JPS6342692A - Ｌ−イソロイシンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は酵素法によるＬ−イソロイシンの製造法に関す
る。更に詳しくはＤ−α−アミノ酪酸をラセミ化する酵
素等を併用しＤ−α−アミノ酪酸又はＤＬ−α−アミノ
酪酸を原料としてＬ−イソロイシンを製造する方法に関
する。

（従来技術とその課題） Ｌ−イソロイシンは必須アミノ酸として人間及び動物の
栄養上重要な役割をするアミノ酸であり、医療、食品、
飼料強化剤としてその需要が近年急激に増加しつつある
。Ｌ−イソロイシンの工業的製造法としては醗酵法及び
酵素法が注目される。中でも本発明者が最近開発した酵
素法がα−アミノ酪酸とエタノールから効率良＜　Ｌ−
イソロイシンを製造することが出来るので特に注目され
る（特願昭６１−１３３７７３号）。

然しなから、この方法も工業的にみた場合、収率及びコ
ストの点更に改善を要する。

（発明の構成及び効果） 本発明者等は酵素法によるＬ−イソロイシンの製造法に
関し上記の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果本発
明に到達した。本発明の要旨は、「■［Ｌ−α−アミノ
酪酸又はＤＬ−α−アミノ酪酸を原料として、酵素反応
により、Ｌ−イソロイシンを生成する微生物の菌体若し
くはその処理物」及び ■「Ｄ−α−アミノ酪酸をラセミ化する酵素、該酵素を
含有する微生物の菌体又はその処理物」の存在下Ｄ−α
−アミノ酪酸又はＤＬ−α−アミノ酪酸を酵素反応によ
りＬ−イソロイシンとし、次いでこの反応液よりＬ−イ
ソロイシンを分離するＬ−イソロイシンの製造法。」で
ある。

本発明の方法によれば、　Ｌ−α−アミノ酪酸又はＤＬ
−α−アミノ酪酸を原料として酵素反応によりＬ−イソ
ロイシンを生成する微生物の菌体若しくはその処理物と
Ｄ−α−アミノ酪酸をラセミ化する酵素、該酵素を含有
する微生物の菌体又はその処理物とが相互に全く悪影響
を及ぼさないで、また目的物であるＬ−イソロイシンに
対しても全く悪影響を与えることなく、工業的に安価に
入手可能なりＬ−α−アミノ酪酸又はＤ−α−アミノ酪
酸から極めて高い生産性で効率良くＬ−イソロイシンが
製造出来る。

本発明に用いるＬ−α−アミノ酪酸又はＤＬ−α−アミ
ノ酪酸を原料として酵素反応によりＬ−イソロイシンを
生成する微生物としては、例えば、ブレビバクテリウム
・フラバム（ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｌＩｆｌａｖ
ｕ＋ｍ）　Ｍ　Ｊ　−２３３（微工研菌寄　第３０６８
号）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕ＋＊　　ｆｌａｖｕｓ＋）　ＭＪ−２３３
−ＡＢ−４１（微工研菌寄　第３８１２）、ブレビバク
テリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　
　ｆｌａｖｕｍ）　Ｍ　Ｊ　−２３３−ＡＢＴ−１１（
微工研菌寄　第８４２３号）等のブレビバクテリウム（
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｉ＊）属に属するエタノー
ル資化性微生物であり、本発明に好適に用いられる。

なお、上記の（微工研菌寄　第３８１２号）は（微工研
菌寄　第３０６８号）を親株としてＤＬ−α−アミノ酪
酸耐性を積極的に付与されたエタノール資化性微生物で
ある（特公昭５９−２８３９８号公報３〜４欄参照）。

（微工研菌寄　第８４２３号）は（徴工研菌寄　第３０
６８号）を親株としたＬ−α−アミノ酪酸トランスアミ
ナーゼ高活性変異株である（特願昭６０−１９０６０９
号明細書３〜５頁参照）。

本発明の酵素反応には、上記の微生物の菌体又はその超
音波破砕、固定化等による処理物が用いられる。更にこ
れらの微生物の菌体又はその処理物を公知の手法で固定
化したものも使用できる。

