JP2516625B2 - Ｌ−スレオニンの製造法 - Google Patents
Ｌ−スレオニンの製造法Info
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- JP2516625B2 JP2516625B2 JP62097868A JP9786887A JP2516625B2 JP 2516625 B2 JP2516625 B2 JP 2516625B2 JP 62097868 A JP62097868 A JP 62097868A JP 9786887 A JP9786887 A JP 9786887A JP 2516625 B2 JP2516625 B2 JP 2516625B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、Ｌ−スレオニンの製造法に関するものであ
る。
る。
本発明によればＬ−もしくはDL−ホモセリンから、更
にはＤ−もしくはDL−ホモセリンから効率よくＬ−スレ
オニンを製造することができる。
にはＤ−もしくはDL−ホモセリンから効率よくＬ−スレ
オニンを製造することができる。
Ｌ−スレオニンは、必須アミノ酸として人間および動
物の栄養上重要な役割をするアミノ酸であり、医療、食
品、飼料強化剤としてその需要が近年急激に増加しつつ
ある。
物の栄養上重要な役割をするアミノ酸であり、医療、食
品、飼料強化剤としてその需要が近年急激に増加しつつ
ある。
先行技術 Ｌ−スレオニンの工業的製造法としては、他のアミノ
酸の場合と同様に立体異性体が存在する為、化学合成で
はＬ体のみの製造は困難であり、主に発酵法により生産
が行われている。発酵法により製造する方法としてはア
ミノ酸要求株を用いる方法（特公昭46-3319号、同46-34
193号、同46-34194号公報等）、また前駆体発酵法によ
る製造法としては、ホモセリンを前駆体とする製造法
（特公昭36-2896号、同38-6590号、同43-8715号公報
等）等が挙げられる。
酸の場合と同様に立体異性体が存在する為、化学合成で
はＬ体のみの製造は困難であり、主に発酵法により生産
が行われている。発酵法により製造する方法としてはア
ミノ酸要求株を用いる方法（特公昭46-3319号、同46-34
193号、同46-34194号公報等）、また前駆体発酵法によ
る製造法としては、ホモセリンを前駆体とする製造法
（特公昭36-2896号、同38-6590号、同43-8715号公報
等）等が挙げられる。
また、発酵法よりも固定費等が安く、生産管理がより
容易な酵素法による製造法には、グリシンとアセトアル
デヒドを前駆体とする方法（特開昭56-121491号、同58-
116681号各公報等）などが提案されているが、これらは
アロ体のスレオニンの副生があり実用的な方法とはなつ
ていない。
容易な酵素法による製造法には、グリシンとアセトアル
デヒドを前駆体とする方法（特開昭56-121491号、同58-
116681号各公報等）などが提案されているが、これらは
アロ体のスレオニンの副生があり実用的な方法とはなつ
ていない。
この他にも酵素法による製造法には、各種の微生物菌
体を用いてDL−ホモセリンを存在させた反応液にて、Ｌ
−スレオニンを生成させることが報告されている。（Am
ino Acids、第１号、P71〜74（1959））。しかしなが
ら、これら公知の方法では、Ｌ−スレオニンの生成量は
未だ十分ではない状況にあつた。
体を用いてDL−ホモセリンを存在させた反応液にて、Ｌ
−スレオニンを生成させることが報告されている。（Am
ino Acids、第１号、P71〜74（1959））。しかしなが
ら、これら公知の方法では、Ｌ−スレオニンの生成量は
未だ十分ではない状況にあつた。
一方、DL−ホモセリンを前駆体とする実用上の研究は
それ以後殆んど報告されていない。この理由としては、
ホモセリンはDL体として化学合成で比較的安価に合成さ
れるものの、Ｌ−スレオニンの生成はＬ−ホモセリンか
らのみでＤ−ホモセリンからは認められない（Amino Ac
ids、第１号、P71〜74（1959））ことから製造費がきわ
めて割高となることが挙げられる。
それ以後殆んど報告されていない。この理由としては、
ホモセリンはDL体として化学合成で比較的安価に合成さ
れるものの、Ｌ−スレオニンの生成はＬ−ホモセリンか
らのみでＤ−ホモセリンからは認められない（Amino Ac
ids、第１号、P71〜74（1959））ことから製造費がきわ
めて割高となることが挙げられる。
発明の要旨 本発明者らは、上記課題を解決すべくＬ−又はDL−ホ
モセリン、更にはＤ−又はDL−ホモセリンを主原料と
し、酵素的製法によるＬ−スレオニンの製造法につき鋭
意検討を行い本発明を完成した。
モセリン、更にはＤ−又はDL−ホモセリンを主原料と
し、酵素的製法によるＬ−スレオニンの製造法につき鋭
意検討を行い本発明を完成した。
即ち、本発明は、微生物菌体の存在下、Ｌ−又はDL−
ホモセリンを水溶液中で酵素反応させ、該溶液中にＬ−
スレオニンを生成せしめ、これからＬ−スレオニンを採
取する方法において、微生物菌体がビオチン要求性のブ
レビバクテリウム（Brevibacterium）属に属するもので
