JPH02257874A

JPH02257874A - ロドコッカス属細菌及びそれを用いる２―ヒドロキシ酪酸の製造法

Info

Publication number: JPH02257874A
Application number: JP1078053A
Authority: JP
Inventors: Tadaatsu Nakahara; 中原　忠篤; Masato Terasawa; 真人寺沢; Hideaki Yugawa; 英明湯川
Original assignee: Mitsubishi Petrochemical Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Petrochemical Co Ltd
Priority date: 1989-03-31
Filing date: 1989-03-31
Publication date: 1990-10-18
Anticipated expiration: 2013-02-04
Also published as: JP2708536B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［発明の目的］（産業上の利用分野）本発明は、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属
細菌及びそれを用いる２−ヒドロキシ酪酸の製造法に関
するものである。

本発明によれば高収率で安価に２−ヒドロキシ酪酸を製
造することができる。

（従来の技術及び発明が解決しようとする課題）２−ヒ
ドロキシ酪酸は、Ｌ−イソロイシンの原料として有望な
前駆物質であるが、化学合成法による製造ではプロセス
が複雑なため安価に製造することができず、Ｌ−イソロ
イシンの原料としての工業的利用ば困難な状況であった
。

本発明者らはロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｌ
属に属する微生物について、鋭意研究を重ねた結果、１
．２−ブタンジオールから２−ヒドロキシ酪酸を生成す
る能力を有する微生物を見出し、これを利用することに
より高収率で安価に２−ヒドロキシ酪酸を製造し得るこ
とを見出し本発明を完成するに至った。

［発明の構成］（課題を解決するための手段及び作用）本発明は、ロド
コッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｌ属に属し、１．２
−ブタンジオールから２−ヒドロキシ酪酸を生成する能
力を有する微生物、及び該微生物を好気的に培養して得
られる菌体又はその処理物の存在下、１．２−ブタンジ
オールを水性溶媒中で反応させて、反応液中に２−ヒド
ロキシ酪酸を生成させた後、該反応液からＤＬ−２−ヒ
ドロキシ酪酸を採取することを特徴とする２−ヒドロキ
シ酪酸の製造法に関するものである。

本発明の微生物としては、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃ
ｏｃｃｕｓ）属に属し、１．２−ブタンジオールから２
−ヒドロキシ酪酸を生成する能力を有するものであれば
特に制限はないが、例えば、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏ
ｃｏｃｃｕｓ）　ｓ　ｐ　、　ＨＡ　−４２菌株が挙げ
られる。

ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）　　ｓ　ｐ　
、　ＨＡ　−４２菌株の菌学的性質及び分類学的性質は
以下のとおりである。

■、顕微鏡的性質（ａ）細胞の形及び大きさ：桿菌、０．７〜０．８Ｘ２
〜３ＦＩＩ（ｂ）多形性の有無：無しくｃ）運動性：無しくｄ）胞子：無しくｅ）ダラム染色：陽性（ｆ）抗酸性：無しＩｌ、培養的性質（ａ）肉汁寒天培地における生育：有り（ｂ）資化可能
な炭素源：エタノール、グリセロール、シュークロース
、トレハロース、フマル酸ナトリウム、リンゴ酸ナトリ
ウム、ピルビン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム（ｃ）グルコース資化性：無しｍ　、生育条件（ａ）生育温度＝ｌＯ〜４０℃ （ｂ）生育ｐＨ：６〜８（ｃ）酸素要求性：好気性ＴＶ、生理学的性質（ａ）オキシダーゼ：陰性（ｂ）カタラーゼ：陽性（ｃ）５％食塩存在下で生育可能（ｄ）ＤＮＡ中グアニン、シトシン含量（ＧＣ含量）：
６８％（ｅ）ミコール酸の炭素数：３４〜３９以上の諸性質を
「バーシーズ・マニュアル・オブ・システマティク・バ
クテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏ
ｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ３
１）Ｊ、第２巻（１９８６年）より検索した。その結果
、本菌はロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に
属する菌株であると同定されたが、種については炭素源
の資化性その他の性質から合致しない点があり、新種と
考えられた。従って、本発明においてはロドコッカス（
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）　ｓ　ｐ　、　ＨＡ　−４２
と呼称することとする。なお、本菌株は工業技術院微生
物工業技術研究所に微生物受託番号微工研菌寄第１０４
６２号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１０４６２）として寄託され
ている。

上記の微生物を培養するための培地としては、炭素源と
してエタノール、グリセロール、ｌ。

２−ブタンジオール、１．２−プロパンジオール、酢酸
又はその塩（例えば酢酸アンモニウム）、コハク酸又は
その塩（例えばコハク酸アンモニウム）等、好ましくは
エタノール、ｌ、２−ブタンジオール、１．２−プロパ
ンジオールを、窒素源として塩化アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム、硝酸アンモニウム、アンモニアのような無
機窒素源、ペプトン、肉エキス、コーンステイープリカ
ー、カザミノ酸のような有機窒素源等を、無機物として
リン酸カリウム、リン酸−水素カリウム、リン酸二水゛
素カリウム、硫酸マグネシウム等を、また必要に応じて
各種ビタミン等の栄養素を含有した培地が好適に使用さ
れる。

培養は通気撹拌、振盪等の好気的条件下で行い、培養温
度は通常２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃である
。培養途中のｐＨは通常５〜１０、好ましくは６〜８付
近であり、培養中のｐＨの調整には酸、アルカリを添加
して行うことができる。