本発明の方法に用いるＤ−α−アミノ酪酸をラセミ化す
る酵素、該酵素を含有する微生物の菌体又は処理物は、
Ｄ−α−アミノ酪酸に作用し、目的物であるＬ−イソロ
イシンに作用しないものであり、例えばシュウトモナス
・プチダ（ＩＦＯｌ　２９９６）等の微生物の菌体又は
その処理物が用いられる。これら微生物の菌体又はその
処理物は固定化されているのが好ましく、固定化は例え
ばポリアクリルアミド、アルギン酸、に−カラギーナン
等による包括法あるいはＤＥＡＥ−セファデクス、ＤＥ
ＡＥ−セルロース等によるイオン結合法等のなかから適
宜選択することが出来る。

上述の本発明に用いる各微生物は、各酵素活性を向上さ
せた変異、遺伝子組み換え、細胞融合などの手法により
得られた微生物であってもよい。

Ｌ−α−アミノ酪酸又はＤＬ−α−アミノ酪酸生成する
微生物の菌体若しくはその処理物およびＤ−α−アミノ
酪酸をラセミ化する酵素、該酵素を含有する微化物の菌
体若しくはその処理物の存在下Ｄ−α−アミノ酪酸又は
ＤＬ−α−アミノ酪酸を酵素反応によりＬ−イソロイシ
ンとする本発明の方法を以下に説明する。

この酵素反応系には、少なくともＤ−α−アミノ酪酸又
はＤＬ−α−アミノ酪酸の他好ましくは更にエタノール
が含まれていればよく、その濃度は例えば反応の開始時
にα−アミノ酪酸は０．０１〜２０重量％、好ましくは
０．０５〜１０重量％程度である。また、反応液に添加
されるエタノールの濃度は０．１〜２０容量％が適当で
ある。

この酵素反応系には上記の２種の酵素又は酵素源が存在
するものであるが、これら２Ｎの酵素又は酵素源が反応
の始めから反応系に共存していてもよいし、反応の途中
でＤ−α−アミノ酪酸のラセミ化酵素又は酵素源を反応
系に添加することも出来る。

Ｌ−α−アミノ酪酸又はＤＬ−α−アミノ酪酸を原料と
してＬ−イソロイシンを生成する微生物の菌体又はその
処理物は酵素源であるが、この使用量は０．１〜２０重
量％好ましくは、１〜１０重量％程度である。

また、Ｄ−α−アミノ酪酸をラセミ化する酵素、該酵素
を含有する微生物の菌体又はその処理物の使用量は、０
．１〜５０重量％、好ましくは、１〜３０重量％程度で
ある。

この酵素反応系には上記の各成分の他に用いる酵素源と
しての微生物の特性に応じて必要により公知の無機塩や
グルコース等の炭素源等を加えることができる。

この反応は、ｐＨが５〜１０、好ましくは６〜９で行わ
れ、反応温度は通常の微生物を用いる場合には約１０〜
６０℃、好ましくは約２０〜４５℃であるが、酵素源と
して好熱性微生物などの特殊な微生物種の場合には、用
いる微生物に通する温度条件を選定しておこなわれる。

なお反応は通常約１０〜７２時間行われる。

酵素反応に用いられる反応溶媒は、水あるいはリン酸又
はトリス塩酸等の緩衝液が好ましい。

本発明に用いられる２種の微生物、即ち、Ｌ−α−７ミ
ノ酪酸からＬ−イソロイシンを生成する能力を有する微
生物、及びＬ−イソロイシンを基質とせずＤ−α−アミ
ノ酪酸のみをラセミ化する能力を有する微生物の調製法
を以下にのべる。

これら２種類の微生物の炭素源としては、例えばグルコ
ース、エタノール、メタノール、廃糖蜜等が、窒素源と
してはアンモニア、ｆＭ酸アンモニウム、塩化アンモニ
ウム、硝酸アンモニウム、尿素等がそれぞれ単独もしく
は混合して用いることが出来る。

無機塩としては、リン酸−水素カリウム、リン酸二水素
カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他に
菌の生育に必要であれば、ペプトン、肉エキス、酵母エ
キス、コーンステイープリカー、カザミノ酸、各種ビタ
ミン等の栄養素を培地に添加して用いることができる。

培養は通気攪拌、振盪等の好気的条件下で行い、培養温
度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃で行う。培
養途中のｐＨは５〜１０、好ましくは７〜８付近にて行
い、培養中のｐＨの調整には酸、アルカリを添加して行
うことができる。

