JPH0657155B2 - Ｌ−バリンの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、Ｌ−バリンの製造法に関するものである。更
に詳しくは、ブレビバクテリウム属に属しＤＬ−α−ア
ミノ酪酸に耐性を有する微生物を好気的に培養して、そ
の培養液よりＬ−バリンを得る方法に関するものであ
る。

本発明の方法によれば、Ｌ−バリンの生成蓄積量が大巾
に向上し、高収量でＬ−バリンが製造できる。

Ｌ−バリンは必須アミノ酸として、人間及び動物の栄養
上重要な役割をするアミノ酸であり、医薬、食品、飼料
強化剤としての需要は近年急激に増加しつつある。

先行技術 Ｌ−バリンの工業的製造法としては、他のアミノ酸の場
合と同様に立体異性体が存在する為に化学合成法では、
Ｌ−体のみの製造は困難であるため、主として醗酵法に
よる生産が行なわれている。

従来、Ｌ−バリンの醗酵による製造法としては各種知ら
れており、醗酵菌として栄養要求変異株を用いる方法
（特公昭３７−１６９２、同３７−１２４４８、同４２
−５１３、同４３−１１７５６、同５１−３３９９６、
同５２−１１６、同５３−２５０３４、同５８−３２５
９４、特開昭４９−１１６２９３各号公報等）、培地に
金属イオンを添加する方法（特公昭３８−２５２８４、
同３８−２５２８６、同４０−４０４０、同４２−５１
３各号公報等）、プリン又はピリミジン誘導体を添加す
る方法（特公昭４０−１９９１号公報）、カルボン酸エ
ステルを添加する方法（特公昭４３−１１７５４号公
報）、バルビツール酸、２ーチオバルビツール酸（特公
昭４３−１１７５５号公報）を添加する方法、界面活性
剤（特公昭４１−２１７５２号公報等）を添加する方
法、アクリル酸（特公昭４３−１３６７８号公報）を添
加する方法、有機酸（特公昭４７−２３０３５、同５１
−４６８３６、特開昭４９−５０１８５各号公報）を添
加する方法等がある。

しかしながら、公知のＬ−バリン直接醗酵菌である各種
栄養要求性変異株ではＬ−バリンの蓄積に限界があるこ
とから、新たな観点でＬ−バリンの蓄積生成蓄積せしめ
る方法の提供が求められていた。

発明の要旨 本発明は、ブレビバクテリウム属に属し、ＤＬ−α−ア
ミノ酪酸に耐性を有する微生物を、栄養培地に好気的に
培養し培養液中にＬ−バリンを生成蓄積せしめ、この培
養液よりＬ−バリンを採取するものである、醗酵法によ
るＬ−バリンの製造法を提供するものである。

発明の効果 本発明の方法によれば、栄養培地中に従来になく著量の
Ｌ−バリンを生成蓄積できる。この為、Ｌ−バリンが安
価な原料で工業的に有利な収量高く製造することができ
る。

発明の具体的説明 従来、α−アミノ酪酸耐性を有する変異株を用いての醗
酵法によるＬ−バリンの製造法は、セラチア・マルセエ
センス（特公昭４８−２４２７４号公報）、プロテウス
・レトゲリ属菌株（特開昭５９−１４３５９５号公報）
によるものがあるが、ブレビバクテリウム属に属する微
生物についてはかかる知見は全く知られていない。

本発明において用いられるブレビバクテリウム属に属し
ＤＬ−α−アミノ酪酸に耐性を有する微生物は、ブレビ
バクテリウムに属する微生物を次の操作により耐性変異
性とすることができる。

即ち、紫外線照射、あるいは化学的薬剤（例えばＮ−メ
チル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等）処理
により該Ｌ−バリン生産菌株に変異を誘起せしめた後、
この菌懸濁液をα−アミノ酪酸１０mg／ｍ含有する平
板培地〔尿素０．２％、硫安０．７％、KH₂PO₄０．０５
％、K₂HPO₄０．０５％、MgSO₄・7H₂O０．０５％、NaCl２
mg／、CaCl₂・2H₂O２mg／、FeSO₄・7H₂O２mg／、Mn
SO₄・4〜6H₂O、ZnSO₄・7H₂O２mg／、ビオチン２００μｇ
／、チアミン塩酸塩１００μｇ／、ＤＬ−α−アミ
ノ酪酸１．０％、寒天２．０％、エタノール２容量％
（滅菌後添加）〕に、３０℃にて数日間培養し生じた大
コロニーを分離することにより、耐性変異株を得る。

代表的な耐性変異株としてはブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４
９８、特公昭５９−２８３９８号参照。以下ＭＪ−２３
３−ＡＢ−４１と記す）があり、この耐性変異株は、ブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４９７、以下ＭＪ−２３３と記す）から上記手
法で誘導されたものである。