あることを特徴とするＬ−スレオニンの製造法を提供す
るものである。
ホモセリンを水溶液中で酵素反応させ、該溶液中にＬ−
スレオニンを生成せしめ、これからＬ−スレオニンを採
取する方法において、微生物菌体がビオチン要求性のブ
レビバクテリウム（Brevibacterium）属に属するもので
あることを特徴とするＬ−スレオニンの製造法を提供す
るものである。
発明の効果 本発明の方法によれば、Ｌ−スレオニンが高収量で製
造できる。又、エタノール及び／又はグルコースを含む
完全合成培地を酵素反応の水溶液として使用した場合に
は、Ｌ−スレオニンがさらに高収量に製造でき、発酵法
の様な培地の滅菌等の煩雑な操作が必要でなく、生産管
理が極めて容易となる。
造できる。又、エタノール及び／又はグルコースを含む
完全合成培地を酵素反応の水溶液として使用した場合に
は、Ｌ−スレオニンがさらに高収量に製造でき、発酵法
の様な培地の滅菌等の煩雑な操作が必要でなく、生産管
理が極めて容易となる。
更に、Ｄ−又はDL−ホモセリンをラセミ化酵素の存在
下でラセミ化させて得られるＬ−又はDL−ホモセリン
を、そのまま本発明の方法に用いた場合には、ビオチン
要求性のブレビバクテリウム属に属する微生物菌体と、
ラセミ化酵酸とが相互に全く悪影響を及ぼさないで、ま
た目的物であるＬ−スレオニンに対しても全く悪影響を
与えることなく、工業的に安価に入手可能なDL−ホモセ
リン又はＤ−ホモセリンから極めて高い生産性で効率よ
くＬ−スレオニンが製造できる。
下でラセミ化させて得られるＬ−又はDL−ホモセリン
を、そのまま本発明の方法に用いた場合には、ビオチン
要求性のブレビバクテリウム属に属する微生物菌体と、
ラセミ化酵酸とが相互に全く悪影響を及ぼさないで、ま
た目的物であるＬ−スレオニンに対しても全く悪影響を
与えることなく、工業的に安価に入手可能なDL−ホモセ
リン又はＤ−ホモセリンから極めて高い生産性で効率よ
くＬ−スレオニンが製造できる。
発明の具体的説明 本発明に使用されるビオチン要求性のブレビバクテリ
ウム（Brevibacterium）属に属する微生物菌体として
は、以下の様なものがあり、Ｌ−スレオニン生産菌が含
まれる。
ウム（Brevibacterium）属に属する微生物菌体として
は、以下の様なものがあり、Ｌ−スレオニン生産菌が含
まれる。
エタノール資化性のもの、例えばブレビバクテリウム
・フラバム（Brevibacterium flavum）MJ-233（FERM BP
-1497）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacter
ium flavum）MJ-233-AB-41（FERM BP-1498）、ブレビバ
クテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）MJ-23
3-ABT-11（FERM BP-1500）及びブレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum）MJ-233-ABD-21（FERM
BP-1499）等がある。これらの他にもブレビバクテリウ
ム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagene
s）ATCC 6871、同13745、同13746、ブレビバクテリウム
・デバリカタム（Brevibacterium divaricatum）ATCC 1
4020等が例示できる。
・フラバム（Brevibacterium flavum）MJ-233（FERM BP
-1497）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacter
ium flavum）MJ-233-AB-41（FERM BP-1498）、ブレビバ
クテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）MJ-23
3-ABT-11（FERM BP-1500）及びブレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum）MJ-233-ABD-21（FERM
BP-1499）等がある。これらの他にもブレビバクテリウ
ム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagene
s）ATCC 6871、同13745、同13746、ブレビバクテリウム
・デバリカタム（Brevibacterium divaricatum）ATCC 1
4020等が例示できる。
これらの微生物菌体の中でもエタノール資化性のもの
が好ましく、特にブレビバクテリウム・フラバム MJ-23
3、ブレビバクテリウム・フラバム MJ-233-AB-41、ブレ
ビバクテリウム・フラバム MJ-233-ABT-11、ブレビバク
テリウム・フラバム MJ-233-ABD-21が好ましい。
が好ましく、特にブレビバクテリウム・フラバム MJ-23
3、ブレビバクテリウム・フラバム MJ-233-AB-41、ブレ
ビバクテリウム・フラバム MJ-233-ABT-11、ブレビバク