なお、培養は通常１〜７日間、最適期間は３〜５日間で
ある。

以下に、Ｄ−α−アミノ酪酸のラセミ化酵素の調製例及
び本発明の実施例を示すが、Ｌ−イソロイシンの定性は
、ペーパークロマトグラフのＲｆ値、電気泳動法の易動
度、微生物定量法による生物活性値により確認した。定
量はロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏ
ｎｏｓｔｏｃ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＡＴＣＣ
８０４２を用いるマイクロバイオアッセイ法と高速液体
クロマトグラフィー（島原ＬＣ−５Ａ）とを併用して行
った。また、下記の実施例において％と表したのは重量
％を意味する。

参考例１　　（Ｄ−α−アミノ酪酸のラセミ化酵素の調
製） 下記培地組成への培地１００　ｍ　ｌを５００　ｍ　ｌ
容三角フラス咀に分注して１２０℃、１５分間滅菌処理
したものに、シュードモナス・プチダ（１１ｓｅｕｄｏ
＋ｎｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）　Ｉ　Ｆ　Ｏ１２９９６
を一白金耳量接種し、３０℃にて２４時間振盪培養（前
培養とする）後、上記と同じ培地組成Ａの培地１！を５
１容三角フラスコに分注し、１２０℃で１５分間滅菌処
理したものに上記前培養物の２０ｍ１を接種したものを
更に３０℃にて２４時間振盪培養した。

培養終了液ｌＩｌを遠心分離し菌体を築め、これを純水
に懸濁せしめて２０ｍ１とし、これに４゜２ｇのアクリ
ルアミド、０．２８ｇのＮ、Ｎ’−メチレン−ビス−ア
クリルアミド、４％β−（ジメチルアミノ）−プロピオ
ニトリル３　ｍ　ｌ！及び２％過塩素酸カリウム２ｍｌ
を加えて、室温に１５分間静置して反応させて菌体を保
有する重合物を得た。次いでこの重合物である反応生成
物を粉砕し、純水で洗浄することにより固定化菌体３０
ｇを得、これをＤ−α−アミノ酪酸ラセミ化酵素源とし
た。なお、菌体の固定化操作はすべて無菌操作で実施し
た。

培地組成　Ａ 肉エキス　　　　　　１％ ペプトン　　　　　　１％ ＮａＣ１Ｏ，５％ ｐＨ７，２ 実施例１ 尿素０．４％、硫酸アンモニュウム１．４％、Ｋ　Ｈ２
Ｐ　０４　０　、　０５％、Ｋ２　ＨＰ　０４　０．０
５％、Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７　Ｈ２００−０５％、Ｃａ
Ｃｌ！２・２Ｈ７０２ｐｐｍ、Ｆｅ５０＋　　・７Ｈ２
Ｏ２ｐｐｍ、ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２０２ｐｐｍ、Ｚｎ
５Ｏｔ　　・７Ｈ２０２ｐｐｍ、ＮａＣ７！２ｐｐｍ、
ビオチン２００．ｃｚｇ／ｆ、チアミン・ＨＣｆ１００
μｇ／β、カザミノ酸０．１％、酵母エキス０．１％か
らなる培地５０　ｍ　ｌ！を５００ｍ！容三角フラスコ
に分注し、滅菌（滅菌後ｐＨ７，Ｏ）した後、ブレビバ
クテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｗ
　ｆｌａｖｕｍ）　Ｍ　Ｊ　−２３３（微工研菌寄　第
３０６８号）を植菌し、無菌的にエタノールを１．５ｍ
ｌ１加え、３０℃にて３日間振盪培養を行った。培養終
了後４０００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離により菌体を
回収し、ＤＬ−α−アミノ酪酸からのＬ−イソロイシン
生成の酵素源とした。

反応液（ＤＬ−α−アミノ酪酸０．５ｍｇ、ピリドキサ
ールリン酸５μｇ、リン酸緩衝液１００μｗ＋ｏｌｅｓ
　、エタノールｌｏｍｇ、ｐＨ７，０を反応液１ｍｌ中
に含有）１００ｍｊ＋にこの菌体５ｇ及び参考例１で調
製した固定化菌体２０ｇを加え、３０℃にて２４時間反
応を行ったところＬ−イソロイシンの総生産量は４５ｍ
ｇであった。

