JP2716473B2

JP2716473B2 - Ｌ‐イソロイシンの製造方法

Info

Publication number: JP2716473B2
Application number: JP21371088A
Authority: JP
Inventors: 真人寺沢; 富士雄遠藤; 昭一奈良; 和通四方; 恒山縣; 英明湯川
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1988-08-30
Filing date: 1988-08-30
Publication date: 1998-02-18
Anticipated expiration: 2013-02-18
Also published as: JPH0265786A

Description

【発明の詳細な説明】本発明はＬ−イソロイシンの製造方法に関し、さらに
詳しくは、微生物菌体内の酵素反応系を利用する方法に
よりＬ−イソロイシンを副生物の生成を抑制して高収量
で製造する方法に関する。

Ｌ−イソロイシンは必須アミノ酸の１つであり、人間
及び動物の栄養上重要な役割を果すアミノ酸として、医
薬品、食品、飼料添加物等に配合されており、近年その
需要が急激に増加しつつある。

Ｌ−イソロイシンは、他のアミノ酸と同様に立体異性
体が存在するため、化学的に合成することは一般には困
難であり、工業的には主として発酵法により生産されて
いる。例えば、DL−α−アミノ酪酸、スレオニン等のＬ
−イソロイシンの前駆物質中で発酵を行なう方法（特公
昭43−8709号公報、特公昭40−2880号公報等参照）；か
かる前駆物質を用いない所謂直接発酵による方法（特公
昭38−7091号公報、特開昭49−93586号公報等参照）等
が採用されている。

一方、酵素法としては、例えば、アンモニウムイオ
ン、またはイソロイシン以外のＬ−もしくはDL−アミノ
酸の存在下にＤ−、Ｌ−またはDL−α−ケト−β−メチ
ル酪酸からＬ−イソロイシンを製造する方法（特公昭46
−29789号公報参照）；アンモニウムイオン、またはイ
ソロイシン以外のＬ−もしくはDL−アミノ酸の存在下に
Ｄ−イソロイシンまたはＤ−アロイソロイシンの単独も
しくは混合物またはこれらとその光学異性体との適宜混
合物に作用させてＬ−イソロイシンを製造する方法（特
公昭46−29788号公報参照）；セラチア（Serratia）属
細菌の固定化物を用いてグルコースとＤ−スレオニンか
らＬ−イソロイシンを製造する方法（日本醗酵工学会大
会講演要旨集、47〜48頁、昭和52年度）等が報告されて
いる。

しかしながら、これらの方法は、原料コストが嵩む、
収率が低い等の問題があり、充分に満足しうるものでは
ない。

また、本発明者らは先に、ブレビバクテリウム（Brev
ibacterium）属に属するビオチン要求性の微生物菌体の
存在下に、α−ケト酪酸又はその塩を少なくともエタノ
ールを含有する水溶液にて酵素反応させて該溶液中にＬ
−イソロイシンを生成せしめ、それからＬ−イソロイシ
ンを採取することからなるＬ−イソロイシンの製造法
（特願昭62−103980号）を提案した。

本発明者らは、先に提案した上記の方法につき、Ｌ−
イソロイシンをさらに高収率で取得すべく改良研究を行
なっている過程で、酵素反応溶液中にノルバリンが副生
し、この物質が反応液からのＬ−イソロイシンの分離精
製を煩雑にし、Ｌ−イソロイシンの回収率を低下させて
いることを究明した。そこで、本発明者らは、酵素反応
溶液中におけるノルバリンの副生を抑制すれば、Ｌ−イ
ソロイシンの収率を向上させうると考え、その抑制方法
につき鋭意検討を重ねた結果、今回、前述したコリネ型
細菌に属するビチオン要求性微生物又はその処理物の存
在下に基質としてα−ケト酪酸又はその塩を用いて微生
物菌体内の酵素反応系によりＬ−イソロイシンを製造す
るに際して、反応基質であるα−ケト酪酸の反応溶液中
における濃度が常に30mMを越えないようにα−ケト酪酸
又はその塩を添加すると、ノルバリンの副生量を大幅に
低減し、酵素反応液からのＬ−イソロイシンの分離精製
が容易となり、Ｌ−イソロイシンの収率も向上させうる
ことが見出され、本発明を完成するに至った。

