JPH02295491A

JPH02295491A - Ｌ―イソロイシンの製造方法

Info

Publication number: JPH02295491A
Application number: JP11486889A
Authority: JP
Inventors: Masato Terasawa; 真人寺沢; Shoichi Nara; 昭一奈良; Makoto Goto; 誠後藤; Hideaki Yugawa; 英明湯川
Original assignee: Mitsubishi Petrochemical Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Petrochemical Co Ltd
Priority date: 1989-05-08
Filing date: 1989-05-08
Publication date: 1990-12-06

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、Ｌ−イソロイシンの製造方法に関し、さらに
詳しくは、Ｌ−イソロイシンを副生物の生成を抑制して
高収量で製造する方法に関する。

Ｌ−イソロイシンは必須アミノ酸の１つであり、人間及
び動物の栄養上重要な役割を果すアミノ酸として、医薬
品、食品、飼料添加物等に配合されており、近年その需
要が急激に増加しつつある。

し従来の技術］Ｌ−イソロイシンは、他のアミノ酸と同様に立体異性体
が存在するため、化学的に合成することは一般には困難
であり、工業的には主として発酵法により生産されてい
る。例えば、ＤＬ−α−アミノ酪酸、スレオニン等のし
−イソロイシンの前駆物質中で発酵を行なう方法（特公
昭４　３−８　７０９号公報、特公昭４　（１−２　８
　８　０号公報等参照）；かかる前駆物質を用いない所
謂直接発酵による方法（特公昭３８−７０９１号公報、
特開昭４　９−９　３　５　８　６号公報等参照）等が
採用されている。

一方、酵素法としては、例えば、アンモニウムイオン又
はイソロイシン以外のし一若しくはＤＬアミノ酸の存在
下に、Ｄ−、Ｌ−若しくはＤＬα−ケトーβ−メチル吉
草酸からＬ−イソロイシンを製造する方法（特公昭４　
６−２　９　７　８　９号公報参照）；アンモニウムイ
オン又はイソロイシン以外のＬ一若しくはＤＬ−アミノ
酸の存在下に、Ｄ−イソロイシン又はＤ−γ口イソロイ
シンの単独若しくは混合物又はこれらとその光学異性体
との適宜混合物を変換してＬ−イソロイシンを製造する
方法（特公昭４　６−２　９　７　８　８号公報参照）
；セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）　＠細菌の固定化物を
用いてグルコースとＤ−スレ才ニンからし−イソロイシ
ンを製造する方法（日本醗酵工学会大会講演要旨集、４
７〜４８頁、昭和５２年度）等が報告されている。

しかしながら、これらの方法は原料コストが嵩む、収率
が低い等の問題があり、充分に満足しうるちのではない
。

また本発明者らは先に、コリネ型細菌に属するエタノー
ル資化性を有するビオチン要求性微生物の菌体若しくは
その処理物又はそれらの固定化物の存在下に、エタノー
ル及びα−アミノ酪酸を含有する水溶液を酵素反応させ
て、反応液中にＬ−イソロイシンを生成せしめ、これか
らし−イソロイシンを採取することを特徴とするし−イ
ソロイシンの製造法（特開昭６３−１１２９９１号公報
参照）を提案した。

［発明が解決しようとする課題コ本発明者らは、先に提案した上記の方法について、Ｌ−
イソロイシンをさらに高収率で取得すべく改良研究を行
なっている過程で、酵素反応液中に〇一エチルホモセリ
ンが副生じ、この物質が反応液からのし−イソロイシン
の分離精製を煩雑にし、Ｌ−イソロイシンの回収率を低
下させていることを究明した。そこで、本発明者らは、
酵素反応液中における０−エチルホモセリンの副生を抑
制すれば、Ｌ−イソロイシンの収率を向上させうると考
え、その抑制方法につき鋭意検討を重ねた結果、前述し
たコリネ型細菌に属するビオチン要求性微生物の菌体又
はその処理物を用いる酵素反応法によるし−イソロイシ
ンの製造を、反応液中のエタノール濃度を０．０１〜０
．６容量％の範囲に維持する条件下に実施すれば、０−
エチルホモセリンの副生が大幅に低減し、酵素反応液か
らのＬイソロイシンの分離精製が容易となり、Ｌ−イソ
ロイシンの収率も向上させうろことが見出され、本発明
を完成するに至った。