反応液から菌体その他不純物を除いた濾液を、強酸性陽
イオン交換樹脂（Ｈ十　型）のカラムに通して、Ｌ−イ
ソロイシンを吸着させ、水洗後、０．５Ｎアンモニア水
で溶出したのち、Ｌ−イソロイシン画分を凝縮し、冷エ
タノールでＬ−イソ０イシンの結晶を析出させて３１ｍ
ｇの粗結晶を得た。なお、参考例１で調製した固定化菌
体を添加しない場合には、Ｌ−イソロイシンの総生成量
は３５ｍｇであった。

実施例２ 実施例１と同様の培地５０ｍ１を５００ｍｌ！容三角フ
ラスコに分注し、滅菌（滅菌後ｐＨ７，０）した後、ブ
レビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ　　ｆｌａｖｕｎ）　ＭＪ−２３３−ＡＢ−４１
（微工研菌寄　第３８１２号）を植菌し、３０℃にて３
Ｂ間振盪培養を行った。次にこの培養液を４００Ｏｒｐ
ｍ、１５分間の遠心分離により菌体を回収した。

実施例１と同様な反応液１００ｍ１！に上記で得た菌体
５ｇ及び参考例１で調製した固定化菌体２０ｇを加え、
３０℃、２４時間反応をおこなったところ、１．−イソ
ロイシンの総生産量は５５ｍｇであった。一方、固定化
菌体を添加しない場合の総４１−成量は４１ｍｇであっ
た。

実施例３ 実施例１と同様の操作にてブレビバクテリウム・フラバ
ム（ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｌｌＩｆｌａｖｕｓ）
　Ｍ　Ｊ　−２３３−ＡＢＴ−１１（微工研菌寄　第８
４２３号）を培養後遠心分離により菌体を回収した。実
施例１と同様な反応液１００ｍｊ＋に上記で得た菌体５
ｇ及び参考例１で調製した固定化菌体２０ｇを加え、３
０℃、２４時間反応をおこなったところ、Ｌ−イソロイ
シンの総生成量は６１ｍｇであった。一方、固定化菌体
を添加しない場合の総生成量は、３５ｍｇであった。

実施例４ 実施例１と同様にして調製したブレビバクテリウム・フ
ラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｆｌａｖｕ
＋ｍ）　Ｍ　Ｊ−２３３（微工研菌寄　第３０６８号）
の菌体５ｇを反応液（Ｄ−α−アミノ酪酸０．５ｍｇ、
ピリドキサールリンｗ１５μｇ、リン酸緩衝液１００μ
ｍｏｌｅｓ　、エタノール１０ｍｇ、、ｐＨ７，０を反
応液１ｍ７！中に含有）１００ｍｌ！に加え、更に参各
側１で調製した固定化菌体２０ｇを加え、３０℃にて２
４時間反応を行ったところＬ−イソロイシンの総生産量
は３　Ｑｍｇであった。一方、固定化菌体を添加しない
場合の総生産量は２．５ｍｇであった。

実施例５ 実施例２と同様にして調製したブレビバクテリウム・フ
ラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｆｌａｖｕ
ｗ）　Ｍ　Ｊ−２３３−ＡＢ−４１（微工研菌寄　第３
８１２号）を用いて、実施例４と同様の反応液にて３０
℃、２４時間反応を行ったところ、Ｌ−イソロイシンの
総生産量は３５ｍｇであった。一方、固定化菌体を添加
しない場合の総生産量は７　ｍ　ｇであった。

実施例６ 実施例３と同様にして調製したブレビバクテリウム・フ
ラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｗ　　ｆｌａｖｕ
ｍ）　Ｍ　Ｊ−２３３−ＡＢＴ−１１（＋１［工研菌寄
　第８４２３号）を用いて、実施例４と同様の反応液に
て３０℃２４時間反応を行ったところ、Ｌ−イソロイシ
ンの総生産量は４２ｍｇであった。一方、固定化菌体を
添加しない場合の総生産量は２．７ｍｇであった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）［１］「Ｌ−α−アミノ酪酸又はＤＬ−α−アミ
   ノ酪酸を原料として、酵素反応により、Ｌ−イソロイシ
   ンを生成する微生物の菌体若しくはその処理物」及び ［２］「Ｄ−α−アミノ酪酸をラセミ化する酵素、該酵
   素を含有する微生物の菌体又はその処理物」の存在下Ｄ
   −α−アミノ酪酸又はＤＬ−α−アミノ酪酸を酵素反応
   によりＬ−イソロイシンとし、次いでこの反応液よりＬ
   −イソロイシンを分離するＬ−イソロイシンの製造法。