かくして、本発明によれば、コリネ型細菌に属するビ
チオン要求性微生物の菌体又はその処理物の存在下にα
−ケト酪酸又はその塩を水性エタノール溶液中で酵素反
応せしめてＬ−イソロイシンを製造するに当り、α−ケ
ト酪酸又はその塩を水性エタノール溶液中におけるその
濃度が30mMを越えないように添加することを特徴とする
Ｌ−イソロイシンの製造方法が提供される。

以下、本発明の方法につきさらに詳細に説明する。

本発明の方法において使用される微生物は、コリネ型
細菌に属するビチオン要求性微生物であり、例えば、コ
リネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌、ブレビ
バクテリウム（Brevibacterium）属細菌、アルスロバク
ター（Arthrobacter）属細菌等が含まれる。これらの微
生物のうちで特にエタノール資化性を有しているものが
好ましく、その中にはＬ−イソロイシン生産菌も含まれ
る。そのような微生物の具体例としては、ブレビバテリウム・フラバム（Brevibacterium flavu
m）MJ233（微工研条寄第1497号）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium fla
vum）MJ233−AB−41（微工研条寄第1498号）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium fla
vum）MJ233−ABT−11（微工研条寄第1500号）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium fla
vum）MJ233−ABD−21（微工研条寄第1499号）、等が挙げられ、これらの菌が本発明において好適に用いら
れる。

なお、上記の微工研条寄第1498号の菌株は、微工研条
寄第1497号の菌株を親株としてDL−α−アミノ酪酸耐性
を積極的に付与されたエタノール資化性微生物である
（特公昭59−28398号公報第３〜４欄参照）。また、微
工研条寄第1500号の菌株は、微工研条寄第1497号の菌株
を親株としたＬ−α−アミノ酪酸トランスアミナーゼ高
活性変異株である（特願昭60−190609号明細書３〜５頁
参照）。さらに、微工研条寄第1499号の菌株は微工研条
寄第1497号の菌株を親株としたＤ−α−アミノ酪酸デア
ミナーゼ高活性変異株である（特開昭61−177993号公報
参照）。

これらの微生物の他に、ブレビバクテリウム・アンモ
ニアゲネス（Breibacterium ammoniagenes）ATCC6871、
同ATCC13745、同ATCC13746;ブレビバクテリウム・デバ
リカタム（Brevibacterium divaricatum）ATCC14020等
を用いることもできる。

以上に述べた如きコリネ型細菌に属するビオチン要求
性微生物の培養は、通常の方法に従い、エタノールを主
炭素源とし、そしさらに窒素源、無機塩等の栄養分を含
む培地を用いて行なうことができる。

培地に含ませうる窒素源としては、微生物の培養に際
して通常使用しうる窒素含有有機又は無機物質、例え
ば、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、尿素等を単独若しくは混合して
用いることができ、また、無機塩としては、例えば、リ
ン酸−水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグ
ネシウム等を用いることができる。この他の菌の生育及
びＬ−イソロイシンの生成に必要であれば、ペプトン、
肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー、カザ
ミノ酸、各種ビタミン等の栄養素を培地に添加し用い
る。

培養は通気撹拌、振盪等の好気的条件下で行なわれ、
培養温度は一般に20〜40℃、好ましは25〜35℃の範囲内
とすることができる。また、培地のpHは通常５〜10の範
囲、好ましくは７〜８付近が適当であり、培養中のpHの
調整は培地に適宜酸又はアルカリを添加して行なうこと
ができる。

培養開始時のエタノール濃度は好ましくは１〜５容量
％，更に好ましくは２〜３容量％の範囲内が適当であ
る。培養期間は通常２〜９日間、好ましくは４〜９日間
である。

本発明の方法を実施する場合、上記の如く培養するこ
とにより得られる培養物から菌体を集め、水や適当な緩
衝液で洗浄した後そのまま使用することができる。或い
は該菌体をそれ自体既知の方法で固定化し固定化物とし
て使用することができ、又は該菌体を超音波、圧搾等の
手段で破砕し、その破砕物もしくはそれをさらにそれ自
体既知の方法で固定化した固定化酵素を使用することも
できる。微生物菌体又はその破砕物の固定化法として、
或いは、例えば、アクリルアミド等の重合性モノマーを
用いる方法、アルギン酸塩やカラギーナン等の適当な担
体を用いて不溶化させる方法等が挙げられる。