［課題を解決するための手段］かくして、本発明によれば、コリネ型細菌に属するエタ
ノール資化性を有するビオチン要求性微生物の菌体又は
その処理物の存在下に、Ｌ一若しくはＤＬ−α−アミノ
酪酸、α−ケト酪酸、Ｌ−若しくはＤＬ一α−ヒドロキ
シ酪酸、又はそれらの塩より選ばれる酪酸誘導体を、水
性エタノール溶液中で酵素反応せしめてＬ−イソロイシ
ンを製造するに当り、反応溶液中のエタノール濃度を０
．０１〜０．６容量％の範囲に維持しつつ酵素反応せし
めることを特徴とするし−イソロイシンの製造方法（以
下、これを「酵素反応法」という）が提供される。

以下、本発明の方法についてさらに詳細に説明する。

本発明の方法において使用される微生物は、コリ不型細
菌に属するビオチン要求性微生物であり、好ましくはエ
タノール資化性を有するものである。

その中には、Ｌ−イソロイシン生産菌も含まれる。

そのような微生物の具体例としては、プレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅ
ｒ−ｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ）　Ｍ　Ｊ　−　２　３　３
　［微工研条寄第１４９７号（微工研菌寄第３０６８号
より移管）］、プレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅ
ｖｉｂａｃｔｅｒ−ｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ）　ＭＪ−２
　３　３−ＡＢ−４　１　［微工研条寄第１４９８号（
微工研菌寄第３８１２号より移管）］、プレビバクテリウム・フラバム（３ｒ６ｙｉｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ）　ＭＪ　−　２　３　３−Ａ
ＢＴ　−　１　１　［微工研条寄第１５００号（微工研
菌寄第８４２３号より移管）］、プレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅ
ｒ−ｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ）　ＭＪ−２　３　３−ＡＢ
Ｄ−２　１　［微工研条寄第１４９９号（微工研菌寄第
８０５５号より移管）］等が挙げられ、これらの菌が本発明において好適に用いら
れる。

なお、上記の微工研条寄第１４９８号の菌株は、微工研
条寄第１４９７号の菌株を親株としてＤＬ一α−アミノ
酪酸耐性を積極的に付与されたエタノール資化性微生物
である（特公昭５　９−２　８　３９８号公報第３〜４
欄参照）。また、微工研条寄＄１５Ｃｔｏ号の菌株は、
微工研条寄第１４９７号の菌株を親株としたし−α−ア
ミノ酪酸トランスアミナーゼ高活性変異株である（特開
昭６２−５１９９８号公報参照）。さらに、微工研条寄
第１４９９号の菌株は、微工研条寄第１４９７号の菌株
を親株としたＤ−α−アミノ酪酸デアミナーゼ高活性変
異株である（特開昭６１−１７７９９３号公報参照）。

これらの微生物の他に、プレビバクテリウム・アンモニ
アゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎ
ｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６　８　７　１、同ＡＴＣＣ
　　１３７４５、同ＡＴＣＣ１３７４６．プレビバクテ
リウム・デバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
　ｄｉｖａｒｉｃａｔｃｏ＋＋）　ＡＴＣＣ１４０２０
等を用いることもできる。

以上に述べたプレビバクテリウム属に属するビオチン要
求性徴生物の培養は、通常の方法に従い、エタノールを
主炭素源とし、そしてさらに窒素源、無機塩等の栄養分
を含む培地を用いて行なうことができる。

培地に含ませうる窒素源としては、微生物の培養に際し
て通常使用しつる窒素含有の有機又は無機物質、例えば
、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、
硝酸アンモニウム、尿素等ヲ単独若しくは混合して用い
ることができ、また、無機塩としては、例えば、リン酸
一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシ
ウム等を用いることができる。この他に菌の生育及びＬ
−イソロイシンの生成に必要であれば、ペブトン、肉エ
キス、酵母エキス、コーンステイーブリカーカザミノ酸
、各種ビタミン等の栄養素を培地に添加し用いることが
できる。

培養は通気攪拌、振盪等の好気的条件下で行なわれ、培
養温度は一般に２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃
が好適である。

本発明の方法を実施する場合、上記の如く培養．するこ
とにより得られる培養物から菌体を集め、水や適当な緩
衝液で洗浄した後そのまま使用することができる。ある
いは該菌体をそれ自体既知の方法で固定化し固定化物と
して使用することができる。微生物菌体の固定化法とし
ては、例えば、アクリルアミド等の重合性モノマーを用
いる方法、アルギン酸塩やカラギーナン等の適当な単体
を用いて不溶化させる方法等が挙げられる。

本発明による酵素反応法は、上記の如き微生物菌体又は
その処理物の存在下に、前述の酪醗誘導体を水性エタノ
ール溶液中で酵素反応させることにより実施される。こ
の時、反応液中におけるエタノールの濃度は０．０１〜
０．６容量％、好ましくは０．１〜０．５容１％の範囲
内に維持される。

