、比活性（S.A.）および全活性（T.A.）につい
て調べた。これらは下記の通りに定義される。
S.A.:μモルAA/mg菌体／分 T.A.:μモルAA/ml培養液／分 比較例 本培養培地にCuSO4・5H2Oを添加しなかった以外の条
件は上記実施例と同一条件にて培養を行った。
培養時間48時間後の培養結果は表−１に示す通りであ
った。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 13/02 Ｃ１２Ｒ 1:38） (72)発明者 藤本 隆則 神奈川県横浜市鶴見区大黒町10番１号 日 東化学工業株式会社内 審査官 大久保 元浩

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】シュードモナス（Pseudomonas）属に属し
    ニトリルヒドラターゼを産生する能力を有する細菌を剪
    断力印加条件下に培養してニトリルヒドラターゼ酵素活
    性を有する細菌菌体を製造するに際し、培地中に水溶性
    銅化合物を存在させることを特徴とするシュードモナス
    属細菌の培養法。
JP63329333A 1988-12-28 1988-12-28 シュードモナス属細菌の培養法 Expired - Lifetime JPH0822221B2 (ja)

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