本発明に従う方法は、上記の如き微生物菌体又はその
処理物の存在下に、α−ケト酪酸又はその塩が水性エタ
ノール溶液中で反応せしめられる。上記水性エタノール
溶液中におけるエタノールの濃度は一般に0.5〜40容量
％，好ましくは１〜20容量％の範囲内とすることができ
る。

該水性溶液は、エタノールを含有する水あるいはリン
酸又はトリス塩酸等の緩衝液であることもできるが、好
ましくはエタノールを含み更に窒素源及び／又は無機塩
類を含む水溶液が用いられる。

本発明の方法において、酵素反応系に添加しうる窒素
源及び／又は無機塩類としては、通常の微生物菌体の培
養に際して使用される培地に添加されるものから選んで
使用することができる。ただし、この場合、菌体の増殖
を抑制するため、ビオチンを含まないものを用いるのが
望ましい。

上記水性溶液中に含ませうる窒素源の具体例として
は、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機窒
素源等を例示することができ、また、無機塩としては、
リン酸−水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マ
グネシウム、硫酸マンガン、硫酸鉄等が挙げられる。こ
れらの窒素源及び無機塩は、単独でも２種以上混合して
用いることもできる。

これら窒素源及び／又は無機塩の水素溶液中の濃度
は、通常の微生物菌体の培養に使用される培地における
と同程度の範囲とすることができ、特に限定されない。

このような反応液の一例を示すと、（NH₄）₂SO₄2g/
;KH₂PO₄0.5g/;K₂HPO₄0.5g/;MgSO₄・7H₂O0.5g/;
FeSO₄・7H₂ 20ppm;MnSO₄・４〜6H₂O 20ppm含有するpH
7.6の水溶液が挙げられる。

さらに、上記水性溶液にはビオチンを含有しないアミ
ノ酸、ビタミン、糖類等を添加することもできる。

α−ケト−酪酸又はその塩の反応液の添加は、反応液
（水性エタノール溶液）中のα−ケト酪酸の濃度が常に
30mMを越えず、好ましくは20mMを越えないように行な
う。添加は上記濃度を越えない限り連続的に行なっても
よく、或いは間欠的に行なうこともできる。

なお、本明細書において反応液中のα−ケト酪酸の濃
度は、高速液体クロマトグラフイーにより測定した値で
ある。

反応に使用されうるα−ケト酪酸の塩としては、例え
ば、α−ケト酪酸ナトリウム、α−ケト酪酸アンモニウ
ム、α−ケト酪酸カルシウム、α−ケト酪酸カリウム等
が挙げられ、中でもα−ケト酪酸ナトリウムが好適であ
る。

一方、水性溶液中に存在せしめられる微生物菌体又は
その処理物の濃度もまた特に制限されるものではない
が、一般には１〜50％（wt/vol）、好ましくは２〜20％
（wt/vol）の範囲内で存在させるのが好都合である。

本発明に従う酵素反応は、一般に約20〜約50℃、好ま
しくは約30〜約40℃の温度で、常温約10〜約72時間行わ
れる。

以上に述べた酵素反応により反応液中に生成するＬ−
イソロイシンの反応液からの分離・精製は、それ自体既
知の方法に従い、例えばイオン交換樹脂処理法、沈殿法
等を適宜組合わせて行なうことができる。

次に実施例を挙げて本発明の方法をさらに具体的に説
明する。下記実施例において、ノルバリン及び−Ｌ−イ
ソロイシンの定性はペーパークロマトグラフのRf値、電
気泳動法の移動度より行なった。また定量は高速液体ク
ラマトグラフイー（島津LC−5A）を用いて行った。な
お、下記の実施例において％は重量％を意味する。