水性反応液中へのエタノールの添加は、反応液中のエタ
ノール濃度が上記の範囲内であるかぎり、連続的に行っ
てもよく、あるいは間欠的に行うこともできる。

該水性反応液は、エタノールを含有する水あるいはリン
酸又はトリス塩酸等の緩衝液であることもできるが、好
ましくはエタノールを含み、さらに窒素源及び／又は無
機塩類を含む水溶液が用いられる。

本発明の方法において、水性酵素反応液中に添加しうる
窒素源及び／又は無機塩類としては、通常の微生物菌体
の培養に際して使用される培地に添加されるものから選
んで使用することができる。

ただし、この場合ビオチンを含まないものを用いるのが
望ましい。

上記水性反応液中に含ませうる窒素源の具体例としては
、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、
硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機窒素源
等を例示することができ、また、無機塩としては、リン
酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネ
シウム、硫酸マンガン、硫酸鉄等を例示することができ
る。これらの窒素源及び無機塩は、単独でも２種以上混
合して用いることもできる。

これら窒素源及び／又は無機塩の水性反応液中の濃度は
、通常の微生物菌体の培養に使用される培地におけると
同程度の範囲とすることができ、特に限定されない。

このような反応液の一例を示すと、（ＮＨ．）　２３０
．２ｇ／β；　　ＫＨ．ＰＯ４　０．　５　ｇ／　１２
　；　Ｋ２ＨＰＯ４　　０．　５　ｇ／ｆｌ　；！Ｊｇ
ＳＬ４｝ＩＪ　　０．５　ｇ／ｉ　；ＦｅＳ［］４−７
Ｈｚ０２　０　ｐｐｍ　；　ＭｎＳＯ＜　・４〜６Ｈ２
０　　２　０　１］Ｉ）ｍ含有するｐ｝１７．６の水溶
液が挙げられる。

さらに、上記の水性反応液にはビオチンを含有しないア
ミノ酸、ビタミン、糖類等を添加することもできる。

水性反応液中における前記のし一若しくはＤＬα−アミ
ノ酪酸、α−ケト酪酸、Ｌ一若しくはＤＬ一α−ヒドロ
キシ酪酸、又はそれらの塩より選ばれる酪酸透導体の反
応時の濃度は、特に制限はないが、一般には０．１〜２
０％（ｗｔ／ｖｏｌ　）、好ましくは０．　２〜５％（
ｗｔ／ｖｏｌ　）の範囲内が適当である。

酵素反応に使用されうる上記酪酸誘導体の塩としては、
ナトリウム及びカリウム等のアルカリ金属塩頚、カルシ
ウム等のアルカリ土類金属塩、又はアンモニウム塩等が
挙げられ、それらの中でもナトリウム塩が好適に用いら
れる。ただし、ＤＬ一α−アミノ酪酸は、塩の状態での
使用も可能であるが、好ましくは酸の状態での使用が適
当である。

一方、水性反応液中に存在せしめられる微生物菌体又は
その処理物の濃度もまた特に制限されるものではないが
、一般には１〜５０％（ｗｔ／ｖｏｌ）、好ましくは２
〜２０％（ｗｔ／ｖｏｌ　）の範囲内で存在させるのが
好都合である。

本発明による酵素反応は、一般に約２０〜約５０℃、好
ましくは約３０〜約４０℃の温度で、通常約１０〜約７
２時間行われる。

以上に述べた酵素反応法により反応液中に生成するし−
イソロイシンの反応液からの分離・精製は、それ自体既
知の方法に従い、例えば、イオン交換樹脂処理法、沈殿
法等を適宜組合わせて行なうことができる。

次に実施例を挙げて本発明の方法をさらに具体的に説明
する。

［実施例］下記実施例において、０−エチルホモセリン及びＬ−イ
ソロイシンの定性はペーパークロマトグラフのＲｆ値又
は電気泳勤法の易勤度により、定１は高速液体クロマト
グラフィー（島津ＬＣ−５Ａ）を用いて行った。またエ
タノールの定量はガスクロマトグラフィー（島津ＧＣ−
３８Ｆ）を用いて行った。なお、下記の実施例において
、％はｗｔ／ｖｏｌ％を意味する。