なお、培養期間は通常１〜７日間、好ましくは２〜５日
間である。

培養後、得られた培養物から濾過又は遠心分離により集
めた菌体又はその超音波等による破砕物又は菌体もしく
はその破砕物の固定化等の処理物を酵素剤として使用す
る。

菌体又は菌体破砕物の固定化手段は、特に制限されるも
のではなく、例えばポリアクリルアミド、アルギン酸、
に−カラギーナン等による包括法等が好適に用いられる
。

上述の本発明に用いる各微生物は、各酵素活性を向上さ
せた変異、遺伝子組み換え、細胞融合などの手法により
得られた微生物であってもよい。

この酵素反応系には、少なくとも１．２−ブタンジオー
ルが含まれていればよく、その濃度は例えば反応の開始
時に通常０．０１〜２０重量％、好ましくは０．０５〜
ｌＯ重量％程度である。

１．２−ブタンジオールを原料として２−ヒドロキシ酪
酸を生成する微生物の菌体又はその処理物の使用量は特
に限定されるものではないが、通常０．１〜５０重量％
、好ましくは１〜３０重量％程度である。

この反応は、ｐＨが通常５〜１０、好ましくは６〜９で
行われ、反応温度は通常約ｌＯ〜６０℃、好ましくは約
２０〜４５℃である。反応は通常約１０〜７２時間行う
。

酵素反応に用いられる反応溶媒としては、水又はリン酸
もしくはトリス塩酸等の緩衝液が好ましい。

この反応終了液からの２−ヒドロキシ酪酸の分離・精製
は、それ自体既知の方法、例えばエーテル抽出法、イオ
ン交換樹脂処理法等により行うことができる。

（発明の実施例）以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、こ
れらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものではな
い。

以下の実施例において、２−ヒドロキシ酪酸の定性はペ
ーパークロマトグラフのＲｆ値により、定量はガスクロ
マトグラフィー（島津ＧＣ−４Ｃ）により、旋光度の測
定は旋光度肝（日本分光製ＤＩＰ−１４０）により行っ
た。また、％と表したのは重量％を意味する。

実施例１下記培地組成Ａの培地１００Ｒ１！を５００１１ｔＩ容
三角フラスコに分注して１２０℃、１５分間滅菌処理し
たものに、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）ｓ
ｐ、ＨＡ−４２を一白金耳量接種し、３０℃にて２日間
振盪培養（前培養とする）後、上記と同じ培地組成Ａの
培地１０００−を５Ｉ２容三角フラスコに分注して１２
０℃、１５分間滅菌処理したものに上記前培養物２ＯＮ
ｌを接種したものを更に３０℃にて２日間振盪培養した
。

培養終了液１０００Ｒ１を遠心分離（１０，００゜ｒｐ
ｍ、　Ｉ　０分、４℃）し菌体な集め、該集菌体を１７
１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）５０ｍｌに懸濁後、
再び遠心分ｉｌ！　（１０，ＯＯＯｒｐｍ、　１０分、
４℃）して得た菌体を２−ヒドロキシ酪酸生成酵素源と
した。

反応液（１，２−ブタンジオール　２％、ｌ／１５Ｍリ
ン酸緩衝液、ｐＨ７，０）１００ｍｌに上記で調製した
２−ヒドロキシ酪酸生成酵素源５ｇ（湿菌体）を加え、
３０℃にて９時間反応を行ったところ１反応液中に２−
ヒドロキシ酪酸が８．１ｇ／β生成した。なお、反応液
から１，２−ブタンジオールを除いた反応液にて同様の
実験を行ったところ、２−ヒドロキシ酪酸の生成は認め
られなかった。

上記反応終了液から遠心分離（１０，００Ｏｒｐｍ、　
Ｉ　０分、４℃）にて菌体を分離した上清液５０１１１
を塩酸酸６性（ｐＨ２，０）に調整後、エーテル２０Ｏ
ＮＩを添加して抽出を行った。該エーテル相を分離後、
恒温水槽（５０℃）にてエーテルを除去し２−ヒドロキ
シ酪酸の精製物２５５ｍｇを得た。

この精製２−ヒドロキシ酪酸の比旋光度を測定したとこ
ろ、［α］　ｇ’＝−３，３５であることから、０体と
Ｌ体の生成比は、Ｄ　：　Ｌ＝３　：　７であり、生成
された２−ヒドロキシ酪酸は０体とＬ体の混合物である
ことが確認された。

１皿里或込１．２−ブタンジオール　　２　容量％酵母エキス　　
　　　　　　０．１　％ポリペプトン（ＮＨ４）　２ＨＰＯ４ＫＨ２ＰＯ。

ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０Ｆ７Ｈ２ＯＦｅ５Ｏｎ４ＨｉＯ・４）１ｔＯＺｎＳＯｎ・７ＨａＯＣｕＳＯ＜・５Ｈ＊ＯａＣｊａＣ０３蒸留水（ｐＨ［発明の効果］本発明によれば、安価なｌルかも高効率で安価に２−ヒすることができる。

０゜０゜０゜０゜２゜０゜７、０）５　　％６５％３５％０４％ｐｍｐｍｐｍ５　　　ｐｐｍｐｆｆｉ５　　％２−ブタンジオ− ドロキシ酪酸を製造

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属
し、１，２−ブタンジオールから２−ヒドロキシ酪酸を
生成する能力を有する微生物。
（２）請求項１記載の微生物を好気的に培養して得られ
る菌体又はその処理物の存在下、１，２−ブタンジオー
ルを水性溶媒中で反応させて、反応液中に２−ヒドロキ
シ酪酸を生成させた後、該反応液からＤＬ−２−ヒドロ
キシ酪酸を採取することを特徴とする２−ヒドロキシ酪
酸の製造法。