テリウム・フラバム MJ-233-ABD-21が好ましい。
なお、上記の（FERM BP-1498）は（FERM BP-1497）を
親株としてDL−α−アミノ酪酸耐性を積極的に付与され
たエタノール資化性微生物である（特公昭59-28398号公
報３〜４欄参照）。（FERM BP-1500）は、（FERM BP-14
97）を親株としたＬ−α−アミノ酪酸トランスアミナー
ゼ高活性変異株である（特願昭60-190609号明細書３〜
５頁参照）。また、（FERM BP-1499）は（FERM BP-149
7、特公昭57-26755号公報参照）を親株としたＤ−α−
アミノ酪酸デアミナーゼ高活性変異株である（特開昭61
-176607号公報参照）。
親株としてDL−α−アミノ酪酸耐性を積極的に付与され
たエタノール資化性微生物である（特公昭59-28398号公
報３〜４欄参照）。（FERM BP-1500）は、（FERM BP-14
97）を親株としたＬ−α−アミノ酪酸トランスアミナー
ゼ高活性変異株である（特願昭60-190609号明細書３〜
５頁参照）。また、（FERM BP-1499）は（FERM BP-149
7、特公昭57-26755号公報参照）を親株としたＤ−α−
アミノ酪酸デアミナーゼ高活性変異株である（特開昭61
-176607号公報参照）。
本発明における上記「微生物菌体」には、その固定化
物を含むものとする。ここで「固定化」は、該微生物菌
体を公知の固定化法、例えばアクリルアミド、アルギン
酸塩、カラギーナン等による包括法、DEAE−セフアデツ
クス、DEAE−セルロース等によるイオン結合法などから
適宜選択して行える。
物を含むものとする。ここで「固定化」は、該微生物菌
体を公知の固定化法、例えばアクリルアミド、アルギン
酸塩、カラギーナン等による包括法、DEAE−セフアデツ
クス、DEAE−セルロース等によるイオン結合法などから
適宜選択して行える。
本発明の方法は、水溶液中で行われる。この水溶液と
しては、水あるいはリン酸又はトリス塩酸等の緩衝液が
用いられるが、更に好ましくは炭素源としてエタノール
及び／又はグルコースを含む完全合成培地が用いられ
る。
しては、水あるいはリン酸又はトリス塩酸等の緩衝液が
用いられるが、更に好ましくは炭素源としてエタノール
及び／又はグルコースを含む完全合成培地が用いられ
る。
この完全合成培地は、窒素源、無機塩等を主成分とし
て含有する公知のものが用いられる。ここで窒素源とし
ては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、尿素等が例示でき、無機塩とし
ては、リン酸−水素カリウム、リン酸二水素カリウム、
硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン等が例示でき
る。
て含有する公知のものが用いられる。ここで窒素源とし
ては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、尿素等が例示でき、無機塩とし
ては、リン酸−水素カリウム、リン酸二水素カリウム、
硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン等が例示でき
る。
上記完全合成培地に添加されるエタノール及び／又は
グルコースの濃度は、エタノールでは１〜20容量％グル
コースでは0.5〜2.0重量％であり、エタノールとグルコ
ース併用の場合は前記範囲内でそれぞれ用いられる。
グルコースの濃度は、エタノールでは１〜20容量％グル
コースでは0.5〜2.0重量％であり、エタノールとグルコ
ース併用の場合は前記範囲内でそれぞれ用いられる。
Ｌ−又はDL−ホモセリンの反応時の濃度は、一般には
0.1〜20％（wt/vol）の濃度範囲で使用するのが適当で
ある。又、該菌体の使用量も特に制限されるものではな
いが、一般に１〜50％（wt/vol）の濃度で使用すること
が出来る。
0.1〜20％（wt/vol）の濃度範囲で使用するのが適当で
ある。又、該菌体の使用量も特に制限されるものではな
いが、一般に１〜50％（wt/vol）の濃度で使用すること
が出来る。
酵素反応は、約20〜50℃、好ましくは約30〜約40℃の
温度で、通常約10〜約72時間行われる。
温度で、通常約10〜約72時間行われる。
本発明の方法においては、工業的に安価に供給可能な
DL−ホモセリン又は、酵素反応で未反応物として残るＤ
−ホモセリン又はＤ−ホモセリンが高含量であるDL−ホ
モセリンを、Ｌ−スレオニンを基質とせずＤ−ホモセリ
ンをラセミ化する能力を有する微生物、その処理物又は
それらの固定化物の存在下にラセミ化したものを使用す
るのが有利であり、好ましいものである。
DL−ホモセリン又は、酵素反応で未反応物として残るＤ
−ホモセリン又はＤ−ホモセリンが高含量であるDL−ホ
モセリンを、Ｌ−スレオニンを基質とせずＤ−ホモセリ
ンをラセミ化する能力を有する微生物、その処理物又は
それらの固定化物の存在下にラセミ化したものを使用す
るのが有利であり、好ましいものである。
このＬ−スレオニンを基質とせずＤ−ホモセリンをラ
セミ化する能力を有する微生物としては、例えばシュー