前記のＭＪ−２３３−ＡＢ−４１（ＤＬ−α−アミノ酪
酸耐性株）とその親株であるＭＪ−２３３のα−アミノ
酪酸に対する相対生育度は次の表−１の如くである。

なお本発明においてＤＬ−α−アミノ酪酸耐性株又はＤ
Ｌ−α−アミノ酪酸に耐性を有する微生物とは、ＤＬ−
α−アミノ酪酸２％添加した上記培地において、３０℃
で３日間振盪培養した時の、 が３０以上のものと定義する。（上式中のα−ＡＢはＤ
Ｌ−α−アミノ酪酸の略号である。） 本発明のＬ−バリン製造法における培養に使用する培地
組成は、炭素源及び窒素源無機塩は特に限定されない。
通常、炭素源としては主にグルコースを用い、窒素源と
してはアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、尿素を単独もしくは混合し用い
ることができる。

無機塩としては、リン酸−水素カリウム、リン酸二水素
カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他に
菌の生育及びＬ−バリンの生育に必要であれば、ペプト
ン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー、
カザミノ酸、各種ビタミン等の栄養素を培地に添加し用
いることができる。

培養は通気撹拌、振盪等の好気的条件下で行い、培養温
度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃で行う。培
養途中のpHは５〜１０、好ましくは７〜８付近にて行な
い、培養液中のpHの調製には酸、アルカリを添加して行
なう。

培養開始時のグルコース濃度は１〜５容量％、好ましく
は２〜３容量％が適する。培養期間は２〜８日、最適期
間は４〜５日である。

培養液からのＬ−バリンの回収は、培養液を遠心分離に
より、菌体の除去後、公知の手法、すなわちイオン交換
樹脂処理法あるいは、沈殿法等により容易に行なうこと
ができる。

実験例 以下の実験例においてＬ−バリンの定性は、ペーパーク
ロマトグラムのRf値、電気泳動法の易動度、微生物によ
る生物活性値により確認した。定量な、ロイコノストツ
ク・メセンテロイデスＡＴＣＣ８０４２を用いるマイク
ドバイオアツセイ法により行なつた。また％と表したの
は重量％を意味する。

実施例−１ 前培養培地（尿素０．４％、硫酸アンモニム１．４％、
K₂HPO₄０．０５％、KH₂PO₄０．０５％、MgSO₄・7H₂O０．
０５％、CaCl₂・2H₂O２ppm、FeSO₄・7H₂O２ppm、MnSO₄・
４〜６Ｈ_２Ｏ２ppm、ZnSO₄・7H₂O２ppm、NaCl２ppm、ビ
オチン２００μｇ／、チアミン・HCl１００μｇ／
、カザミノ酸０．１％、酵母エキス０．１％）１０ｍ
を２４φ大型試験管に分注、滅菌（滅菌後pH７．０）
した。これに更に別滅菌（１２０℃、１５分間）を行つ
て調製した５０％グルコース溶液０．２ｍを加えた
後、更にブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacteri
umflavum）ＭＪ−２３３−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ
−１４９８）を植菌し、３０℃にてpHを７〜７．５に調
節しつつ２日間振盪培養を行った。

次に本培養培地（尿素０．４％、硫酸アンモニム１．４
％、KH₂PO₄０．０５％、K₂HPO₄０．０５％、MgSO₄・7H₂O
０．０５％、CaCl₂・2H₂O２ppm、FeSO₄・7H₂O２ppm、MnSO
₄・４〜６Ｈ_２Ｏ２ppm、ZnSO₄・7H₂O２ppm、NaCl２ppm、
ビオチン２００μｇ／、チアミン・HCl１００μｇ／
、コーンステイーブリカー１０ｍ／）５０ｍを
５００ｍ三角フラスコに分注、滅菌した（滅菌後pH
７）。これにさらに別滅菌（１２０℃、１５分間）した
５０％グリコース溶液２ｍを添加後、前培養物の１ｍ
を植菌し、３０℃にて３日間pHを７〜７．５に調節し
つつ振盪培養を行つた。培養３日目にＬ−バリンが培養
液１当り２．０ｇ蓄積された。

培養液から菌体その他不純物を除いた液を、強酸性陽
イオン交換樹脂（Ｈ^＋型）のカラムに通してＬ−バリン
を吸着させ、水洗後、０．５規定アンモニア水で溶出し
たのち、Ｌ−バリン画分を濃縮し、冷エタノールでＬ−
バリンの結晶を析出させた。かくして培養液１当り
１．３ｇの粗結晶を得た。

なお、同条件で親株であるＭＪ−２３３を使用した場
合、培地中のＬ−バリンの蓄積は培養液１当り５０mg
以下であつた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ブレビバクテリウム属に属し、ＤＬ−α−
   アミノ酪酸に耐性を有する微生物を、栄養培地に好気的
   に培養し培養液中にＬ−バリンを生成蓄積せしめ、この
   培養液よりＬ−バリンを採取するものである、醗酵法に
   よるＬ−バリンの製造法。