実施例１培地（尿素0.4％、硫酸アンモニウム1.4％、KH₂PO₄
0.05％、K₂HPO₄ 0.05％、MgSO₄・7H₂O 0.05％、CaCl₂・
2H₂O 2ppm、FeSO₄・7H₂O 2ppm、MnSO₄・４〜6H₂O 2pp
m、ZnSO₄・7H₂O 2ppm、NaCl 2ppm、ビオチン 200μg/
，チアミン・HCl 100μg/，カザミノ酸 0.1％、酵
母エキス 0.1％）100mlを500ml容三角フラスコに分注、
滅菌（滅菌後pH7.0）した後、ブレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233（微工研条寄
第1497号）を植菌し、無菌的にエタノールを2ml加え、3
0℃にて２日間振盪培養を行った。

次に、本培養培地（硫酸アンモニウム2.3％、KH₂PO₄
0.05％、K₂HPO₄ 0.05％、MgSO₄・7H₂O 0.05％、FeSO₄・
7H₂O 20ppm、MnSO₄・nH₂O 20ppm、ビオチン 200μg/
、チアミン・HCl 100μg/、カザミノ酸 0.3％、酵
母エキス 0.3％）1000mlを２容通気撹拌槽に仕込み、
滅菌（120℃、20分間）後、エタノールの20mlと前記前
培養物の20mlを添加して、回転数1000rpm、通気量1vv
m、温度33℃pH7.6にて48時間培養を行った。

なお、エタノールは、培養中培地の濃度が２容量％を
越えないように、約１〜２時間ごとに断続的に添加し
た。

培養終了後、培養物500mlから遠心分離にて集菌し
た。これを脱塩蒸留水にて２度洗浄して得た菌体を、反
応液［（NH₄）₂SO₄2.3％、KH₂PO₄ 0.05％、K₂HPO₄ 0.05
％、MgSO₄・7H₂O 0.05％、FeSO₄・7H₂O 20ppm、MnSO₄・
４〜6H₂O 20ppm、チアミン−塩酸100μg/（pH7.6）］
1000mlに懸濁後、該懸濁後を２容通気撹拌槽に仕込
み、これに更にエタノール20ml及びα−ケト酪酸ナトリ
ウム0.1％を添加して、回転数300rpm、溶存酸素濃度0.1
ppmになるように通気して温度33℃、pH7.6（25％アンモ
ニア水にて調節）にて本能を開始した。反応液中のα−
ケト酪酸の濃度が20mMを越えないように又は30mMを越え
ないようにα−ケト酪酸を添加する２つの場合について
全量80mMになるように添加しながら20時間反応を行っ
た。反応終了後、遠心分離（4000rpm、15分間、４℃）
にて除菌した上清液中のノルバリン及びＬ−イソロイシ
ンを定量した。

なお、比較例として、α−ケト酪酸を反応開始時に一
括して80mM添加して反応を行った。

結果を下記第１表に示す。

実施例２実施例１と同様の条件にて、ブレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233−AB−41（微
工研条寄第1498号）を培養し、また実施例１と同様の条
件にて反応させた後、上清液中のノルバリン及びＬ−イ
ソロイシンを定量した。結果を下記第２表に示す。

実施例３実施例１と同様の条件にて、ブレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233−ABT−11
（微工研条寄第1500号）を培養し、また実施例１と同様
の条件にて反応させた後、上清液中のノルバリン及びＬ
−イソロイシンを定量した。結果を下記第３表に示す。

実施例４実施例１と同様の条件にて、ブレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233−ABD−21
（微工研条寄第1499号）を培養し、また実施例１と同様
の条件にて反応させた後、上清液中のノルバリン及びＬ
−イソロイシンを定量した。結果を下記第４表に示す。

フロントページの続き (72)発明者四方和通茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号三菱油化株式会社中央研究所内 (72)発明者山縣恒茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号三菱油化株式会社中央研究所内 (72)発明者湯川英明茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号三菱油化株式会社中央研究所内

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】コリネ型細菌に属するビオチン要求性微生
物の菌体またはその処理物の存在下にα−ケト酪酸又は
その塩を水性エタノール溶液中で酵素反応せしめてＬ−
イソロイシンを製造するに当り、α−ケト酪酸又はその
塩を水性エタノール溶液中におけるその濃度が30mMを越
えないように添加することを特徴とするＬ−イソロイシ
ンの製造方法。
【請求項２】微生物がブレビバクテリウム・フラバム
（Brevibacterium flavum）MJ233、同MJ233−AB−41、
同MJ233−ABT−11又は同MJ233−ABD−21である特許請求
の範囲第１項記載の方法。