ドモナス・プチダ（Pseudomonas Putida）IFO12996等が
ある。
セミ化する能力を有する微生物としては、例えばシュー
ドモナス・プチダ（Pseudomonas Putida）IFO12996等が
ある。
上記Ｄ−ホモセリンをラセミ化する能力を有する微生
物等は、本発明における酵素反応系に初めから添加され
ていてもよいが、酵素反応の途中に添加することも、又
該酵素反応系とは別の反応系でラセミ化反応をさせるの
に用いることもできる。
物等は、本発明における酵素反応系に初めから添加され
ていてもよいが、酵素反応の途中に添加することも、又
該酵素反応系とは別の反応系でラセミ化反応をさせるの
に用いることもできる。
この様なＤ−ホモセリンをラセミ化する能力を有する
微生物、その処理物又はそれらの固定化物の使用量は、
0.1〜5.0重量％、好ましくは１〜30重量％程度である。
微生物、その処理物又はそれらの固定化物の使用量は、
0.1〜5.0重量％、好ましくは１〜30重量％程度である。
上記のような反応方法によつて得られる反応液中に生
成したＬ−スレオニンの分離・精製は、イオン交換樹脂
処理法あるいは、沈澱法等により容易に行うことができ
る。
成したＬ−スレオニンの分離・精製は、イオン交換樹脂
処理法あるいは、沈澱法等により容易に行うことができ
る。
本発明に用いられる２種の微生物、即ち、ホモセリン
からＬ−スレオニンを生成する能力を有する微生物、お
よびＬ−スレオニンを基質とせずＤ−ホモセリンのみを
ラセミ化する能力を有する微生物の調整法を以下に述べ
る。
からＬ−スレオニンを生成する能力を有する微生物、お
よびＬ−スレオニンを基質とせずＤ−ホモセリンのみを
ラセミ化する能力を有する微生物の調整法を以下に述べ
る。
炭素源としては例えばグルコース、エタノール、メタ
ノール、廃糖蜜等が、窒素源としてはアンモニア、硫酸
アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、
尿素等がそれぞれ単独もしくは混合して用いることが出
来る。
ノール、廃糖蜜等が、窒素源としてはアンモニア、硫酸
アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、
尿素等がそれぞれ単独もしくは混合して用いることが出
来る。
無機塩としては、リン酸−水素カリウム、リン酸二水
素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他
にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープ
リカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄
養素を培地に添加して用いることが出来る。
素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他
にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープ
リカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄
養素を培地に添加して用いることが出来る。
培養は通気攪拌、振とう等の好気的条件下で行ない、
培養温度は20〜40℃、好ましくは25〜35℃で行なう。培
養途中のpHは５〜10、好ましくは７〜８付近にて行な
い、培養中のpHの調整には酸、アルカリを添加して行な
うことができる。
培養温度は20〜40℃、好ましくは25〜35℃で行なう。培
養途中のpHは５〜10、好ましくは７〜８付近にて行な
い、培養中のpHの調整には酸、アルカリを添加して行な
うことができる。
培養開始時のエタノール濃度は、好ましくは１〜５容
量％、更に好ましくは２〜３容量％である。培養期間は
２〜９日間、最適期間は４〜７日間である。
量％、更に好ましくは２〜３容量％である。培養期間は
２〜９日間、最適期間は４〜７日間である。
この様にして得られた培養物から菌体を集めて、水又
は適当な緩衝液で洗浄し、その洗浄菌体を本発明の酵素
反応に使用する。
は適当な緩衝液で洗浄し、その洗浄菌体を本発明の酵素
反応に使用する。
実験例 以下の実施例において、Ｌ−スレオニンの定性は、ペ
ーパークロマトグラフのRf値、電気泳動法の移動度、微
生物定量法による生物活性値により確認した。定量はロ
イコノストツク・メセンテロイデス（Leuconostoc mese
nteroides）ATCC8042を用いるマイクロバイオアツセイ
法と高速液体クロマトグラフイー（島津LC-5A）とを併
用して行つた。また、下記の実施例において％と表した
のは重量％を意味する。
ーパークロマトグラフのRf値、電気泳動法の移動度、微
生物定量法による生物活性値により確認した。定量はロ
イコノストツク・メセンテロイデス（Leuconostoc mese
nteroides）ATCC8042を用いるマイクロバイオアツセイ
法と高速液体クロマトグラフイー（島津LC-5A）とを併
用して行つた。また、下記の実施例において％と表した
のは重量％を意味する。
実施例１ 培地（尿素0.4％、硫酸アンモニウム1.4％、KH2PO40.