実施例１培地（尿素０．４％、硫酸アンモニウム１．４％、Ｋ８
２ＰＯ．　　０．　０　５％、Ｋ２ＨＰＯ４０．　０　
５％、！ＪｇＳＯ４・７Ｈ２０　　０．０５％、ＣａＣ
ｊ！　２　・２Ｈ２０　　２　ｐｐｍ　，　ＦｅＳＬ・
７Ｈ２０　　２ｐｐｍ，ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２０　　
２ｐｐｍＳｌｎｓＯ，・７Ｌ０　　２ｐｐｍ　，　Ｎａ
Ｃｊ！　２ｐｐｍ　，ビオチン２００μｇ／β、チアミ
ン・ＨＣｆ１００μｇ／Ｉｔ、カサ゛ミノ酸０．１％、
酵母エキス０．１％）１００ｍｊ２を５００ｍｊ！容三
角フラスコに分注、滅菌した後（滅菌後のｐＨ７．０）
、プレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ　）　Ｍ　Ｊ　−　２　３　
３（微工研条寄第１４９７号）を植菌し、無菌的にエタ
ノール２ＩＴｌ１を加え、３０℃にて２日間振盪培養を
行った。

次に、本培養培地（硫酸アンモニウム２．３％、ＫＨ２
Ｐ０．　　０．　０　５％、Ｋ２ＨＰＯ．　　０．　０
　５％、ＭｇＳＯ４・７１｛２０　　０．０５％、Ｆｅ
ＳＯ＜　・７｝１２０　　２　０　ｐｐｍ　，　ＭｎＳ
Ｏ４・ｎＬ０　　２　０ｐｐｍ　％ビオチン２００μｇ
／ｌ，チアミン・ＨＣＩｌ　１００μｇ／β、カザミノ
酸０．３％、酵母エキス０．３％）１０００ｍｊ２を２
２容通気攪拌総に仕込み、滅菌（１２０℃、２０分間）
後、エタノールの２０ｍＩｌと前記前培養物の２０ｍｌ
を添加して、回転数１　０　０　Ｏ　ｒｐｍ　，通気量
ＩＶＶｍ　％温度３３℃、ｐＨ７．６にて４８時間培養
を行った。

なお、培養中のエタノールは、培地中におけるその濃度
が２容量％を越えないように、約１〜２時間ごとに断続
的に添加した。

培＃終了後、培養物５００ｍｊ２から遠心分離にて集菌
した。これを脱塩蒸留水にて２度洗浄して得た菌体を、
反応液〔（Ｎｌ｛．）　２ＳＯ．　２．　３％、ＫＩＩ
．ＰＯ．０．０５％、Ｋ２ＨＰＯ．　　０．　０　５％
、！Ｊ　ｇ　Ｓ　０　４・７Ｈ２０　０．０５％、Ｆｅ
ＳＯ４・７Ｈ２０　　２　０　ｐｐｍ　、！ＪｎＳＯ４
Ｈ　４〜６ＨＪ２　０　ｐｐｍ　，チアミン・ＨＣｆ２
　　１００μｇ／ｊ！（ｐＨ７．６）１　　１０００　
ｍｆｌに懸濁後、該懸濁液を２！容通気攪拌槽に仕込み
、さらにエタノールを０．１又は０．５容量％添加後Ｄ
Ｌ−α一丁ミノ酪酸１％、α−ケト酪酸ナトリウム０．
５％又はＤＬ一αーヒドロキシ酪酸ナトリウム１％を添
加して、回転数３０Ｏｒｐｍ、温度３３℃、ｐＨ７、６
　（２５％アンモニア水にて調節）にて１５時間反応を
行った。

なお、各実験区における反応液中のエタノールは、全量
で２容量％を、その濃度が０．１又は０．　５容量％を
越えないように維持しながら、約１〜２時間の間隔で逐
次添加した。

反応終了後、遠心分離（４０００ｒｐｍ、１５分間、４
℃）にて除菌した上浦液中の〇一エチルホモセリン及び
Ｌ−イソロイシンを定量した。

なお、比較例としては反応開始時にエタノールを２容１
％添加した以外は同様の条件で反応を行った。その結果
を第１表に示した。

実施例２菌体としてプレビバクテリウム・フラノイム（Ｂｒｅｖ
ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ　）　ＭＪ　−　
２　３　３−ＡＢ４１　（微工研条寄第１４９８号）を
用いた以外は実施例１と同様の条件で摸作を行った。そ
の結果を第２表に示した。

（以下余白）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）コリネ型細菌に属するエタノール資化性を有する
ビオチン要求性微生物の菌体又はその処理物の存在下に
、Ｌ−若しくはＤＬ−α−アミノ酪酸、α−ケト酪酸、
Ｌ−若しくはＤＬ−α−ヒドロキシ酪酸、又はそれらの
塩より選ばれる酪酸誘導体を、水性エタノール溶液中で
酵素反応せしめてＬ−イソロイシンを製造するに当り、
反応液中のエタノール濃度を０．０１〜０．６容量％の
範囲に維持しつつ酵素反応せしめることを特徴とするＬ
−イソロイシンの製造方法。