5％、K2HPO40.05％、MgSO4・７H2O0.05％、CaCl2・２H2
O2ppm、FeSO4・７H2O2ppm、MnSO4・４〜６H2O2ppm、ZnS
O4・７H2O2ppm、NaCl2ppm、ビオチン200μg/l、チアミ
ン・HCl 100μg/l、カザミノ酸0.1％、酵母エキス0.1
％）100mlを500ml容三角フラスコに分注、滅菌（滅菌後
pH7.0）した後ブレビバクテリウム・フラバム（Breviba
cterium flavum）MJ-233（FERM BP-1497）を植菌し、無
菌的にエタノールを2ml加え、30℃にて２日間振盪培養
を行つた。
5％、K2HPO40.05％、MgSO4・７H2O0.05％、CaCl2・２H2
O2ppm、FeSO4・７H2O2ppm、MnSO4・４〜６H2O2ppm、ZnS
O4・７H2O2ppm、NaCl2ppm、ビオチン200μg/l、チアミ
ン・HCl 100μg/l、カザミノ酸0.1％、酵母エキス0.1
％）100mlを500ml容三角フラスコに分注、滅菌（滅菌後
pH7.0）した後ブレビバクテリウム・フラバム（Breviba
cterium flavum）MJ-233（FERM BP-1497）を植菌し、無
菌的にエタノールを2ml加え、30℃にて２日間振盪培養
を行つた。
次に、本培養培地（硫酸アンモニウム2.3％、KH2PO
40.05％、K2HPO40.05％、MgSO4・７H2O0.05％、FeSO4・
７H2O20ppm、MnSO4・ｎH2O20ppm、ビオチン200μg/l、
チアミン・HCl 100μg/l、カザミノ酸0.3％、酵母エキ
ス0.3％）の1000mlを2l容通気攪拌槽に仕込み、滅菌（1
20℃、20分間）後、エタノールの20mlと前記前培養物の
20mlを添加して、回転数1000rpm、通気量1vvm、温度33
℃pH7.6にて48時間培養を行つた。
40.05％、K2HPO40.05％、MgSO4・７H2O0.05％、FeSO4・
７H2O20ppm、MnSO4・ｎH2O20ppm、ビオチン200μg/l、
チアミン・HCl 100μg/l、カザミノ酸0.3％、酵母エキ
ス0.3％）の1000mlを2l容通気攪拌槽に仕込み、滅菌（1
20℃、20分間）後、エタノールの20mlと前記前培養物の
20mlを添加して、回転数1000rpm、通気量1vvm、温度33
℃pH7.6にて48時間培養を行つた。
尚、エタノールは、培養中培地の濃度が２容量％を越
えないように、約１〜２時間ごと断続的に添加した。
えないように、約１〜２時間ごと断続的に添加した。
培養終了後、培養物300mlから遠心分離にて集菌後、
脱塩蒸留水にて２度洗浄した菌体を反応液〔（NH4)2S
O4、2g/l:KH2PO4、0.5g/l:KH2PO4、0.5g/l:MgSO4・７H2
O、0.5g/l:FeSO4・７H2O、20ppm:MnSO4・４〜６H2O、20
ppm:Thiamine-HCl 100μｇ、DL−ホモセリン2g/l（pH7.
6）〕の1000mlに懸濁後、該懸濁液を2l容通気攪拌槽に
仕込み、エタノール20mlを添加して、回転数300rpm、通
気量0.1vvm、温度37℃、pH7.0にて10時間反応を行つ
た。
脱塩蒸留水にて２度洗浄した菌体を反応液〔（NH4)2S
O4、2g/l:KH2PO4、0.5g/l:KH2PO4、0.5g/l:MgSO4・７H2
O、0.5g/l:FeSO4・７H2O、20ppm:MnSO4・４〜６H2O、20
ppm:Thiamine-HCl 100μｇ、DL−ホモセリン2g/l（pH7.
6）〕の1000mlに懸濁後、該懸濁液を2l容通気攪拌槽に
仕込み、エタノール20mlを添加して、回転数300rpm、通
気量0.1vvm、温度37℃、pH7.0にて10時間反応を行つ
た。
反応終了後、遠心分離（4000rpm、15分間、４℃）に
て除菌した上清液中のＬ−スレオニンを定量した。ま
た、反応終了後の培養液500mlを、強酸性陽イオン交換
樹脂（H+型）のカラムに通してＬ−スレオニンを吸着さ
せ、水洗後、0.5Nアンモニア水で溶出させたのち、Ｌ−
スレオニン画分を濃縮し、冷エタノールでＬ−スレオニ
ンの結晶を析出させた。結果を後に掲げる第１表に示し
た。
て除菌した上清液中のＬ−スレオニンを定量した。ま
た、反応終了後の培養液500mlを、強酸性陽イオン交換
樹脂（H+型）のカラムに通してＬ−スレオニンを吸着さ
せ、水洗後、0.5Nアンモニア水で溶出させたのち、Ｌ−
スレオニン画分を濃縮し、冷エタノールでＬ−スレオニ
ンの結晶を析出させた。結果を後に掲げる第１表に示し
た。
尚、反応液にビオチンを200μg/lの濃度で添加して反
応に用いた以外は、上記と同様に実験を行つたところ、
Ｌ−スレオニンの生成量は、180mg/lであつた。
応に用いた以外は、上記と同様に実験を行つたところ、
Ｌ−スレオニンの生成量は、180mg/lであつた。
実施例２ 実施例１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フラ
バム（Brevibacterium flavum）MJ-233-AB-41（FERM BP
-1498）を培養し、また実施例１と同様の条件にて反応
させた後上清液中のＬ−スレオニンを定着した。また、
実施例１と同様にしてＬ−スレオニンの結晶を析出させ
た。結果は第２表に示した。
バム（Brevibacterium flavum）MJ-233-AB-41（FERM BP
-1498）を培養し、また実施例１と同様の条件にて反応
させた後上清液中のＬ−スレオニンを定着した。また、
実施例１と同様にしてＬ−スレオニンの結晶を析出させ
た。結果は第２表に示した。
実施例３ 実施例１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フラ
バム（Brevibacterium flavum）MJ-233-ABT-11（FERM B
P-1500）を培養し、また実施例１と同様の条件にて反応
させた後上清液中のＬ−スレオニンを定量した。また、
実施例１と同様にしてＬ−スレオニンの結晶を析出させ
た。結果は第３表に示した。
バム（Brevibacterium flavum）MJ-233-ABT-11（FERM B
P-1500）を培養し、また実施例１と同様の条件にて反応
させた後上清液中のＬ−スレオニンを定量した。また、
実施例１と同様にしてＬ−スレオニンの結晶を析出させ
た。結果は第３表に示した。
実施例４ 実施例１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フラ
バム（Brevibacterium flavum）MJ-233-ABD-21（FERM B
P-1499）を培養し、また実施例１と同様の条件にて反応
させた後上清液中のＬ−スレオニンを定量した。また、
実施例１と同様にしてＬ−スレオニンの結晶を析出させ
た。結果は第４表に示した。
バム（Brevibacterium flavum）MJ-233-ABD-21（FERM B
P-1499）を培養し、また実施例１と同様の条件にて反応
させた後上清液中のＬ−スレオニンを定量した。また、
実施例１と同様にしてＬ−スレオニンの結晶を析出させ
た。結果は第４表に示した。
実施例５ 実施例１で反応時に添加するエタノールをグルコース
に変えた以外は実施例１と同様の操作を実施した。尚、
グルコース濃度は、２重量％とした。反応終了後の上清
液中のＬ−スレオニン生成量および精製量を第５表に示
した。
に変えた以外は実施例１と同様の操作を実施した。尚、
グルコース濃度は、２重量％とした。反応終了後の上清
液中のＬ−スレオニン生成量および精製量を第５表に示
した。
尚、反応液にビオチンを200μg/lの濃度で添加して反
応に用いた以外は、上記と同様に実験を行つたところ、
Ｌ−スレオニンの生成量は185mg/lであつた。
応に用いた以外は、上記と同様に実験を行つたところ、
Ｌ−スレオニンの生成量は185mg/lであつた。
参考例１（Ｄ−ホモセリンラセミ化酵素の調製） 下記培地組成Ａの培地100mlを500ml容三角フラスコに
分注して120℃、15分間滅菌処理したものに、シュード
モナス・ブチダIFO12996を一白金耳量接種し、30℃にて
24時間振とう培養（前培養とする）後、上記と同じ培地
組成Ａの培地１を5l容三角フラスコに分注し、120℃
で15分間滅菌処理したものに上記前培養物の20mlを接種
したものを更に30℃にて24時間振とう培養した。
分注して120℃、15分間滅菌処理したものに、シュード
モナス・ブチダIFO12996を一白金耳量接種し、30℃にて
24時間振とう培養（前培養とする）後、上記と同じ培地
組成Ａの培地１を5l容三角フラスコに分注し、120℃
で15分間滅菌処理したものに上記前培養物の20mlを接種
したものを更に30℃にて24時間振とう培養した。
培養終了後１を遠心分離し菌体を集め、これを純水
に懸濁せしめて20mlとし、これに4.2gのアクリルアミ
ド、0.28gのN,N′−メチレン−ビス−アクリルアミド、
４％β−（ジメチルアミノ）−プロピオニトリル3mlお
よび２％過塩素酸カリウム2mlを加えて、室温にて15分
間静置して反応させて菌体を保有する重合物を得た。次
いでこの重合物である反応生成物を粉砕し、純水で洗浄
することにより固定化菌体30gを得、これをＤ−ホモセ
リンラセミ化酵素源とした。なお、菌体の固定化操作は
すべて無菌操作で実施した。
に懸濁せしめて20mlとし、これに4.2gのアクリルアミ
ド、0.28gのN,N′−メチレン−ビス−アクリルアミド、
４％β−（ジメチルアミノ）−プロピオニトリル3mlお
よび２％過塩素酸カリウム2mlを加えて、室温にて15分
間静置して反応させて菌体を保有する重合物を得た。次
いでこの重合物である反応生成物を粉砕し、純水で洗浄
することにより固定化菌体30gを得、これをＤ−ホモセ
リンラセミ化酵素源とした。なお、菌体の固定化操作は
すべて無菌操作で実施した。
培地組成Ａ 肉エキス１％ ペプトン１％ NaCl0.5％ pH7.2 実施例６ 尿素0.4％、硫酸アンモニウム1.4％、KH2PO40.05％、
K2HPO40.05％、MgSO4・７H2O0.05％、CaCl・２H2O2pp
m、FeSO4・７H2O2ppm、MnSO4・４〜６H2O2ppm、ZnSO4・
７H2O2ppm、NaCl2ppm、ビオチン200μg/l、チアミン・H
Cl 100μg/l、カザミノ酸0.1％、酵母エキス0.1％から
なる培地50mlを500ml容三角フラスコに分注し、滅菌
（滅菌後pH7.0）した後、ブレビバクテリウム・フラバ
ムMJ-233（FERM BP-1497）を植菌し、無菌的にエタノー
ルを1.5ml加え、30℃にて３日間振とう培養を行なつ
た。培養終了後、4000rpm、15分間の遠心分離により菌
体を回収し、ホモセリンからのＬ−スレオニン生成の酵
素源とした。
K2HPO40.05％、MgSO4・７H2O0.05％、CaCl・２H2O2pp
m、FeSO4・７H2O2ppm、MnSO4・４〜６H2O2ppm、ZnSO4・
７H2O2ppm、NaCl2ppm、ビオチン200μg/l、チアミン・H
Cl 100μg/l、カザミノ酸0.1％、酵母エキス0.1％から
なる培地50mlを500ml容三角フラスコに分注し、滅菌
（滅菌後pH7.0）した後、ブレビバクテリウム・フラバ
ムMJ-233（FERM BP-1497）を植菌し、無菌的にエタノー
ルを1.5ml加え、30℃にて３日間振とう培養を行なつ
た。培養終了後、4000rpm、15分間の遠心分離により菌
体を回収し、ホモセリンからのＬ−スレオニン生成の酵
素源とした。
反応液（DL−ホモセリン1mg、ピリドキサールリン酸
５μｇリン酸緩衝液100μmoles、エタノール10mg、pH7.
0を反応液1ml中に含有）100mlにこの菌体5gおよび参考
例１で調整した固定化菌体20gを加え、37℃にて16時間
反応を行なつたところＬ−スレオニンの総生成量は60mg
であつた。
５μｇリン酸緩衝液100μmoles、エタノール10mg、pH7.
0を反応液1ml中に含有）100mlにこの菌体5gおよび参考
例１で調整した固定化菌体20gを加え、37℃にて16時間
反応を行なつたところＬ−スレオニンの総生成量は60mg
であつた。
反応液から菌体その他不純物を除いたろ液を、強酸性
陽イオン交換樹脂（H+型）のカラムに通して、Ｌ−スレ
オニンを吸着させ、水洗後、0.5Nアンモニア水で溶出し
たのち、Ｌ−スレオニン画分を凝縮し、冷エタノールで
Ｌ−スレオニンの結晶を析出させて36mgの粗結晶を得
た。なお、参考例１で調製した固定化菌体を添加しない
場合には、Ｌ−スレオニンの総生成量は28mgであつた。
陽イオン交換樹脂（H+型）のカラムに通して、Ｌ−スレ
オニンを吸着させ、水洗後、0.5Nアンモニア水で溶出し
たのち、Ｌ−スレオニン画分を凝縮し、冷エタノールで
Ｌ−スレオニンの結晶を析出させて36mgの粗結晶を得
た。なお、参考例１で調製した固定化菌体を添加しない
場合には、Ｌ−スレオニンの総生成量は28mgであつた。
実施例７ 実施例１の酵素反応に使用した反応液のDL−ホモセリ
ンをＤ−ホモセリン2g/lに変えて使用し、この反応系に
さらに参考例１で調製した固定化菌体10gを添加した以
外は、実施例１と同様に酵素反応を行つた。
ンをＤ−ホモセリン2g/lに変えて使用し、この反応系に
さらに参考例１で調製した固定化菌体10gを添加した以
外は、実施例１と同様に酵素反応を行つた。
反応終了後、実施例１と同様に除菌して上清液中のＬ
−スレオニンを定量したところ、42mg/lであつた。
−スレオニンを定量したところ、42mg/lであつた。
尚、Ｄ−ホモセリンをラセミ化する能力を有する参考
例１で調製した固定化菌体を添加しないこと以外は、上
記と同様の酵素反応を行つた場合には、上清液中のＬ−
スレオニンは1mg/l以下であつた。
例１で調製した固定化菌体を添加しないこと以外は、上
記と同様の酵素反応を行つた場合には、上清液中のＬ−
スレオニンは1mg/l以下であつた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:13） Ｃ１２Ｒ 1:13） (72)発明者 島津 光伸 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社中央研究所内 (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社中央研究所内
Claims (5)
- 【請求項１】微生物菌体の存在下、Ｌ−又はDL−ホモセ
リンを水溶液中で酵素反応させ、該溶液中にＬ−スレオ
ニンを生成せしめ、これからＬ−スレオニンを採取する
方法において、微生物菌体がビオチン要求性のブレビバ
クテリウム（Brevibacterium）属に属するものであるこ
とを特徴とするＬ−スレオニンの製造法。 - 【請求項２】水溶液が炭素源としてエタノール及び／又
はグルコースを含む完全合成培地である特許請求の範囲
第１項記載の製造法。 - 【請求項３】ビオチン要求性のブレビバクテリウム（Br
evibacterium）属に属する微生物菌体がエタノール資化
性のものである特許請求の範囲第１項又は第２項記載の
製造法。 - 【請求項４】ビオチン要求性のブレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum）MJ-233、ブレビバク
テリウム・フラバムMJ-233-AB-41、ブレビバクテリウム
・フラバムMJ-233-ABT-11、ブレビバクテリウム・フラ
バムMJ-233-ABD-21から選ばれるものである特許請求の
範囲第１項又は第２項記載の製造法。 - 【請求項５】Ｌ−又はDL−ホモセリンがＤ−ホモセリン
をラセミ化する酵素の存在下にＤ−又はDL−ホモセリン
をラセミ化したものである特許請求の範囲第１〜４項の
いずれかに記載の製造法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61-127776 | 1986-06-02 | ||
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Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63112992A JPS63112992A (ja) | 1988-05-18 |
| JP2516625B2 true JP2516625B2 (ja) | 1996-07-24 |
Family
ID=14968406
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5019503A (ja) |
| EP (1) | EP0248622B1 (ja) |
| JP (1) | JP2516625B2 (ja) |
| DE (1) | DE3787208T2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3888076T2 (de) * | 1987-10-15 | 1994-07-14 | Mitsubishi Petrochemical Co | Verfahren zur Herstellung von L-Threonin. |
| US5939307A (en) * | 1996-07-30 | 1999-08-17 | The Archer-Daniels-Midland Company | Strains of Escherichia coli, methods of preparing the same and use thereof in fermentation processes for l-threonine production |
| WO2011001889A1 (ja) * | 2009-06-29 | 2011-01-06 | 三菱瓦斯化学株式会社 | 光学活性α－アミノ酸のラセミ化方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR484846A (fr) * | 1916-03-07 | 1917-11-13 | Michael Holroyd Smith | Ganses ou boucles de lacage |
| GB959108A (en) * | 1960-05-27 | 1964-05-27 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | A method of producing l-threonine by fermentation |
| DE1236520B (de) * | 1965-06-11 | 1967-03-16 | Dr Habil Meinhart Hans Zenk | Verfahren zur Auftrennung von isotopmarkierten Aminosaeureazematen in ihre D- und L-Antipoden |
| FR1484846A (fr) * | 1966-05-18 | 1967-06-16 | Ajinomoto Kk | Préparation de la thréonine par fermentation |
| JPS58129990A (ja) * | 1982-01-28 | 1983-08-03 | Mitsui Toatsu Chem Inc | アミノ酸のラセミ化方法 |
-
1987
- 1987-04-21 JP JP62097868A patent/JP2516625B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-01 EP EP87304829A patent/EP0248622B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-01 DE DE87304829T patent/DE3787208T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-06-02 US US07/056,774 patent/US5019503A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5019503A (en) | 1991-05-28 |
| DE3787208D1 (de) | 1993-10-07 |
| EP0248622A2 (en) | 1987-12-09 |
| JPS63112992A (ja) | 1988-05-18 |
| EP0248622B1 (en) | 1993-09-01 |
| DE3787208T2 (de) | 1994-02-03 |
| EP0248622A3 (en) | 1988-07-27 |
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